《维罗尔杂志》。2000年4月；74(8): 3586–3597.
卡波西肉瘤相关疱疹病毒开放阅读框架57编码具有多种不同活性的转录后调节因子†
Howard Hughes医学研究所以及加利福尼亚大学旧金山分校微生物和医学系，加利福尼亚州旧金山，94143
*通讯作者。通讯地址：加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学院微生物与医学系，邮编：94143。电话：（415）476-2826。传真：（415）476-0939。电子邮件：ude.fscu.lgc@menag网站. 收到日期：1999年10月4日；2000年1月21日接受。
摘要
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的开放阅读框（ORF）57编码已知转录后调节因子的同源物，对其他疱疹病毒的复制至关重要。在这里，我们检查了该基因的表达及其产物的功能。KSHV ORF 57在感染1.6-kb剪接RNA时很早就表达，该剪接RNA含有多个框内起始密码子。其产物是一种核蛋白，在瞬时分析中，对由多种KSHV和异源启动子驱动的荧光素酶报告基因的表达几乎没有影响。然而，ORF 57蛋白以一种暗示转录后调节的方式增强了几种病毒转录物的积累。这些转录物不仅包括已知的细胞质mRNA（例如ORF 59），还包括缺乏编码潜力的核RNA（nut-1）。最后，ORF 57蛋白还可以调节ORF 50基因产物的作用，ORF 50是一种经典的反式激活剂，已知是裂解诱导所必需的。ORF50和ORF57的共表达可以协同增强一些（例如nut-1）但不是所有（例如tk）ORF50应答启动子的表达。这种效应不是由于ORF50表达上调，而是因为ORF50转录活性的翻译后增强。这些数据表明，ORF 57是一种强大的多效性效应器，可以作用于几个转录后水平，调节感染细胞中病毒基因的表达。
卡波西肉瘤（KS）是一种内皮细胞肿瘤，具有新生血管生成和炎症成分，是艾滋病患者常见的肿瘤。最近的证据表明，KS相关疱疹病毒（KSHV；也称为人类疱疹病毒8）与KS的发病机制密切相关(5,12; 有关评论，请参阅参考资料14和41). 在临床上明显的KS病变的几乎所有纺锤体（内皮）细胞中都发现了KSHV DNA(8,46)以及肿瘤浸润的单核细胞(6)和循环B细胞(1,27,50). KSHV与嗜淋巴γ-疱疹病毒的分类一致，也与某些B细胞淋巴瘤密切相关，称为原发性渗出性淋巴瘤(9,45). 尽管KS梭形细胞的KSHV感染主要是潜伏的，但在肿瘤中也有明显的溶解复制(28,35,36,46)越来越多的证据表明，溶解循环对肿瘤的发生起着重要作用。例如，当有KS风险的艾滋病患者接受更昔洛韦治疗时，KS的发病率大大降低，更昔洛娃是一种专门阻止溶血性病毒复制的药物(25). 此外，一些溶血循环基因产物可以刺激周围细胞和组织的炎症和血管生成反应(2,三,7). 溶血复制也被认为是KSHV从其假定的淋巴网状蓄水池传播到内皮靶点所必需的(24). 因此，研究KSHV裂解周期（以及从潜伏期到裂解生长的转变）不仅对充分描述病毒复制的分子基础很重要，而且对进一步了解KS发病机制的发展概念也很重要。
溶血性疱疹病毒复制的特点是病毒基因表达的时间调控级联。即时早期（IE）基因，其中许多编码基因表达激活物，首先被表达。它们的表达导致延迟早期（DE）基因上调，其产物包括参与病毒DNA复制的蛋白质；复制后，主要编码病毒结构蛋白的所谓晚期（L）基因被表达。在KSHV感染的B细胞中最早转录的两个基因是开放阅读框（ORF）50和ORF 57。我们(23,24)和其他(47)最近已经表明ORF 50的表达可以在感染的B细胞中触发KSHV的裂解性再激活。ORF 50是一个IE基因(53)其产品是转录激活因子(23,24,47)所有已知的化学诱导剂（例如，十四烷酰基佛波酯（TPA）和丁酸钠）都需要这种活性来激活病毒(24). 除了经典的DE目标之外(24)，ORF 50基因产物也可以上调ORF 57的启动子(23).
KSHV ORF 57与其他疱疹病毒中已知的转录后调节因子同源。其中之一，单纯疱疹病毒（HSV）的ICP27是一种多效性调节因子，其功能包括下调内含子转录物和上调某些迟发信息(40,43). 温度敏感性突变表明，ICP27对裂解病毒复制至关重要，并且是抑制宿主细胞剪接所必需的，这种活性有助于宿主关闭和瞬时分析中内含子基因的下调(17,18). ICP27还被证明可以从细胞核穿梭到细胞质，并促进无内含子病毒RNA的输出(26,32,39,44). 其他伽马病毒，EB病毒（EBV）和赛米里疱疹病毒（HSV）也编码ICP27同源物(13,21,30)虽然研究较少，但似乎也以转录后方式调节基因表达(38,42,51).
在这里，我们检测了KSHV ORF 57 mRNA在BCBL-1细胞中的精细结构和表达，BCBL-1是一种含有潜在但可诱导KSHV基因组的原发性渗出性淋巴瘤细胞系，并对其产物的活性进行了初步表征。我们的结果表明，ORF57是一种复杂的多效性效应器，可以在多个水平上作用，以增加病毒基因的表达。
材料和方法
细胞系、质粒和探针。
CV-1细胞在Dubecco改良的Eagle培养基H21（DME-H21培养基）中增殖和维持，该培养基补充有10%胎牛血清和青霉素-步霉素，37°C，5%CO2.
创建包含内含子的版本（参见图。和)前面描述的KSHV报告向量(24)，我们使用PCR从pGL2启动子载体（Promega）中扩增猴病毒40（SV40）T抗原内含子，使用以下引物（引入末端Xba公司I站点）：IN 1（5′GCGCTCTAGAGAGATTAAAGCTC）和IN 2（5′GC GCTCTACAGTCCATAGAGTTGTGT）。用切割得到的PCR片段Xba公司我克隆到Xba公司每个KSHV启动子pGL3载体的I位点位于荧光素酶编码区的3′端。nut-1报告器（pGL3 nut-1A）（见图。)由pGL3 nut-1的PCR扩增产生(24)通过使用含有Bgl公司II位点和引物5′GCGAGATCTAGCAGAGGAGTGACT。PCR扩增片段用Bgl公司II并被结扎到Bgl公司II pGL3 basic位点（Promega）。为了创建ORF57的C末端表位标记版本，我们执行了两个克隆步骤。首先，我们消化了pcDNA 3.1 ORF 57(24)带有巴姆HI和Xho公司I释放ORF 57编码区，并将该片段克隆到巴姆HI和Xho公司pcDNA 3.1-V5-His A（Invitrogen）的I位点。其次，我们用PCR扩增ORF57的3′端，不带终止密码子，以便C末端标签可以在ORF57框架中表达。使用以下引物从基因组克隆中PCR扩增ORF 57 3′端：引物57 V1（5′GCAGAGAGAGAGAGTAGCACTGATCAAAC）和引物57 V1（5′GCGGGTTCGAAAAAAAGTGGATAAAAG）。PCR片段用Nhe公司我和Sfu公司我被克隆到Nhe公司我和Sfu公司步骤1中创建的载体的I位点用于生成pcDNA ORF 57-V5。
ORF57表达对带有或不带有内含子的病毒启动子构建物的影响。用增加的pcDNA 3.1 ORF 57（0、0.3、1和3μg）和固定量的KSHV启动子荧光素酶构建物（含或不含内含子）共同转染CV-1细胞：DNA Pol、Kaposin、Nut-1和TK。转染48 h后测量荧光素酶活性。图是重复进行的实验的代表性示例。误差线表示标准偏差。
ORF 57增强了ORF 50对Nut-1启动子的作用。（A） ORF 50-ORF 57对nut1-报告者的协同作用。用一定量的nut-1启动子报告子a（无内含子）转染CV-1细胞，以及指示量的pcDNA 3 ORF 50或pcDNA 3.1 ORF 57或1μg pcDNA 3 or F 50加上指示量的pcDNA 3.1 ORF57。转染48小时后测量荧光素酶活性并绘制在图表上。误差线表示四个重复实验的标准偏差。（B） 显性负性ORF 50抑制ORF 57对ORF 50的扩增。用定量的pcDNA 3 ORF 50（1μg）、pcDNA 3.1 ORF 57（1μg）和Nut-1启动子（0.1μg）转染CV-1细胞，同时增加pCMV-myc-nuc-ΔSTAD（0、1、2和3μg）的数量(23). 转染48小时后，测量荧光素酶活性，绘制数值，表示相对于ORF 50单独的激活倍数，该数值设置为1。（C） nut-1启动子的突变破坏了ORF50和ORF57之间的协同作用。用2μg pcDNA 3 ORF 50转染CV-1细胞，增加ORF 57的数量，以及1μg野生型nut-1-706报告基因或nut-1-70%突变报告基因。转染48小时后，测量荧光素酶活性，绘制数值，表示相对于ORF 50单独的激活倍数，该数值设置为1。
内含子对ORF50-ORF57组合协同激活不同启动子的影响。CV-1细胞与固定量的KSHV启动子构建物（含或不含内含子（Nut-1、TK和Kaposin））、固定量的转录激活物pcDNA 3 ORF 50和增加量的pcDNA 3.1 ORF 57（0、0.3、1和3μg）共同转染。转染48小时后测定荧光素酶活性。（A） 对数标度图显示了带内含子和不带内含子对Nut-1启动子的影响。（B） 显示有内含子和无内含子对Kaposin和TK启动子的影响的图表。数值绘制为相对于ORF 50单独的荧光酶活性的折叠荧光素酶活性，ORF 50设置为1。表示标准偏差的误差条来自两个重复进行的实验。请注意，激活以B中的算术刻度和a中的对数刻度绘制。
ORF 59/58表达质粒（pcDNA 3.1 ORF 59/58/58）表达双顺反子ORF 59/58-信息，包括从AUG到poly（A）信号下游152个碱基的区域。以下引物通过使用来自KS肺肿瘤的λ基因组克隆作为模板的PCR扩增引入限制性内切酶位点：引物59（添加Xba公司I位点）（5′GCGCTCTAGAATGCCTGTGGATTCAC）和引物58（添加生态RV现场）（5’GCGCGATATCCCACATGCAGTTGAACTAC）。将2.4-kb PCR产物克隆到pCR2.1（Invitrogen）中。PCR产物从pCR2.1中释放出来，带有Hin公司dIII，用Klenow治疗，然后用Xba公司I.该产品被克隆到pcDNA 3.1（Invitrogen）中，该pcDNA 3.1已被英国广播公司I（去除矢量提供的poly（A）信号），用Klenow治疗，然后用Xba公司一、 创建pcDNA 3.1 ORF 59/58。为了建立ORF 59/58 Northern印迹探针，我们用生态RV释放一个500-bp的片段，跨越核苷酸（nt）94330到nt 94852。
利用以下引物对基因组λ克隆进行PCR扩增，得到nut-1表达质粒：nut-1L（5′ACTGGACTGCCCAGTC）和nut-1R（5′ATGGATTAAACATTGCCATTAT）。将所得产物克隆到pCR 2.1（Invitrogen）中，用Hin公司dIII和生态RV。结果片段被克隆到Hin公司dIII和生态pcDNA 3（Invitrogen）的RV位点产生pcDNA 3 nut-1。通过消化pcDNA 3 nut-1和生态意大利。通过以下引物对基因组lamda克隆进行PCR扩增，获得GCR和K5表达质粒，并将PCR产物克隆到PCR 3.1（Invitrogen）中：GCR，GCR1（5′CGATCGGCCGCACCTATACTTGTT）和GCR2（5′CAGCTTCACCGCGCTACTACTGGC）；以及K5、K5 1（5′CCAAGTGGTTTCAACCGT）和K5 2（5′AGCTGCAAAGTGGCGTCTA）。GCR和K5的DNA探针（ds）只包含编码序列。
要创建nut-1报告程序的截断版本，请执行以下操作：pGL3 nut-1-706、pGL3 nut-1(24)被消化了Sma公司我和第T次III后进行钝端结扎。该报告者的突变版本pGL3nut-1-706 mut是通过连接子扫描创建的，导致ORF 50响应元件被包含一个12 bp连接子的替代物Nde公司I位点和两侧的三个核苷酸。（J.Chang、D.Lukac和D.Ganem，未发表的数据）。
cDNA克隆。
从R.Renne从Lambda Zap（Stratagene）诱导的BCBL-1细胞中制备的poly（dT）引物文库中分离出含有ORF 57的cDNA克隆。使用横跨nt82839至nt83278区域的436 bp ds DNA片段进行筛选。
RNase保护和引物延伸。
根据制造商的说明，使用Ambion（德克萨斯州奥斯汀）的RPA II试剂盒进行RNase保护，并进行了以下修改。构建了以下质粒以制作用于RNase保护的单链RNA探针：400-bp千磅包含从nt 81948到nt 82346基因组序列的I基因组片段被克隆到千磅pSP72的I位点（Promega）。质粒用线性化Xba公司I和T7 RNA聚合酶在[32P] UTP产生反义探针。大约106将探针的cpm与来自未诱导或TPA诱导的BCBL-1细胞的7.5μg RNA在42℃下杂交过夜。然后用1:100稀释的kit-provided RNase a-RNase T消化样品1溶液加上1:100稀释的配套RNase T1在37°C下溶液1小时。消化后的RNA沉淀后，样品在8%变性丙烯酰胺凝胶上分离。将凝胶暴露在柯达XAR-5胶片上3天。
引物延伸基本上按照Zhong等人的描述进行(52). 简单地说，将10μg TPA诱导的BCBL-1细胞RNA与引物57 PE（5′CTCTAGGATGCCTTCATAATGTC）杂交。样品在8%变性丙烯酰胺凝胶上分离，并暴露在柯达XAR 5胶片上3天。用引物57 PE对基因组克隆进行测序后，将测序梯加载到与引物延伸产物相邻的凝胶上，以进行大小比较。
免疫荧光。
将CV-1细胞在玻璃盖玻片上镀至60%汇合处，并转染pcDNA 3.1-V5-HisA或pcDNA 3.1-V5-HisA-ORF 57（Invitrogen）。在转染脂质体（Gibco BRL）48小时后，根据制造商的说明清洗细胞，然后将其固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中新鲜的4%多聚甲醛中30分钟。清洗后，细胞在1×PBS–0.1%Triton X–0.1%柠檬酸钠中在4°C下渗透10分钟。随后，将细胞在1×PBS–1.0%Triton X–0.5%Tween–3.0%牛血清白蛋白中在室温下封闭30分钟。然后用1:300稀释的小鼠抗V5抗体（Invitrogen）孵育细胞，在室温下稀释到封闭溶液中1h，并用1×PBS洗涤三次。最后，用异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）-共轭山羊抗鼠F（ab′）孵养细胞2碎片在室温下以1:100的比例稀释1小时，然后按照上述方法清洗。
转染。
CV-1细胞在10岁时进行电镀5转染前一天，六孔组织培养皿中每孔的细胞数。在所有转染中，使用pcDNA3作为填充质粒，以在每次转染中使总DNA正常化。对于荧光素酶分析，将4至5μg总DNA稀释至100μl无血清DME-H21培养基中，并添加10μl Superfect转染试剂（Qiagen）。有关使用的效应器质粒数量，请参阅图图例。在细胞在1×PBS中清洗一次的10分钟培养后，将700μl完整培养基与DNA-Superfect培养基混合物混合，并添加到每个孔中。
培养3 h后，用1×PBS清洗细胞一次，并添加2 ml新鲜完整培养基。在48小时培养后，用1×PBS洗涤细胞两次，并刮入150μl的1×报告裂解缓冲液（Promega）中。将细胞提取物旋转30 s，并在16000×克在微型离心机中。将上清液转移到新试管中，并根据制造商的说明（Promega）通过荧光素酶分析对20μl等分样品进行分析。除非另有说明，所有荧光素酶活性图均表示至少三次实验的结果，一式两份。因为我们试图用作内部标准的所有报告员都受到ORF 57表达的影响，所以我们选择对每个实验进行多次重复，并将重复的标准偏差表示为误差线。在一些实验中，标准偏差很小，误差线不可见。
北方印迹法。
对于Northern印迹，CV-1细胞在5×105转染前一天每100毫米直径培养皿的细胞数。对于ORF 50 Northern印迹，用10μg总质粒DNA转染细胞，其中包括2.5μg pcDNA ORF 50和0、0.75、2.5或7.5μg pcDNA ORF 57。对于ORF 59/58、nut-1、GCR和K5 Northern分析，如上所述用10μg总质粒DNA转染细胞，总质粒DNA由5μg靶基因表达载体和0或1μg pcDNA 3 ORF 57组成。根据制造商的说明使用Superfect转染试剂（Qiagen）。转染48小时后，按照制造商的建议，使用RNAzol B（Tel-Test，Inc.，Friendswood，Tex）获取总RNA。总RNA（10μg）在1%琼脂糖-17%甲醛凝胶上分离，并在10×SSC（1×SSC是0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）中转移到Hybond-N膜上12 h。这些印迹是UV交联的，并与ORF 50反义核糖探针杂交（如Lukac等人[23])如Kirshner等人(19)或使用ORF 59/58、GCR、K5和nut-1的ds DNA探针（如Lagunoff等人[20]). 将斑点暴露在柯达XAR5胶片上2天。
蛋白质印迹。
对于Western blotting，如上所述转染细胞。转染48小时后，将细胞刮入10-S缓冲液(23)，在冰上培养10分钟，然后在16000×克在微型离心机中，上清液被除去。通过Bradford分析测定提取物的蛋白质浓度，并通过十二烷基硫酸钠-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（ORF 50）或十二烷基硫酸纳-12.5%聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳（or F 59/58）分离等量的蛋白质（10μg）。电泳后，按照Lukac等人的描述转移和检测蛋白质(23). ORF 59/58的一级抗体(24)以1:500的稀释度使用。
结果
KSHV ORF 57的表达。
我们之前已经证明，KSHV ORF 57是BCBL-1细胞经TPA诱导后2到4小时内表达的一个裂解基因，在ORF 50转录物出现后立即表达，但在大多数DE mRNA之前(23). 为了确定ORF 57 mRNA的精细结构，我们首先用ORF 57探针从TPA诱导的BCBL-1细胞中筛选出寡核苷酸（dT）引物cDNA文库。获得了六个克隆，没有一个是全长的。最长的（示意图如图。A） 在nt 83637处有一个3′端，在规范poly（A）信号下游29 nt处有一条5′端，而在nt 82100处则有一个5′端。该克隆的5′端有一个108 bp的内含子，具有一致的剪接供体和受体位点（图。A） ●●●●。为了定位转录起始位点，我们进行了RNase保护和引物延伸分析。用于RNase保护的反义核糖探针从第二外显子开始延伸到上游400 bp（图。A） ●●●●。在与TPA诱导或未诱导的BCBL-1细胞的RNA杂交后，用RNases A和T处理样品1在37°C下放置1小时，并在6%变性凝胶上分离。生成了两个受保护的碎片（图。B） ●●●●。这些受保护的片段在诱导通道中更为丰富，但在未诱导通道中也存在，这是因为有1-4%的BCBL-1细胞会自发复活。这些结果表明转录起始位点位于nt 82003。为了证实这些结果，我们用一个末端标记的寡核苷酸进行引物延伸，该寡核苷酸与外显子1的起始端杂交（图。A） ●●●●。将该引物退火为TPA诱导的BCBL-1细胞的RNA并用逆转录酶延伸后，检测到116 nt的单一产物（图。C） ●●●●。通过将该产物的大小与使用相同引物产生的测序阶梯进行比较，我们能够确定起始位点为nt82003。对起始位点5′区的分析揭示了转录起始位点上游24bp的TATA盒以及几个一致的转录因子结合位点（图。D） ●●●●。扫描起始位点下游的区域，发现在外显子1的框架中存在四个蛋氨酸（ATG）密码子。由于我们还不知道使用了哪些潜在的起始密码子，因此在构建ORF57表达载体时，使用了包含所有潜在起始密码子的基因组片段。尽管基因组序列最初预测ORF 57的大小为275个氨基酸（aa），但我们的cDNA克隆和转录物图谱显示，ORF 57在体内实际上具有更大的编码区（可能为456个氨基酸）。
（A） KSHV ORF 57 mRNA结构图。ORF57被剪接，并显示转录起始位点和poly（A）位置。描述了用于RNase保护的反义核糖探针的位置和产生的保护片段的大小，以及用于引物延伸的寡核苷酸。最长的cDNA克隆也显示在下面。（B） 核糖核酸酶保护以确定ORF 57 mRNA的转录起始位点。含有受保护物种的6%变性丙烯酰胺凝胶的放射自显影。来自未经处理（第5道）或经TPA处理（第6道）的BCBL-1细胞的总RNA与面板A所示的核糖探针杂交，并用RNase消化、变性和电泳。在同一凝胶上运行测序梯，并用于测定大小（通道1至4）。（C） 通过将标记的寡核苷酸（如图A所示）退火至TPA处理的BCBL-1 RNA（第5道），进行引物延伸以确认起始位点。用基因组DNA上的相同引物产生的测序阶梯在凝胶上（1到4道）进行大小比较。箭头表示延伸产物及其相应的核苷酸位置，也由左侧的星号表示。核苷酸位置符合Russo等人的序列(37). （D） 转录起始位点周围的核苷酸序列（箭头）。mRNA中第一个AUG的翻译序列显示在DNA序列下面。
ORF57蛋白的亚细胞定位。
对ORF57的预测aa序列的分析揭示了几个富含精氨酸的潜在核定位信号。为了确定ORF57的细胞定位，我们首先构建了ORF57表达载体，其表位标签（pcDNA 3.1-V5；Invitrogen）融合到C末端。在验证该表达载体产生了功能性ORF 57产物（由其与ORF 50协同作用的能力定义）（见下文）后，我们通过抗V5单克隆抗体（MAbs）的免疫荧光检测了用该构建体瞬时转染的CV-1细胞。图的左侧面板。显示转染48小时后的对照转染细胞；未见染色。当转染ORF 57表达载体时，仅在CV-1细胞的细胞核中观察到强烈染色（图。，右侧面板）。
ORF57的C末端标记版本定位于细胞核。面板显示了转染空白pcDNA 3.1-V5载体（左面板）或pcDNA 3.1-V5 ORF 57（右面板）48小时后CV-1细胞的免疫荧光染色结果。用TRITC结合的兔抗鼠抗体检测抗V5抗体（Invitrogen）的反应性。
ORF 57对KSHV基因驱动报告基因的影响。
为了开始分析ORF57的功能，我们检测了该蛋白调节由多种KSHV DE和潜在启动子驱动的荧光素酶报告基因表达的能力。测试的启动子包括来自以下KSHV基因的启动子：nut-1（也称为PAN）、tk（ORF 21）、DBP（ORF 6）、DNA聚合酶（Pol）（ORF 9）和卡波素。将CV-1细胞与pcDNA 3.1 ORF 57和报告构建体共转染，并测量萤光素酶活性。在ORF57表达载体浓度的10倍范围内检测每个靶点；大多数都没有受到影响，在没有ORF57的情况下，我们观察到的基础表达水平的影响没有超过两倍。图显示了四个启动子的代表性结果：DNA Pol、Kaposin、nut-1和tk（白色条）。一些异源启动子也以这种方式进行了检测（例如，巨细胞病毒（CMV）IE和SV40 e），结果类似（J.R.Kirshner，未发表的数据；另请参见图。). 这些数据表明ORF 57不是广谱转录激活物，如腺病毒E1A或HSV ICP0。由于HSV-1 ICP27对报告基因表达的调控受转录体中内含子的存在或缺失的影响，我们构建了这些荧光素酶报告基因的等基因、内含子版本（由DNA Pol、Kaposin、nut-1和tk的启动子驱动），并与无内含子的对应物一起进行了测试。我们使用SV40 T抗原内含子，该内含子已被证明是ICP27的调节靶点(40). 图（黑条）显示了4个构建体中每个构建体的结果，再次在共转染ORF 57质粒的10倍浓度范围内进行测试。我们发现，对于每个测试的KSHV报告者，内含子序列的存在没有一致的影响。一些结构（例如，由DNA Pol启动子驱动的结构）完全不受影响，而其他结构在选定浓度的ORF 57下表现出小（双重）效应（见图。代表性示例）。有趣的是，这一发现并不局限于SV40 T内含子：一种SV40早期启动子驱动的荧光素酶构建物，其含有一个由β-珠蛋白衍生的合成内含子，同样未能显示ORF 57的调控，其无内含子对应物也未能显示ORF57的调控（数据未显示）。此外，含有天然内含子的真正KSHV基因（ORF 50）未被ORF 57共表达下调（见下文和图。). 这些结果反驳了ORF-57编码的活性的存在，该活性在全球范围内损害剪接或积极抑制内含子基因的表达。然而，他们并不排除某些病毒基因可能对ORF57表现出内含子依赖性反应的可能性，这种现象的例子如下（见图。).
ORF 57的表达没有显著增加ORF 50 mRNA和蛋白水平。（A） 顶部为Northern blot的放射自显影图，该blot含有来自转染了固定量pcDNA 3 ORF 50和以下量pcDNA 3.1 ORF 57的CV-1细胞的总RNA：0μg（第1道）、0.75μg（第一道）、2.5μg（三道）和7.5μg（四道）。将ORF50的反义核糖探针与印迹杂交。底部，用GAPDH-特异性探针对印迹进行重制，作为负荷控制。（B） 对转染固定数量的pcDNA 3.1 ORF 50和以下数量的pcDNA3.1 ORF 57的CV-1细胞的蛋白质提取物进行Western blot分析：0μg（车道1）、0.5μg（道路2）、2.5μg（路线3）和5μg（通道4）。ORF 50蛋白用多克隆抗体检测，然后用与辣根过氧化物酶和ECL（Amersham）缀合的第二兔抗小鼠抗体检测。将每次转染的Bradford试验测定的等量提取物加载到凝胶上。
ORF 57单独能调节KSHV基因表达。
到目前为止，在人工报告构建的背景下，观察到ORF57表达本身对基因表达几乎没有影响。然而，这种嵌合报告与体内ORF57调节的天然靶点几乎没有相似之处。因此，我们转而研究含有真实病毒序列的转录单位，以更接近病毒感染中发现的靶点。在扫描可能受ORF 57调控的KSHV基因时，我们重点关注参与DNA复制的DE基因亚类，因为这些基因在两种HSV中都参与了这种调控(49)和EBV(42). ORF 59是EBV BMRF1的KSHV同源物，是一种DNA Pol辅助因子，其表达已被EBV M蛋白表达增强(42). 由于单克隆抗体对ORF59蛋白的可用性，该基因对我们的工作来说是一个特别有吸引力的靶点(24). ORF 59在带有ORF 58的非片段化双顺反子转录本中表达为5′基因，并且多聚腺苷酸化发生在3′到ORF 58(10; R.Renne和D.Ganem，未公布数据）。因此，我们克隆了跨越ORF58和59的基因组区域，包括CMV IE启动子下游的相关KSHV poly（A）信号，我们已经证明该基因不受ORF57的实质性调控（见图。). 在存在或不存在pcDNA 3.1 ORF 57的情况下，将该构建体转染到CV-1细胞中，并分别通过Northern印迹和免疫印迹测量RNA和蛋白质的水平。图A显示，在这种转染剂的全细胞提取物的总RNA中，ORF 57存在时ORF 59 mRNA的水平比没有ORF 57时高出近20倍。这种刺激也反映在ORF59蛋白的水平上（图。B） 。由于CMV启动子没有被ORF57显著上调，因此大部分上调是转录后的。当KSHV poly（A）信号被来自异源牛生长激素基因的poly（A）信号取代时，也观察到类似的诱导作用。
ORF 57增加ORF 59/58 mRNA和蛋白质水平。（A） 顶部，在存在（+）或不存在（-）0.1μg pcDNA 3.1 ORF 57的情况下，含有转染固定量pcDNA 3.1 or F 59/58的CV-1细胞总RNA的Northern blot的放射自显影图。使用针对ORF59的ds-DNA探针；底部，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）特异性探针作为负荷对照，重新检测印迹。（B） 在存在（+）或不存在（-）1μg pcDNA 3.1 ORF 57的情况下，对转染固定量pcDNA 3.1 or F 59/58的CV-1细胞的蛋白质提取物进行Western blot分析。ORF 59蛋白用KSHV单克隆抗体检测，然后用与辣根过氧化物酶和ECL（Amersham）结合的次级山羊抗鼠抗体检测。将每次转染后的Bradford试验测定的等量（10μg）提取物加载到凝胶上。
对其他早期KSHV基因的类似筛选表明，这种效应并不局限于ORF 59（图。). 一个特别有趣的例子是nut-1 RNA（图。A） ●●●●。在本实验中，携带天然poly（A）信号的全长nut-1序列被克隆到CMV启动子下游；这使得可以独立于对nut-1启动子的任何可能影响来检查ORF57对nut-2转录物的影响。在全细胞裂解物的总RNA中，观察到nut-1 RNA的积累增加了近20倍（图。A） ●●●●。然而，由CMV启动子驱动的其他KSHV转录物（例如GCR和K5）[并使用牛生长激素poly（A）信号]不受影响（图。B） ，表明ORF 57的转录后上调是转录特异性的，并证实ORF 57没有上调CMV启动子。
ORF 57表达上调nut-1 RNA积累。在存在（+）或不存在（−）1μg pcDNA 3.1 ORF 57的情况下，将指示的构建体（底部）转染到CV-1细胞中。48小时后，从全细胞裂解物中制备总RNA，通过1%琼脂糖甲醛凝胶电泳，转移到Hybond-N+膜，并杂交到针对nut-1（A）或ORF 74/GCR（B，左面板）或ORF-K5（B，右面板）的探针。每块面板下方显示了溴化乙锭污染通道中的rRNA带，作为负载控制。
ORF 57蛋白增强ORF 50活性。
在真正的KSHV感染中，ORF57没有单独表达；相反，它是与其他强大的调节蛋白一起产生的，其中最具特征的是ORF50编码的IE反式激活子。因此，我们检测了ORF 57表达在ORF 50蛋白存在或不存在的情况下对（无内含子）nut-1驱动的荧光素酶报告子的影响，我们之前已经确定ORF 50蛋白质可以强烈上调该启动子(24). 如图所示。A、 虽然ORF 57单独对nut-1促进的荧光素酶表达几乎没有影响，但正如预期的那样，ORF 50单独激活了80倍的报告基因表达。然后，我们选择了产生最大激活（1μg/转染）的ORF 50表达载体水平，并在此基础上增加了ORF 57表达载体的数量，并分析了荧光素酶的表达。ORF 57与ORF 50的结合即使是低水平的ORF 57也会导致ORF 50单独产生的表达显著上调（40到50倍）。
为了进一步研究这种协同效应的性质，我们使用了ORF 50的显性阴性突变体，称为50ΔSTAD。该突变体的转录激活域被删除，保留了二聚化能力，并被证明能特异性抑制野生型ORF 50对私有报告基因的转换能力，并诱导KSHV在BCBL-1细胞中的裂解复制(23). 在含有ORF 50、ORF 57和nut-1报告子的共转染试验中，增加ORF 50ΔSTAD表达载体的数量。图B表明，添加50ΔSTAD以剂量依赖的方式抑制ORF 50-ORF 57组合对基因表达的刺激。类似地，我们发现ORF 50-ORF 57组合对nut-1启动子的协同上调被启动子中的突变所消除，该突变会消融ORF 50的反应性。在其他地方报道的研究中，nut-1启动子的突变确定了ORF50反应性所需的一个小区域；该元件的突变不影响基础转录，但完全消除ORF 50的上调（J.Chang、D.Lukac和D.Ganem，未发表的数据）。图C表明，这种突变也会破坏ORF50和ORF57蛋白之间的协同作用。这些结果表明，ORF 50和ORF 57在这个目标上的协同作用需要ORF 50的特定转录激活活性。
两条独立的证据支持这样的观点，即ORF57并不是简单地增加ORF50反式激活因子的数量，从而进一步激活nut-1启动子。首先，观察到的ORF57效应在ORF50蛋白的饱和水平下起作用；在这些条件下，ORF50浓度的增加对反式激活没有影响（图。A） ●●●●。其次，直接检测ORF 50 mRNA和蛋白水平表明ORF 57的表达没有显著增加（图。). 用pcDNA 3 ORF 50和增加的pcDNA 3.1 ORF 57共同转染CV-1细胞；转染48小时后，分离总RNA。等量的RNA在1.2%琼脂糖-17%甲醛凝胶上分离，转移到Hybond-N膜上，并与ORF 50的反义核糖探针杂交。图A显示，随着ORF 57数量的增加，ORF 50 mRNA水平没有显著增加。磷成像仪（分子动力学）定量Northern印迹中的条带显示，在ORF 57的最高浓度下，mRNA数量最多增加了三倍，但ORF 57水平远高于超诱导所需的浓度。同样转染细胞的提取物也用ORF 50兔抗血清进行免疫印迹检查（图。B） ；在ORF57浓度下，ORF50蛋白水平没有增加，荧光素酶试验观察到明显的协同作用。（在高浓度ORF 57下，观察到ORF 50蛋白水平增加不超过三倍。）ORF 57对宿主蛋白合成毒性的可能性可以排除，原因有二：（i）在转录物未上调的报告者中，ORF 57的表达不会降低基础荧光素酶水平（图。)和（ii）ORF 59蛋白水平与RNA水平同步升高，以响应ORF 57（图。).
在ORF50和ORF57存在的情况下重新检查内含子效应。
在HSV系统中，当报告子的表达被ICP4和ICP0 IE转录激活子的共表达激活时，ICP27对内含子报告子的抑制作用最明显(40). 这个事实，再加上在自然感染中ORF57的表达总是伴随着ORF50的产生，使我们重新检查了内含子在这种情况下的作用。我们测试了三对含有或缺乏SV40T内含子的同基因萤光素酶报告子，分别由nut-1、Kaposin和tk基因的启动子驱动。在固定饱和剂量的ORF 50和增加数量的ORF 57表达载体（图。). 从这一分析中得出了几个有趣的事实。首先，协同ORF 50-ORF 57相互作用是启动子特异性的。虽然所有三个启动子都是ORF 50响应型(23)，tk启动子没有被ORF 57的共表达协同上调，而Kaposin启动子最多被25倍（nut-1启动子为80到100倍）的诱导过度（比较图。A和B）。第二，在一些但不是所有这些上下文中观察到内含子的显著影响。具体来说，nut-1结构中的内含子仍然允许ORF57上调，但这种协同作用减少到10倍（而无内含子报告子的协同作用几乎是100倍[图。A] ）。相比之下，在卡波素报告子上观察到的内含子影响很小（图。B） ●●●●。值得注意的是，我们没有观察到基因表达的实际抑制，即荧光素酶活性低于在没有ORF 57表达的情况下观察到的水平。由于荧光素酶的基础水平在这些分析中通常相当高（由于ORF 50激活），这是检测抑制的一种敏感分析。
讨论
这些结果表明ORF 57是一种由剪接裂解mRNA表达的核蛋白。在瞬时报告基因分析中，ORF 57的表达对多种启动子几乎没有影响，这表明它不是一种广谱转录激活物。尽管进行了广泛的研究，但我们也观察到在这种嵌合构建体中存在或不存在内含子的一致性影响很小。尽管如此，一些病毒RNA的积累（例如ORF 59和nut-1的RNA）可以在ORF 57的存在下以一种提示转录后调控的方式强烈增强。此外，ORF50上调的一些启动子（尤其是nut-1）的表达可以通过与ORF57共表达而协同增强。这种协同作用源于ORF50转录活性的翻译后增强。这些数据表明ORF57是一种复杂的多效性效应器，可以在多个水平上作用，以增加病毒基因的表达。
虽然与ICP27同源，但KSHV ORF 57蛋白在一些重要方面与HSV-1对应物有所不同。在HSV中，ICP27的表达导致强烈抑制RNA剪接，这一效应被认为是阻断宿主大分子合成的一个重要因素。（因此，HSV的大多数DE和L mRNAs是非片段化的）。ORF 57与ORF 50的共表达并不影响ORF 50 mRNA或全长蛋白的积累（图。). 由于ORF50在其编码区中含有一个内含子，这一结果清楚地表明ORF57并不损害该内含子的剪接（值得注意的是，功能性ORF57本身是RNA剪接的产物）。此外，尽管对KSHV基因表达的研究还处于早期阶段，但已有大量剪接病毒mRNA的例子被记录在案，包括K14/74的DE基因(19,48)和KbZIP(16,22)和编码K8.1的L基因(11,33)和ORF 29(34). 最近的研究(15)也显示，K15/LAMP的多重剪接转录物虽然在潜伏期低水平表达，但在裂解生长期间强烈上调。这些发现与整个KSHV裂解周期中RNA剪接或内含子基因表达的实质性阻滞不一致。
然而，尽管上述考虑强烈反对内含子序列的普遍下调，但它们并不排除ORF 57激活的特定基因中这种激活可能优先或仅在未片段化RNA上运行的可能性。也就是说，在这些基因中，ORF57可能对内含子序列相对不敏感，但积极上调那些缺乏内含子的序列。在其他疱疹病毒中，越来越多的证据表明ORF57的同源物可以从细胞核穿梭到细胞质，并可以介导未分裂mRNA的优先细胞质积累(26,39,42,44). 本工作中没有任何内容将其排除在KSHV ORF 57的一种潜在作用模式之外。然而，我们的数据表明，这不是ORF 57的唯一作用模式，因为（i）其ORF 50活性的增强在翻译后水平上起作用（图。)以及（ii）完全定位于细胞核的nut-1 RNA也被ORF 57蛋白显著上调（图。).
在这方面，nut-1晋升的记者的内含子的作用很有趣。尽管ORF 50-ORF 57协同作用主要通过nut-1启动子的作用表达，但无内含子版本的基因表达上调的效率是其内含子衍生物的10倍（图。A） ●●●●。这与某些无内含子mRNA可能优先稳定或输出以在细胞溶质中翻译的观点一致。有趣的是，相同的mRNA在由卡波素启动子引导时表现不相似（图。B） 表明启动子处的事件也会影响RNA的加工和转运。虽然还不完全理解，但在其他系统中也观察到了这种效应，例如，一些细胞RNA的3′加工受到用于驱动RNA表达的启动子的强烈影响(29). 显然，转录和转录后事件通常是耦合的(4)我们不应感到惊讶的是，主要通过转录后机制发挥作用的调节器有时会受到靶RNA生物生成中早期事件的影响。
我们还不了解ORF 50和ORF 57的产物之间显著协同作用的基础，也不知道它们为什么具有如此高的启动子选择性。这在一定程度上反映了我们对ORF50激活机制的不完全理解。在其他研究中，我们在几个不同的KSHV启动子中从基因上鉴定了ORF50反应元件，并发现这些元件显示出相当大的序列异质性。我们感兴趣地注意到，受到ORF 50-ORF 57协同作用的两个启动子（nut-1和Kaposin）共享ORF 50响应元件，这些元件在序列和相对于起始位点的位置上是相同的。相比之下，TK启动子中的ORF 50反应元件与nut-1和Kaposin中的完全不同（J.Chang、D.Lukac和D.Ganem，未发表的数据）。这种异质性可能是影响启动子选择性的一个因素。例如，如果ORF 57的表达改变了ORF 50的DNA结合活性，这种变化可能导致与一些但不是所有识别位点的结合增强。显然，对这一过程的更全面理解必须等待ORF50 DNA结合的生物化学及其与基础转录机制的相互作用的更明确定义。
虽然以前在ORF 57的γ-疱疹病毒同源物中未观察到与IE调节因子的协同作用，但已证明HSV ICP27与ICP4复合，改变其亚细胞位置，并增强其调节作用(31,54). 在ORF50-ORF57相互作用的情况下，这两种蛋白质都独立地定位于细胞核，我们没有证据表明ORF50的核亚结构域因ORF57的存在而改变。我们通过联合免疫沉淀分析（体内和体外）和哺乳动物双杂交系统，广泛寻找ORF 50和ORF 57产物之间蛋白质相互作用的证据。然而，到目前为止，这些研究都是负面的。
本文描述的ORF 57对nut-1表达的影响非常显著，可能在体内发挥重要作用。根据敏感的原位杂交分析判断，Nut-1 RNA在潜伏期中不表达(43)，但在裂解生长过程中表现出巨大的效率，产生超过105nut-1 RNA/细胞分子。我们认为这种显著的积累至少是由于两种效应：（i）ORF 50-ORF 57协同作用上调位点的初级转录，（ii）ORF-57介导的转录后核转录水平上调。目前的工作重点是定义顺式-负责转录后效应的作用元件（在nut-1和ORF59中），目的是阐明这些过程中涉及的分子机制。
鸣谢
我们感谢Rolf Renne的cDNA克隆，感谢Laurent Coscoy和Andy Polson的表达载体。
我们感谢霍华德·休斯医学研究所的支持。D.M.L.是欧文顿免疫研究所的博士后研究员。
附录
在审查这份手稿时，a.K.Gupta等人发表了一篇论文(第16页)支持ORF 57作为转录后激活物的作用。作者使用核连续转录分析表明，ORF 57对CMV启动子调节CAT基因表达的转录起始率没有影响。这一数据与我们的研究结果非常吻合。
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