仙台病毒阻断α-干扰素对信号转导子和转录激活子的信号传导

摘要

为了应对病毒感染，细胞分泌干扰素（IFN），在宿主防御机制的早期阶段发挥重要作用。干扰素-α/β通过诱导干扰素刺激基因（ISG）产物在细胞中建立抗病毒状态，包括抗病毒蛋白，如双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和2′，5′-寡腺苷酸合成酶(6,22,27). IFN-α/β与I型IFN受体的结合导致受体亚单位IFN-αR1和IFN-αR2的寡聚，并通过活化环中特定酪氨酸残基的磷酸化交叉激活受体相关酪氨酸激酶（JAK家族）Jak1和Tyk2(8,13). 这些活化的JAKs酪氨酸磷酸化信号转导子和转录激活子（STATs）、Stat1（Stat1α和Stat1β）和Stat2，它们被募集到受体复合物中(12,20,24). 磷酸化后，Stat1和Stat2形成异二聚体，与p48结合，迁移至细胞核，作为活性ISG因子3（ISGF3）发挥作用，ISGF3与IFN刺激的反应元件（ISRE）结合，激活ISG的转录(26).

为了对抗干扰素-α/β的抗病毒作用，一些病毒已经进化出策略，通过阻断干扰素α/β信号来抑制ISG产物的诱导。腺病毒产生E1A蛋白，通过减少p48抑制ISGF3的形成(16,17). 人巨细胞病毒通过降低Jak1和p48阻断IFN-α/β信号传导(18,19). 在持续感染腮腺炎病毒的细胞中，Stat1α水平的降低导致ISG产物的诱导较差(31). 也已证明，人类疱疹病毒8编码IFN调节因子，抑制对IFN-α/β和IFN-γ的反应(4,32). 另一方面，痘病毒，包括痘苗病毒，已经进化出不同的策略，病毒产生干扰素受体同源物来阻止干扰素与宿主完整的干扰素接收器结合(1,28).

仙台病毒（SeV）是副粘病毒的原型，也能抑制IFN-α/β的抗病毒作用(30). 我们之前的研究表明，这种抑制是独特的，因为即使是紫外线激活的SeV也保留了抗干扰素的能力。抑制既不需要病毒复制也不需要二次转录(30). 在这里，我们证明，SeV在不降解IFN-α信号通路任何成分的情况下阻断IFN-α向STATs的信号传导，并进一步揭示了在SeV感染细胞中IFN-刺激的Tyk2活化的部分抑制，Tyk1是STATs上游分子之一。因此，这项研究代表了一种新的病毒机制，通过这种机制，干扰素-α信号被阻断(17,19,28,32).

最初，我们确定了SeV能够有效抑制IFN-α抗病毒作用的条件。如前所述，通过抑制水疱性口炎病毒新泽西株的复制来评估抗病毒作用(30). 只有在SeV感染之前但未在IFN-α治疗后观察到显著抑制（数据未显示）。根据这一结果，我们推测SeV靶向IFN-α/β信号通路的一个或多个组分，而不是靶向PKR等抗病毒产品，因为如果SeV靶点是痘苗病毒等抗病毒蛋白，即使在IFN-α预处理的细胞中，抗病毒作用也会被抑制(2,三). 为了检查SeV是否真的影响IFN-α刺激的ISGF3的形成，使用³²包含参考中所述ISRE序列的P标记探针10在指定的时间点用SeV感染细胞，并在用含有IFN-α的培养基替换后2 h收获细胞。SeV感染前的IFN-α治疗导致ISGF3的形成（图。​（图1，1而在干扰素治疗前12小时，在感染SeV的细胞中未检测到ISGF3复合物（图。​（图1，1，车道3）。干扰素治疗前1或4小时的SeV感染也导致ISGF3的形成受到实质性抑制（图。​（图1，1，通道4和5），表明抗干扰素状态几乎在感染早期建立。

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图1

SeV感染细胞中ISGF3复合物的形成。HeLa细胞在指定的时间被模拟感染（m）（1和2道）或感染SeV，并在用含有10^三每毫升IFN-α的IU（来自日本大阪武田化学工业有限公司的重组人IFN-α2a）（2至7道）或无IFN-α（1道）。核提取物是根据“微萃取”方法制备的(23,25)EMSA使用³²如前所述，标有P的ISG15 ISRE探头(10). 箭头指示ISGF3的位置。SeVpB型(30)，从持续感染SeV株名古屋1-60的BHK细胞载体培养物中分离出的一种温度敏感突变株(11)，用于本研究中的所有实验。HeLa细胞在Eagle的最低必需培养基（MEM）中生长，补充5%牛血清和3%胰蛋白酶磷酸盐肉汤。

为了检测感染细胞中ISG产物的诱导是否因此受到抑制，通过Western blot分析估计Stat1、Stat2和p48以及PKR的水平。这将同时提供有关信号通路成分的信息，因为Stat1、Stat2和p48不仅仅是ISG产物(15)也是ISGF3的组成部分。如图所示。​图2，2，ISG产物的诱导在感染细胞中被显著抑制（图。​（图2，2，车道5和6）。在没有外源性添加IFN-α的情况下，感染细胞中观察到ISG产物的弱诱导作用（图。​（图2，2，车道9）。这可能是由于感染细胞分泌的自分泌干扰素-α/β的作用，因为HeLa细胞是一个良好的干扰素α/β产生细胞系(29). 感染细胞0小时时Stat1、Stat2和p48的表达水平（图。​（图2，2（第4或7车道）与未感染细胞中的细胞几乎相同（图。​（图2，2表明感染后2 h（hpi）ISGF3组分没有降解。

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图2

在SeV感染细胞中诱导ISG产物的能力较差。模拟感染HeLa细胞（泳道1至3）或感染SeV（泳道4至9），然后在2 hpi时用含有10^三每毫升IFN-α的IU（通道2、3、5和6）或无IFN-α（通道1、4、7、8和9）。在IFN-α治疗后的0（1、4和7道）、8（2、5和8道）和24（3、6和9道）h采集细胞。根据Lee等人的方法制备的全细胞提取物（20μg蛋白质）(14)如前所述进行Western blot分析(9). 抗-PKR兔子多克隆（sc-707）（A）、抗Stat1小鼠单克隆（sc-464）（B）、抗-Stat2兔子多克隆性（sc-476）（C）和抗p48兔子多克隆抗体（sc-496）（D）（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物科技公司）被用作第一抗体。剥离并重新制备相同的印迹膜。如前所述测定蛋白质浓度(9).

由于ISGF3的任何成分都没有降解，我们接下来检查了SeV感染是否影响IFN-α刺激的Stat1、Stat2和Stat3的酪氨酸磷酸化。Stat3是IFN-α信号转导的下游分子之一，尽管它不是ISGF3的组成部分。为了排除HeLa细胞分泌的自分泌IFN-α/β对信号转导的影响，进一步的分析仅限于感染早期（2 hpi）。在干扰素-α治疗后的指定时间采集感染细胞。用抗磷酸酪氨酸（701）Stat1或抗磷酸酪蛋白（705）Stat3抗体对全细胞提取物进行Western blot分析。为了检测酪氨酸磷酸化Stat2，用抗Stat2抗体免疫沉淀全细胞提取物，然后用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western blot分析。如图所示。​图3，三，在感染细胞中观察到STAT的酪氨酸磷酸化受到明显抑制（图。​（图3，三，车道5和6）。SeV感染并不影响STAT蛋白的表达水平（图。​（图3）。三). 这些结果表明，ISGF3形成的失败归因于干扰素α刺激的Stat1和Stat2酪氨酸磷酸化的抑制。

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图3

在SeV感染的细胞中抑制IFN-α刺激的Stat1、Stat2和Stat3的酪氨酸磷酸化。在用含有10^三每毫升IFN-α的IU（通道2、3、5和6）或无IFN-α（通道1、4、7、8和9）。在IFN-α处理后0分钟（泳道1、4和7）、5分钟（泳道2、5和8）或30分钟（泳道3、6和9）收获细胞。用抗磷酸化-（Tyr 701）-Stat1（编号9171）（A）和抗磷酸化（Tyr-705）-Stat3（编号9131）（C）兔多克隆抗体（新英格兰生物实验室公司）对总细胞提取物（50μg蛋白质）进行Western blot分析。为了检测酪氨酸磷酸化Stat2，用抗Stat2抗体（sc-476）（B）免疫沉淀总细胞提取物（500μg），然后用抗磷酸酪氨酸小鼠单克隆抗体（sc-7020）进行Western blot分析（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。剥离每个印迹膜，并用抗Stat1（sc-464）（A）小鼠单克隆抗体或抗Stat2（sc-476）（B）或抗Stat3（sc-7179）（C）兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）进行复制。

受体相关激酶Jak1和Tyk2负责STAT的激活。为了检查感染细胞中的JAK是否被IFN-α刺激激活，评估了酪氨酸磷酸化JAK对IFN-α的反应水平（图。​（图4A4A和B）。在干扰素-α治疗后的指定时间采集感染细胞。在用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western blot分析之前，用抗Jak1或抗Tyk2抗体免疫沉淀全细胞提取物。如图所示。​图4A，4A、 未观察到Jak1的酪氨酸磷酸化受到抑制（图。​（图4A，4A、 通道2和4），表明干扰素-α与I型干扰素受体的结合以及随后的受体亚单位，即干扰素αR1和干扰素βR2的齐聚反应正常进行。相反，IFN-α刺激的Tyk2酪氨酸磷酸化被部分抑制（图。​（图4B，4B、 车道2和4）。这一发现也通过使用针对Tyk2激活环中磷酸酪氨酸残基（1054/1055）的特异性抗磷酸-Tyk2（Tyr 1054/1056）兔多克隆抗体（编号9321）（新英格兰生物实验室公司，马萨诸塞州贝弗利）得到证实（数据未显示）。Jak1和Tyk2的表达水平以及IFN-αR1和IFN-αR2的表达水平稳定，与IFN-α治疗和SeV感染无关（图。​（图4）。4). 这些结果以及图。​图22和​和3，三发现SeV感染并没有降解信号通路的任何成分。

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图4

SeV感染对IFN-α刺激的Jak1和Tyk2酪氨酸磷酸化以及对I型IFN受体亚单位IFN-αR1和IFN-αR2表达水平的影响。在用含有10^三每毫升IFN-α的IU（第2和第4道）或无IFN-α（第1和第3道）。干扰素-α处理后15分钟收集细胞。在用抗磷酸酪氨酸小鼠单克隆抗体（sc-7020）进行Western blot分析之前，用抗Jak1（编号06-272）（A）和抗Tyk2（编号06-638）（B）兔多克隆抗体（Upstate Biotechnology，Inc.，Lake Placid，N.Y.）对总细胞提取物（1 mg）进行免疫沉淀。剥离相同的印迹膜，并用抗Jak1（J24320）（A）和抗Tyk2（T20220）（B）小鼠单克隆抗体进行复制（肯塔基州列克星敦市转导实验室）。为了检测I型干扰素受体亚单位，用抗干扰素-αR（IFN-αR1）（sc-845）和抗IFN-α/βR（IFN-αR2）（sc-704）兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）（C）对全细胞提取物（50μg）进行Western blot分析。

Didcock等人最近主要通过对IFN-α/β应答质粒的转染实验证明了SeV感染细胞对IFN-β无应答(5). 我们在这里展示的结果与他们的结果基本一致，并进一步证明SeV阻断IFN-α向STAT的信号传导，而不会降解IFN-α信号通路的任何成分（图。​（图3三和​和4）。4). 正常的干扰素刺激的Jak1酪氨酸磷酸化（图。​（图4A）4A） 表明干扰素-α与受体的结合以及随后受体亚单位的齐聚均未受到抑制。这些发现表明，在SeV感染的细胞中，IFN-α的信号通过细胞膜，但几乎没有到达STATs。

干扰素-α对STAT的信号传导被阻断的机制尚待阐明。我们发现，与Jak1的正常酪氨酸磷酸化相比，Tyk2的激活被部分抑制（图。​（图4B）。4B） ●●●●。因此，有理由推测，部分抑制Tyk2的酪氨酸磷酸化会导致STAT的酪氨酸磷酸化酶随后失败。然而，目前尚不清楚是否只有这种部分抑制才有助于阻止STAT的信号传导。然而，这一发现具有重要意义，并表明这种部分抑制背后的另一种机制（如果存在）针对的是非常接近Tyk2激活的信号传递过程。福尔波酯通过诱导针对Tyk2而非Jak1的特定酪氨酸磷酸酶活性，特异性抑制IFN-α刺激的Tyk1酪氨酸磷酸化(21). 酪氨酸磷酸酶抑制剂钒酸盐可以逆转这种抑制作用。虽然佛波酯的抑制模式与SeV感染细胞相似，但我们的初步实验表明，钒酸盐处理从未逆转SeV对IFN-α刺激的Stat1和Tyk2酪氨酸磷酸化的抑制作用（未发表），这表明没有磷酸酶参与阻断过程。最近发现SeV C蛋白（C′、C、Y1和Y2）负责抑制机制(7,9). 因此，对C蛋白和细胞因子（例如干扰素-α信号通路的成分）之间的分子相互作用的分析将大大有助于阐明抑制Tyk2活化的机制。

鸣谢

参考文献