《维罗尔杂志》。2000年1月；74(2): 914–922.
树突状细胞靶向在委内瑞拉马脑炎病毒发病机制中的作用
北卡罗来纳大学教堂山医学院微生物与免疫学系，北卡罗来那州教堂山27599-7290
*通讯作者。通讯地址：北卡罗来纳大学教堂山医学院微生物与免疫学系，北卡罗来那州教堂山校园信箱7290，玛丽·埃伦·琼斯大厦804号，邮编：27599-7290。电话：（919）966-4026。传真：（919）962-8103。电子邮件：ude.cnu.dem@dcamg. 收稿日期：1999年7月2日；1999年9月29日接受。
摘要
委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）从皮肤接种传播到引流淋巴结的最初步骤已经确定。采用绿色荧光蛋白和免疫细胞化学方法，在接种后48小时内，确定引流淋巴结中的树突状细胞是VEE感染的主要靶点。VEE病毒复制子颗粒只能经历一轮感染，它确定朗格汉斯细胞是接种后直接感染VEE的初始细胞集。这些细胞是皮肤中常驻的树突状细胞，在活化后迁移至引流淋巴结。VEE E2糖蛋白基因中的一个点突变使病毒无毒，并影响其扩散到引流淋巴以外的能力，从而阻止了体内淋巴结中病毒感染的树突状细胞的出现。第二个位点的抑制突变可以恢复病毒向淋巴组织的传播并部分恢复毒性，同样可以恢复VEE感染体内树突状细胞的能力。
委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）是一种阳性的单链RNA阿尔法病毒属于家庭的多哥病毒科1995年至1996年委内瑞拉和哥伦比亚发生的动物流行病证明，VEE流行株在马和人身上造成重大疾病，在这期间，估计有60000人在周边马群爆发疫情后受到感染(35). VEE由蚊子传播，典型的是亚属蚊子库莱克斯在血腥餐过程中。VEE感染会导致马的双相性疾病。第一阶段的特征是发热和淋巴组织中的病毒复制，伴有高血清病毒血症(14,19). 在第二阶段，尽管免疫系统介导了外周组织的清除，但病毒会侵入中枢神经系统，导致往往致命的脑炎。人类感染导致的疾病比马患的要轻得多，从无症状到流感样症状和发烧，大约0.1%到0.7%的病例会导致脑炎，最常见于儿童和老年人(18).
啮齿动物模型中的感染与马中的脑病相似(14,23). 在小鼠后足垫皮下接种后，在接种后4小时内（p.i.），首次在引流淋巴结中观察到病毒复制。这比脚垫中接种部位的复制提前6到8小时，表明初级扩增发生在遇到的第一个淋巴组织而不是接种部位（J.F.Aronson、N.L.Davis、F.B.Grieder、P.C.Charles、T.A.Knott、K.W.Brown和R.E.Johnston，未发表的数据）。病毒滴度为106到107早在6小时p.i.时，在引流淋巴结中观察到PFU/g组织(2). 在12至24小时p.i.时，在其他淋巴组织和血清中观察到高滴度，在一些非淋巴组织中发现低滴度。到48-72小时，滴度开始下降，感染组织坏死。在72至96小时内，病毒从外围完全清除。然而，此时病毒已经通过嗅神经和三叉神经从血液传播到中枢神经系统，最终导致致命的脑炎(6).
尽管淋巴组织在VEE发病机制的早期阶段是病毒复制的重要部位(14,23,34; Aronson等人，未发表），尚未确定病毒复制的特定细胞靶点。VEE表达载体(10,27)编码绿色荧光蛋白（GFP）或流感病毒血凝素（HA）的基因与免疫细胞化学相结合，证明VEE主要靶向淋巴结中的树突状细胞（DC）。VEE病毒复制子颗粒（VRP）只能经历一轮感染，其使用表明，VEE最初感染朗格罕斯细胞，朗格罕细胞是皮肤中的常驻DC，激活后迁移至引流淋巴结。VEE E2糖蛋白基因的点突变使病毒无毒并影响其扩散到引流淋巴结以外的能力(11,18)阻断体内淋巴结中病毒感染DC的出现。第二个位点的抑制突变可以恢复病毒向淋巴组织的传播并部分恢复毒性（Aronson等人，未发表；K.A.Bernard，个人通讯），同样可以恢复VEE在体内感染DC的能力。
材料和方法
病毒和老鼠。
本研究使用直接从VEE cDNA克隆的全长或部分RNA转录物转染到幼仓鼠肾脏（BHK）细胞中获得的病毒颗粒。这些克隆包括pV3000，来自VEE的特立尼达驴品系(11,12)，和两个突变克隆pV3010(11,18)和pV3533（Aronson等人，未出版）。从这些全长克隆获得的感染病毒分别命名为V3000、V3010和V3533。除E2 76（Glu→Lys）外，V3010与V3000同基因。V3533是V3010的第二位点回复子，是通过在E2116（Lys→Glu）插入抑制突变到V3010背景中而产生的。E2 116抑制突变被鉴定为从V3010感染小鼠血清中分离出的V3010回复物中的一种成分突变。V3533在小鼠中的复制似乎与在体分离的回复体相同。
这些研究中使用了两种来源于V3000的VEE表达载体（图。)：双启动子载体（dpV3000）(10)和复制子载体(27). dpV3000包含插入V3000基因组3′末端附近的26S亚基因启动子的第二个拷贝。dpV3000-GFP是通过插入GFP突变形式的副本（mut2GFP）生成的(7)第二个26S启动子下游。该载体产生具有繁殖能力的病毒颗粒，在感染后表达GFP，并可在细胞间传播。相反，复制子表达载体的结构基因直接被异源基因取代(10,27)并被用于产生繁殖缺陷病毒颗粒，其仅限于一轮感染。
V3000克隆和载体的遗传图谱。亲本病毒V3000的图表，描绘了基因组启动子（G）、亚基因组26S启动子（26S）和非结构基因（nsP1-nsP4）、衣壳蛋白和糖蛋白基因（E1到E3）（a）、双启动子表达载体dpV3000-GFP（b）以及带有pGFP-VRP、衣壳、，糖蛋白助手（c）。在表达复制子中，结构蛋白基因被删除，并被26S启动子下游的mut2GFP基因取代。VEE衣壳基因和糖蛋白基因由单独的辅助RNA提供，其中VEE基因组的5′端和3′端被保留，但大多数非结构基因区域，包括封装信号，被删除(7). 当共同电穿孔到同一细胞中时，这三个RNA提供了所有必需的VEE功能，导致编码GFP的感染性VRP组装并释放到培养基中。
两个复制子载体，一个表达流感病毒HA（pHA-VRP）(27)在这些研究中使用了一种表达mut2GFP（pGFP-VRP）的蛋白。pGFP-VRP是通过直接在26S启动子后面克隆mut2GFP来代替结构基因而产生的。通过将pGFP-VRP或pHA-VRP的RNA转录物与表达VEE衣壳和糖蛋白基因的两个VEE辅助载体共电穿孔到BHK细胞，感染性VRP由这些载体产生（图。c） ●●●●。这两种辅助载体都缺乏病毒包装信号，导致只有pGFP-VRP或pHA-VRP基因组被包装在VRP中。GFP-VRP-3000和HA-VRP-3000是由表达野生型（V3000）糖蛋白的辅助物通过电穿孔产生的，而突变的VRP，GFP-VRP 3010和GFP-VRP3533，则分别使用包含V3010和V3533突变的糖蛋白辅助物包装。虽然VRP具有完全传染性，但它们只能经历一轮感染，并用于研究体内感染的初始事件，而不会产生和传播病毒后代。用免疫荧光法或免疫细胞化学法在作为感染单位（IU）的BHK细胞上测定滴度。
将7至8周龄的雌性CD-1或C57BL/6小鼠（分别为马萨诸塞州威尔明顿的Charles River实验室和缅因州巴尔港的Jackson实验室）在脚垫中皮下接种10三到104病毒PFU或VRP IU。
GFP检测和免疫细胞化学。
在p.i.第7至48小时，用4%多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中灌注小鼠，并清除排出的腘窝淋巴结。对于腿部切片，在进行切片之前，用8%EDTA–4%PFA对整个腿部脱钙6周。使用异硫氰酸荧光素过滤装置，通过固定冰冻切片的荧光显微镜观察GFP阳性细胞。以下抗体（Abs）用于免疫染色：DC的兔抗VEE（J.Smith，Ft.Detrick，Fredrick，Md.的亲手赠品）、抗DEC 205（NLDC145；美国型培养物收集）和抗CD11C（N418；美国型培育物收集）、滤泡DC的抗CR-1（PharMinen）和抗FcγIII/IIR（Pharminen）；巨噬细胞的抗CD11B（MAC-1）、抗MHC II IAd+b（克隆25.9.175；均由密苏里州圣路易斯华盛顿大学圣维京分校善意提供）、B细胞的抗CD45R（B220；PharMinen）和T细胞和Ly1 B细胞的特异性抗CD5（PharMineng）。使用兔抗流感（H1N1；孟菲斯圣裘德儿童医院R.Webster善意提供）检测流感病毒HA。在所有免疫染色步骤中，均使用种属匹配的正常血清或同种匹配的单克隆抗体（MAb）（PharMinen）作为阴性对照原抗体。为了优化DEC 205的反应性，将固定冰冻切片在10 mM柠檬酸盐（pH 6.0）中蒸25分钟（或者，如果是含有GFP的组织，则将其加热至55°C 1小时）。用丙酮固定新鲜组织切片（10分钟），确认表位检索方法获得的免疫染色模式。切片在10%的正常血清中封闭1小时（DEC 205的PBS中加入0.1%吐温20），在PBS中清洗，并在4°C下与原抗体孵育过夜。用含有适当荧光色素（CY2、CY3或德克萨斯红）的二级抗体培养切片，或者直接结合到抗体上，或者通过亲和素-生物素桥（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。
VEE感染细胞的分离。
在所有四个脚垫中接种10只小鼠三dpV3000-GFP的PFU，2小时后取出腘窝、髂外侧、副轴和适当轴淋巴结，切成1 mm2完全培养基中的冰块（RPMI-C:RPMI 1640，10%胎牛血清FBS，25 mM HEPES[pH7.2]，每毫升100 U青霉素，每毫升链霉素100μg，每毫升0.25 mg两性霉素B，2 mM我-Gln、50μM 2-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸）。用胶原酶（Sigma；IA型，100μg/ml）和DNA酶（Simma；30 U/ml）在37°C下消化组织碎片90分钟。在消化过程中，每隔30分钟用移液管轻轻移取碎片，将悬浮细胞移到冰上，并向剩余碎片中添加新鲜酶。最后的细胞悬浮液通过70μm尼龙细胞筛（Falcon）并清洗两次。通过0.5×10悬浮液的密度离心从淋巴细胞中分离DC和巨噬细胞6至1×106在14.5%Nycodenz（GIBCO BRL）缓冲液上，600×克在27°C下保持20分钟。将间期的低密度细胞（巨噬细胞和DC）从沉淀的淋巴细胞中分离出来，并将这两个部分在37°C的RPMI-C中培养过夜（14至16小时）。通过严格的移液管从低密度细胞培养物中除去DC，留下强烈粘附的巨噬细胞。树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞组分固定在4%PFA中，并通过荧光显微镜计数每个组分中GFP阳性细胞的数量。用DEC205-、CD11B-、CD11C-、B220-和CD5-特异性抗体通过免疫荧光检查DC和淋巴细胞组分的纯度。巨噬细胞、T细胞和B细胞分别占DC组分的0.3%、1.0%和5.8%。同样，DC和巨噬细胞分别占淋巴细胞分数的0.6%和0.9%。
VEE感染细胞迁移动力学。
为了确定VEE感染细胞从接种部位到引流淋巴结的移动，小鼠接种10三后脚垫中的GFP-VRP-3000的IU。在指定的时间，通过颈椎脱位处死两只小鼠，切断股动脉，并手术切除脚垫和引流淋巴结。组织外植体在37°C的RPMI-C中培养12小时（体内和体外），然后固定在4%PFA中。组织连续切片，用荧光显微镜测定每个组织中GFP阳性细胞的总数。
结果
VEE感染引流淋巴结中的DC。
dpV3000-GFP载体编码除GFP外的所有病毒基因，并允许通过鉴定表达GFP的细胞来研究病毒在细胞间的传播。在接种dpV3000-GFP后的12、24和48小时，从小鼠身上采集引流淋巴结。在p.i.第12小时，在淋巴结的副皮质中观察到形态类似DC的GFP阳性细胞（图。a和b）。在接种了以反义方向克隆GFP基因的dpV3000-GFP的小鼠组织中未检测到GFP信号。用B细胞特异性抗体B220进行免疫染色显示，GFP阳性细胞局限于副皮质的滤泡间区域，并且靠近B细胞滤泡（图。c） ●●●●。在24和48小时p.i.时，GFP阳性细胞出现在皮层深处。在p.i.12小时时，仅在髓质中看到少量阳性细胞。在随后的时间点，未观察到受感染细胞类型的明显变化。在所有时间点，髓索管腔中偶尔观察到阳性细胞，可能代表感染细胞向淋巴管迁移。
VEE感染引流淋巴结中的DC。后脚垫皮下接种后12小时腘淋巴结引流切片，10三dpV3000-GFP的PFU（a至c），显示GFP阳性细胞在引流腘淋巴结（a和b）皮质（放大倍率分别为×100和×400）和b细胞滤泡周围的分布和形态三V3000的PFU（d至f），显示VEE特异性Ab（CY2；绿色）和DC特异性Ab（DEC 205；得克萨斯红；红色）的双重免疫染色，通过使用得克萨斯红过滤器（d）、异硫氰酸荧光素过滤器（e）或三通过滤器使CY2和得克萨斯红同时可视化（f；放大倍数，×400）。
GFP的细胞质表达使得使用表面标记物难以确认感染细胞的身份。因此，用亲本病毒V3000接种小鼠，并用VEE特异性抗体结合淋巴细胞或DC特异性抗体对淋巴结切片进行双重免疫染色。V3000在副皮质中观察到类似于dpV3000-GFP载体的VEE阳性细胞模式。双重免疫染色显示VEE阳性细胞也对DC特异性标记DEC 205阳性（图d至f）。然而，VEE阳性细胞对B细胞标记物B220呈阴性（数据未显示），这与B细胞滤泡外GFP阳性细胞的定位一致。VEE阳性细胞的CD5、泛T细胞和Ly1 B细胞标记物也为阴性（数据未显示）。用血清和同型匹配的对照抗体进行免疫染色，证实了这种染色的特异性（数据未显示）。当用这些抗体对接种dpV3000-GFP的小鼠组织切片进行免疫染色时，也发现了类似的结果。在灭活繁殖病毒所需的固定条件下，无法确定感染细胞的CD11C反应状态。这些结果表明，皮质旁的DEC 205阳性DC代表了VEE感染引流淋巴结中的主要细胞靶点。
GFP阳性细胞与VEE感染小鼠淋巴结的DC群共分离。
为了证实VEE对DC的靶向性，在接种dpV3000-GFP后，立即清除小鼠的淋巴结。通过密度离心将组织匀浆分为淋巴细胞、巨噬细胞和DC，隔夜培养，并对GFP阳性细胞的数量进行评分（表). DC组分中GFP阳性细胞的数量始终比淋巴细胞组分多2个数量级。在一次实验中，巨噬细胞群中未观察到阳性细胞，而在第二次实验中观察到的四个阳性细胞松散粘附，很可能代表未从培养皿中去除的DC。这些结果与免疫细胞化学观察一致，表明DC是VEE感染的主要靶点。
表1
| 出口 | 细胞分数 | 每10个GFP阳性细胞数7细胞 | 计数的GFP阳性细胞总数c（c） |
|---|
| 1 | 直流 | 660b条 | 178 |
| 淋巴细胞 | 0.4一 | 1 |
| 巨噬细胞 | 0b条 | 0 |
| 2 | 直流 | 556b条 | 139 |
| 淋巴细胞 | 4一 | 16 |
| 巨噬细胞 | 4b条 | 4 |
朗格汉斯细胞是继s.c.接种后第一批感染VEE的细胞。
VRP是有繁殖缺陷的病毒颗粒，只能经历一轮感染。因此，VRP感染的细胞必然代表最初感染病毒的细胞数量。VRP表达GFP或HA（图。c） 用于识别在脚垫中进行s.c.注射后感染病毒的初始细胞集。小鼠接种低剂量（10三检查后脚垫GFP-VRP-3000 s.c.的IU），以及整条腿或腹腔引流淋巴结的连续切片。在p.i.12和24小时对全腿连续切片的检查显示，GFP阳性细胞仅存在于皮层包膜下区域的引流腘淋巴结中（图。a和b）。在包括脚垫在内的任何其他组织中均未观察到信号。当接种dpV3000-GFP的小鼠在7.5小时p.i.处死时，发现了相同的结果，这是可以检测到GFP的最早时间（数据未显示）。GFP阳性细胞的大尺寸（胞体直径20至30μm）及其具有广泛突起的形态（可通过3至4个连续30μm厚的切片进行追踪）与皮肤中发现的朗格汉斯细胞相似。这些GFP阳性细胞很少在淋巴结深处观察到，即使在24至48小时p.i.，并且在接种后持续5天，没有表现出明显的形态变化。用表达HA作为细胞表面标记物（HA-VRP-3000）的VRP接种小鼠的淋巴结，通过双重免疫染色证实了这些细胞的表型。HA阳性细胞（图。c和e）对DEC 205和主要组织相容性复合体（MHC）II类呈弱阳性（图。d和f），但淋巴细胞和巨噬细胞标记物（CD5和CD11B）以及DC标记物CD11C呈阴性（数据未显示）。VRP剂量增加10倍（104IU）导致副皮质中少量HA阳性细胞CD5和B220阴性，CD11C和CD11B阳性，表明在较高剂量下，其他抗原呈递细胞亚群（包括巨噬细胞）可能受到感染。
朗格汉斯细胞是接种后感染的第一批细胞。（a和b）腿部切片，显示在后脚垫皮下接种10个三GFP-VRP-V3000的IU（放大倍数分别为×100和×400）。（c至f）感染10只小鼠8小时后排空其淋巴结切片三用针对流感病毒（c和e）、DC（d；DEC 205）或MHC II类（f）的抗体对HA-VRP-3000的IU进行双重免疫染色，并用共焦显微镜（放大倍数×600）分析0.5μm厚的切片。
为了确定感染细胞和/或游离病毒从接种地点迁移到接种10只小鼠的引流淋巴结、脚垫和引流腘淋巴结的动力学三在第7分钟到第3小时之间的时间点，手术切除GFP-VRP-3000的IU，并将其置于器官培养中，以允许GFP的表达。组织培养12小时（体内和体外）并固定，并测定连续切片中GFP阳性细胞的总数（图。). 在培养基中没有发现GFP阳性细胞，也没有在任何培养物中粘附到塑料上。接种后30分钟，脚垫中GFP阳性细胞的数量下降至0，表明感染细胞从接种地点快速迁移。同样，在30分钟时在淋巴结中观察到大量GFP阳性细胞，并在1至2小时之间达到稳定。这一时间过程与接种部位朗格汉斯细胞的VEE感染以及随后这些细胞向引流淋巴结的移动一致。这似乎是一个有效的过程，因为大约45%的接种的VRP可以在淋巴结中作为GFP阳性细胞回收。
VEE感染细胞的运动动力学。在后足垫接种10个GFP阳性细胞后，立即测定足垫（孵化）和腹腔引流淋巴结（固体）中GFP阳性的细胞数量三GFP-VRP-3000的IU。在规定的时间，手术切除组织并作为组织外植体在37°C下培养12小时（体内和体外）。组织连续切片，用荧光显微镜测定每个组织中GFP阳性细胞的总数。每个时间点代表两对脚垫和引流淋巴结的平均值。
VEE E2糖蛋白基因的单一突变可防止淋巴结DC感染。
将一个突变引入V3000的E2糖蛋白基因以产生V3010突变，严重影响了病毒的毒力和病毒传播到引流淋巴结以外的能力(11,18). 将VRP包装在V3010结构蛋白中，以确定这种突变对Langerhans细胞靶向性的影响。对整个引流淋巴结的连续切片检查表明，这种突变有效地阻止了引流淋巴结中GFP阳性朗格汉斯细胞的出现。偶尔在延髓深处观察到小而不规则的GFP阳性细胞（图。a） ●●●●。在接种V3000的小鼠淋巴结中也发现了低频率的这些细胞。在小腿的其他组织中，包括脚垫中的接种部位，未观察到GFP阳性细胞。
VEE E2糖蛋白基因的单一突变可防止DC体内感染，而第二位点抑制突变可恢复VEE感染DC的能力。在后脚垫接种皮下注射10后12小时的引流淋巴结切片三GFP-VRP-V3010（放大倍数×600）（a）、GFP-VRP V3533（放大倍数，×400）（b）或HA-VRP-V3533（c至f）的IU。用流感病毒和FcγIII/IIR特异性抗体对HA-GFP-V3533切片进行双重免疫染色，并用共焦显微镜（放大倍率，×600）（c和d）或流感病毒和CR-1（e和f）进行分析，用荧光显微镜（放大倍率，×60）（e和f）进行分析。
第二个位点抑制突变恢复了VEE在体内感染DC的能力。
将第二位点抑制突变引入V3010 E2糖蛋白基因（克隆V3533）（最初作为体内逆转分离），恢复病毒在引流淋巴结以外的淋巴组织中传播和复制的能力，并部分恢复病毒毒力（Aronson等人，未发表；伯纳德，个人沟通）。我们通过给小鼠接种V3533糖蛋白包装的VRP来测试第二个突变对体内细胞靶向的影响。剂量为10三IU、GFP-VRP-V3533感染细胞，其DC样形态位于B细胞滤泡内（图。b） ●●●●。这些细胞对FcγIII/IIR呈阳性（图。d） 和CR-1（图。f） 与滤泡DC标记物一致(22)但DEC 205、CD11B、CD11C和淋巴细胞标记物均为阴性。剂量较高时为104IU、GFP-VRP-3533感染的细胞对DEC 205、CD11B和CD11C呈阳性（数据未显示），类似于10岁时的VRP-30004国际单位。这些结果表明，在较低剂量下，V3533回复子获得了感染DC新亚群的能力，但在较高剂量下，它感染的细胞群与野生型病毒感染的细胞相当。
讨论
病毒感染过程中的初始事件通常决定病毒疾病的结果和严重程度。我们已经描述了VEE从皮下接种到引流淋巴结扩散的初始步骤和发病机制。通过使用具有传播缺陷的VEE载体，我们证明了皮肤DC朗格汉斯细胞是通过这种接种途径感染的第一批细胞。当用表达GFP的具有繁殖能力的病毒接种小鼠并在能够检测到GFP的最早时间处死小鼠时，发现了相同的结果。GFP在这些细胞中的表达明确地证实了一种生产性病毒感染，而不是捕获在细胞表面的抗原。虽然树突状细胞可能通过吞噬其他感染细胞类型来摄取GFP，但GFP在细胞质中的均匀分布和树突状淋巴结的有限吞噬特性都与此相矛盾。
在稍后的时间点，病毒会传播到DC，而DC在引流淋巴结的副皮质中对DEC205呈强阳性。DEC205通常与交叉指状DC有关，这是DC的一个子集，与淋巴结深皮层富含T细胞的区域有关(29). 在B细胞滤泡之间的皮层下区域存在DEC205阳性的病毒感染细胞，可能是VEE感染的直接结果，也可能代表DC的一个独特亚群，与交叉指状DC共享该标记。GFP阳性细胞在淋巴结DC部分的共分馏进一步表明，DC与淋巴细胞和巨噬细胞相对，是这些组织中感染的主要靶点。
VEE靶向Langerhans细胞和DC与表明Langerhans细胞从皮肤迁移到淋巴结时分化为DC的数据一致。朗格汉斯细胞是皮肤的常驻DC，在那里它们充当外来抗原的清道夫或哨兵(1,31,33). 这些细胞不可移动，表达低水平的MHC II类和DEC 205。在抗原摄取或肿瘤坏死因子-α等细胞因子激活后，它们分化为可移动的“隐蔽细胞”，并通过淋巴转移至引流淋巴结。在淋巴结中，它们进一步分化为表达高水平MHC II类和DEC 205的强大抗原呈递细胞(1,8,9,29,31,33). 感染VRP的朗格罕斯细胞似乎保留了淋巴结中皮肤朗格罕细胞的特征，没有进一步成熟，即使在淋巴结中可以检测到这些细胞的5天时间内也是如此。感染后4-6小时，甲型肝炎病毒抑制培养细胞中宿主蛋白的合成(30). 朗格罕斯细胞的VRP感染可能干扰了细胞蛋白的合成，以至于这些细胞在淋巴结中的成熟停止在中间分化状态。如果是这样的话，VEE可能会在体内外研究朗格汉斯细胞分化方面提供一个有价值的工具。
虽然一些病毒能够在体外感染DC，但事实证明，在体内感染DC的生物体数量有限。其中包括人类免疫缺陷病毒(13,28)，淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）(三)，非洲猪瘟病毒(16)，腺病毒(15)，鼠逆转录病毒SL3-3(32)和原生动物寄生虫大型利什曼原虫(24). 如果是腺病毒、人类免疫缺陷病毒和L.主要，DC以外的细胞类型代表了其他重要的感染目标。然而，在LCMV中，引入Armstrong株（克隆13）的突变将细胞嗜性主要从巨噬细胞转移到脾脏的DC。
如多个系统所述，DC的病原体感染可以通过有效的抗原提呈和/或由于受感染DC的损伤或耗竭而产生的免疫抑制来促进有效的抗病原免疫(2). 持久L.主要DC感染与损伤愈合、终身免疫和抗再感染性相关(24)，而LCMV克隆13中细胞向性的改变由于感染DC的耗竭导致广泛的免疫抑制(三). 体外DC的麻疹病毒感染导致抗原提呈能力丧失，并被认为是体内麻疹病毒感染后出现短暂免疫抑制的主要原因(2,20). 与相同L.主要小鼠或人类的VEE感染与免疫抑制无关。VEE的毒株和减毒克隆以及表达特定抗原的VEE疫苗载体具有较强的免疫原性(4,5,10,21,27).
对脚垫中感染细胞消失和淋巴结中感染细胞出现的时间进程研究表明，皮肤中受VEE感染的朗格汉斯细胞迅速迁移至引流淋巴结，在那里传播其他DC的感染。下面描述了一系列类似的步骤L.少校感染的朗格汉斯细胞从皮肤交通寄生虫到引流淋巴结(25). 然而，这里报道的研究无法区分皮肤中的朗格汉斯细胞被感染并迁移到淋巴结，以及朗格汉思细胞不断循环到淋巴结并被淋巴携带的游离病毒感染的可能性。最近的研究表明，颗粒进入淋巴结副皮质的大小受到限制，VEE大小的大分子和颗粒直接分流到高内皮小静脉的近端区域(17). Langerhans细胞的VEE感染可能提供了一种关键机制，使病毒能够进入随后发生感染的淋巴结区域。此外，感染DC的迁移可能在将病毒转移到其他淋巴组织中发挥重要作用。
突变的V3010及其克隆的回复子V3533的研究结果进一步说明了朗格汉斯细胞在VEE传播中的重要性。V3010中的突变消除了引流淋巴结中受感染的朗格汉斯细胞的出现，而V3533中的抑制突变恢复了病毒在体内感染DC的能力。这些结果与病毒传播和部分毒力的损失（V3010）和随后的恢复（V3533）密切相关。此外，这些突变确定E2糖蛋白是体内VEE细胞嗜性的主要决定因素。由于VRP的复制子基因组缺乏糖蛋白基因，因此突变很可能在病毒传播、附着到目标细胞、渗透和/或脱膜的水平上精确确定其靶向效应。
总之，这些实验的结果揭示了VEE发病机制的几个新方面。首先，病毒复制的初始位置不是在接种部位，而是在排出接种部位的淋巴结中。其次，受VEE感染的初始细胞是淋巴结中的朗格罕斯细胞，或者更可能是接种部位的朗格汉斯细胞，它们从那里快速迁移到引流淋巴结。最后，这个过程的特异性由VEE E2糖蛋白控制，因为它在体内与靶细胞的早期相互作用中发挥作用。通过对VEE的基因操作，这些观察结果可能产生仅能进行单周期复制的野生型和突变型病毒，从而明确确定接种后最早的致病事件。
致谢
本研究得到了公共卫生署NS26681和A122186拨款的支持，以及美国陆军研发司令部根据合同DAMD17-94-J-4430提供的支持。G.H.M.感谢NIH F32-AI09778国家研究服务奖的支持。
我们感谢Cherice Connor、Jacque Bailey和Dwayne Muhammed的出色技术支持。
参考文献
1Banchereau J，Steinman R M.树突状细胞与免疫控制。自然。1998;392:245–252.[公共医学][谷歌学者] 2Bhardwaj N.病毒与树突状细胞的相互作用：一把双刃剑。《实验医学杂志》。1997;186:795–799. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Borrow P，Evans C F，Oldstone M B.病毒诱导的免疫抑制：免疫系统介导的病毒感染树突状细胞的破坏导致全身免疫抑制。《维罗尔杂志》。1995;69:1059–1070. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Caley I J、Betts M R、Irlbeck D M、Davis N L、Swanstrom R、Frelinger J A、Johnston R E。委内瑞拉马脑炎病毒疫苗载体表达的人类免疫缺陷病毒1型免疫原引起的体液、粘膜和细胞免疫。《维罗尔杂志》。1997;71:3031–3038. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Charles P C、Brown K W、Davis N L、Hart M K、Johnston R E。委内瑞拉马脑炎减毒活疫苗候选疫苗的肠外免疫诱导的粘膜免疫。病毒学。1997;228:153–160.[公共医学][谷歌学者] 6Charles P C，Walters E，Margolis F，Johnston R E。委内瑞拉马脑炎病毒在小鼠中的神经侵袭机制。病毒学。1995;208:662–671.[公共医学][谷歌学者] 7Cormack B P、Valdivia R H、Falkow S.绿色荧光蛋白（GFP）的FACS优化突变体基因。1996;173:33–38.[公共医学][谷歌学者] 8Cumberbatch M，Kimber I.皮肤肿瘤坏死因子α诱导树突状细胞迁移至引流淋巴结，并可能为Langerhans细胞迁移提供一种刺激。免疫学。1992;75:257–263. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Cumberbatch M，Kimber I.肿瘤坏死因子-α是引流淋巴结中树突状细胞积聚和最佳接触致敏所必需的。免疫学。1995;84:31–35. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Davis N L，Brown K W，Johnston R E。一种病毒疫苗载体，在淋巴结中表达外源基因并防止粘膜挑战。《维罗尔杂志》。1996;70:3781–3787. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Davis N L，Powell N，Greenwald G F，Willis L V，Johnson B J，Smith J F，Johnston R E。委内瑞拉马脑炎病毒E2糖蛋白基因突变的减弱：在全长cDNA克隆中构建单个和多个突变体。病毒学。1991年；183:20–31.[公共医学][谷歌学者] 12Davis N L，Willis L V，Smith J F，Johnston R E。从cDNA克隆中体外合成感染性委内瑞拉马脑炎病毒RNA：一个可行缺失突变的分析。病毒学。1989;171：189–204。[公共医学][谷歌学者] 13Frankel S S、Wenig B M、Burke A P、Mannan P、Thompson L D、Abbondanzo S L、Nelson A M、Pope M、Steinman R M。腺样体粘膜表面树突状细胞衍生合胞体中HIV-1的复制。科学。1996;272:115–117.[公共医学][谷歌学者] 14Gleiser C A，Gochenour W S，Jr，Berge T O，Tigertt W D。不同动物宿主中实验性委内瑞拉马脑脊髓炎病毒感染的比较病理学。传染病杂志。1961;110:80–97.[公共医学][谷歌学者] 15Gomez-Villamandos J C、Bautista M J、Carrasco L、Hervas J、Sierra M A。鹦鹉体内腺病毒感染脾脏树突状细胞的电镜证据。研究病毒。1995;146：389–395。[公共医学][谷歌学者] 16Gregg D A，Mebus C A，Schlafer D H。猪淋巴结中叉指树突状细胞与高、低毒力非洲猪瘟病毒的早期感染：免疫组织化学和超微结构研究。兽医诊断研究杂志。1995;7:23–30.[公共医学][谷歌学者] 17Gretz J E、Anderson A O、Shaw S.绳索、通道、走廊和导管：促进淋巴结皮层细胞相互作用的关键建筑元素。免疫学评论。1997;156:11–24.[公共医学][谷歌学者] 18Grieder F B、Davis N L、Aronson J F、Charles P C、Sellon D C、Suzuki K、Johnston R E。糖蛋白中单一氨基酸变化导致委内瑞拉马脑炎病毒诱导疾病进展的特殊限制。病毒学。1995;206:994–1006.[公共医学][谷歌学者] 19Groot H.委内瑞拉马脑炎（VEE）对健康和经济的影响泛美卫生组织科学出版物。1972;243:7–16. [谷歌学者] 20Grosjean I、Caux C、Bella C、Berger I、Wild F、Banchereau J、Kaiserian D。麻疹病毒感染人类树突状细胞并阻断其对CD4的异体刺激特性+T细胞。《实验医学杂志》。1997;186：801–812。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Hevey M、Negley D、Pushko P、Smith J、Schmaljohn A.基于α病毒复制子的马尔堡病毒疫苗可保护豚鼠和非人类灵长类动物。病毒学。1998;251:28–37.[公共医学][谷歌学者] 22Imai Y，Yamakawa M.滤泡树突状细胞的形态、功能和病理。病理学Int。1996;46:807–833.[公共医学][谷歌学者] 23Jackson A C，SenGupta S K，Smith J F.委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠和仓鼠的发病机制。兽医病理学。1991年；28:410–418.[公共医学][谷歌学者] 24Moll H、Flohe S、Rollinghoff M.树突状细胞大型利什曼原虫-免疫小鼠携带持久性寄生虫并介导抗原特异性T细胞免疫反应。欧洲免疫学杂志。1995;25:693–699.[公共医学][谷歌学者] 25Moll H、Fuchs H、Blank C、Rollinghoff M.Langerhans细胞转运大型利什曼原虫从感染皮肤到引流淋巴结，以呈现抗原特异性T细胞。欧洲免疫学杂志。1993;23:1595–1601.[公共医学][谷歌学者] 26Olmsted R A，Meyer W J，Johnston R E.Sindbis病毒表位的表征对动物细胞培养和发病机制的渗透至关重要。病毒学。1986;148:245–254.[公共医学][谷歌学者] 27Pushko P、Parker M、Ludwig G V、Davis N L、Johnston R E、Smith J F.委内瑞拉马脑炎病毒减毒株的复制子-帮助系统：体外异源基因表达和体内异源病原体免疫。病毒学。1997;239:389–401.[公共医学][谷歌学者] 28Rappersberger K、Gartner S、Schenk P、Stingl G、Groh V、Tschachler E、Mann D L、Wolff K、Konrad K、Popovic M.Langerhans的细胞是HIV-1复制的实际场所。病毒学。1988;29:185–194.[公共医学][谷歌学者] 29Steinman R M，Pack M，Inaba K.淋巴器官T细胞区域的树突状细胞。免疫学评论。1997;156:25–37.[公共医学][谷歌学者] 30Strauss J H，Strauss E G。α病毒：基因表达、复制和进化。微生物修订版。1994;58:491–562. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Udey M C.Cadherins和Langerhans细胞免疫生物学。临床实验免疫学。1997;107（补充1）:6–8.[公共医学][谷歌学者] 32Uitenbogaart C H、Law W、Leenen P J、Bristol G、van Ewijk W、Hays E F。胸腺树突状细胞是致癌病毒SL3-3的主要靶点。《维罗尔杂志》。1998;72:10118–10125. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33van Wilsem E J，Breve J，Kleijmeer M，Kraal G.皮肤引流淋巴结中携带抗原的朗格汉斯细胞：表型和迁移动力学。《皮肤病研究杂志》。1994;103:217–220.[公共医学][谷歌学者] 34Walker D H、Harrison A、Murphy K、Flemister M、Murphi F A.委内瑞拉马脑炎在仓鼠中的淋巴和髓性发病机制。《美国病理学杂志》。1976;84:351–370. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Weaver S C、Salas R、Rico-Hesse R、Ludwig G V、Oberste M S、Boshell J、Tesh R B。南美洲流行性委内瑞拉马脑脊髓炎的再次发作。VEE研究小组。柳叶刀。1996;348:436–440.[公共医学][谷歌学者] 
