《维罗尔杂志》。2000年1月；74(1): 74–82.
缺乏M2基因（M2-2）开放阅读框2的呼吸道合胞病毒改变生长特性并在啮齿动物中减弱
加利福尼亚州山景城Aviron，邮编94043
*通讯作者。通讯地址：Aviron，297 North Bernardo Ave.，Mountain View，CA 94043。电话：（650）919-6587。传真：（650）919-6611。电子邮件：moc.noriva@nijh. 收稿日期：1999年5月28日；1999年9月20日接受。
摘要
呼吸道合胞病毒M2基因编码两种推测蛋白：M2-1和M2-2；两者都被认为参与RNA转录或复制过程。为了了解M2-2蛋白在病毒复制中的功能，我们从人RSV A2株的感染性cDNA克隆中删除了M2-2开放阅读框的大部分。用含有M2-2缺失的cDNA克隆和编码RSV N、P和L蛋白的质粒转染HEp-2细胞，产生了缺乏M2-2蛋白的重组RSV（rA2ΔM2-2）。回收并鉴定重组病毒rA2ΔM2-2。在感染rA2ΔM2-2的细胞中，检测到的10个RSV基因的病毒mRNA表达水平没有变化，只检测到较短的M2 mRNA。然而，在rA2ΔM2-2感染的细胞中，病毒基因组或抗原组RNA与mRNA的比例降低。通过使用针对细菌表达的M2-2蛋白的抗体，在感染野生型RSV的细胞中检测到假定的M2-2蛋白质，但在感染rA2ΔM2-2的细胞中未检测到。rA2ΔM2-2在HEp-2细胞中表现出小塑性形态，生长速度远慢于野生型RSV。与野生型重组RSV相比，在感染的Vero细胞中，rA2ΔM2-2表现出非常大的合胞体形成。rA2△M2-2似乎是宿主范围的突变，因为它在HEp-2、HeLa和MRC5细胞中复制不良，但在Vero和LLC-MK2细胞中复制有效。rA2ΔM2-2在小鼠和大鼠上下呼吸道的复制受到高度限制。尽管rA2ΔM2-2在啮齿类动物中的复制减弱，但它能够对野生型RSV A2的攻击提供保护。在大量体外传代后，M2-2缺失突变体的基因型和表型保持稳定。rA2ΔM2-2的减毒表型表明，rA2△M2-2可能是一种潜在的减毒活疫苗候选物。
人类呼吸道合胞病毒（RSV）已被公认为儿童呼吸道疾病的主要传染源。RSV是肺炎病毒的属副粘病毒科家庭(23). RSV基因组是由15222个核苷酸（nt）组成的单链负义RNA，编码11种蛋白质：NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L。核蛋白（N蛋白）、磷酸蛋白（P蛋白）和主要聚合酶蛋白（L蛋白）以核衣壳的形式与病毒RNA基因组相关。N、P和L蛋白形成病毒RNA依赖的RNA聚合酶复合物，用于RSV基因组的转录和复制(13,33). G和F蛋白是参与病毒进入细胞的主要表面糖蛋白。基质蛋白（M蛋白）是位于病毒核衣壳和病毒包膜之间的外周膜蛋白。小疏水蛋白（SH蛋白）也是膜相关的，仅在rubulavirus SV5中有对应物(16,18)和腮腺炎病毒(11). 缺乏SH蛋白基因的重组RSV在组织培养中复制良好，表明SH蛋白是一种非必需蛋白(三). NS1、NS2、M2-1和M2-2蛋白在其他副粘病毒中缺乏已知的对应物。NS1和NS2蛋白是非结构蛋白，NS1蛋白被证明是一种有效的病毒RNA转录和复制抑制剂(1). 最近的工作表明，NS2基因对于RSV的体外复制也是必不可少的，但对于缺乏NS2基因的病毒，观察到了小塑性形态和复制减少(2,28).
RSV M2基因位于编码F蛋白和L蛋白的基因之间，并编码两种推定的蛋白：M2-1和M2-2。22-kDa M2-1蛋白由M2 mRNA的5′-近端开放阅读框编码，其开放阅读框通过编码10个氨基酸的序列与第二个M2-2开放阅读框部分重叠(10). M2-1蛋白被证明是参与RNA转录延伸的转录过程因子(9). M2-1蛋白还减少RNA转录终止并促进每个基因连接处RNA转录的通读(14,15). 预测的M2-2多肽含有90个氨基酸，但M2-2蛋白尚未在细胞内鉴定(10). M2-2蛋白在小基因组模型系统中下调RSV RNA转录和复制(9). 在病毒复制周期中，这种对RSV RNA转录和复制的负面影响的意义尚不清楚。
为了检测M2-2蛋白的功能，我们通过使用最近开发的反向遗传学系统，生成了一种不再表达M2-2蛋白质的重组RSV(8,19). 通过将M2-2开放阅读框基本缺失的RSV抗原基因cDNA与编码N、P和L蛋白的质粒共同转染到与表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒同时感染的细胞中，可以获得病毒恢复。获得了缺乏M2-2蛋白表达的活RSV，但其在组织培养细胞中表现出生长表型改变，并在啮齿动物宿主中减弱。我们的数据表明，尽管M2-2蛋白对病毒复制是不可或缺的，但在病毒感染和体内发病机制中发挥着重要作用。
材料和方法
细胞和病毒。
HEp-2、HeLa、MDBK、LLC-MK2和Vero细胞（取自美国型培养物收集[ATCC]）的单层培养物保存在含有10%胎牛血清（FBS）的最小基本培养基中。MRC5细胞（取自ATCC）保存在含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中。HEp-2细胞在传代水平362时获得，在传代级别375后未使用。所有其他细胞系均在20次体外传代中使用。修饰安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）表达噬菌体T7 RNA聚合酶(26,32)由Bernard Moss提供并在CEK细胞中生长。
M2-2蛋白多克隆抗体的产生。
为了制备抗RSV M2-2蛋白的抗血清，通过PCR扩增了编码从nt 8155到nt 8430的M2-2开放阅读框的cDNA片段，并将其克隆到pRSETA载体（Invitrogen，Carlsbad，Calif.）中。将得到的构建物pRSETA/M2-2转化为BL21-Gold（DE3）plysS细胞（Strategene，La Jolla，Calif.），异丙基-β诱导His-tagged M2-2蛋白的表达-d日-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。M2-2融合蛋白通过HiTrap亲和柱（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.）纯化，并用于免疫兔子。强化免疫两周后，对兔子放血并收集血清。
M2-2缺失cDNA的构建。
为了生成带有M2-2缺失的RSV抗原cDNA（pA2ΔM2-2），从抗原cDNA克隆中删除234 nt的cDNA片段，该cDNA片段包含M2-2开放阅读框的大部分C末端部分。保留了编码M2-2开放阅读框的N末端12个氨基酸的序列，该序列大部分与M2-1开放阅读框重叠。执行两步克隆程序以删除M2-2开放阅读框。2Hin公司在含有RSV的cDNA亚克隆（pET-S/B）中，在RSV nt 8197和nt 8431处引入了dIII限制性内切酶位点囊I（nt 4477）-巴姆使用Quickchange突变试剂盒（Strategene）获得HI（nt 8499）cDNA片段。用Hin公司dIII限制性内切酶去除了234-ntHin公司包含大多数M2-2开放阅读框的dIII cDNA片段，以及剩余的囊我-巴姆然后将M2-2缺失的HI片段克隆到RSV抗原基因cDNA克隆中，该克隆在先导序列pRSVC4G的第四个位置包含C到G的变化(19). 所得质粒命名为pA2ΔM2-2（图。).
rA2ΔM2-2基因组的结构和rA2△M2-2的恢复。（A） M2-1和M2-2开放阅读框重叠的M2基因序列。通过引入Hin公司dIII站点（下划线）。M2-2开放阅读框编码的N端12个氨基酸残基保持在与M2-1开放阅读框重叠的区域。（B） rA2ΔM2-2和rA2 RNA的RT-PCR产物，在存在（+）或不存在（-）逆转录酶（RT）的情况下，使用M2基因侧翼的一对引物获得。显示了从rA2或rA2ΔM2-2衍生的DNA产物的大小（以碱基对为单位）。左边的车道上有一个100 bp的DNA大小标记。
回收rA2ΔM2-2。
如Jin等人所述，从cDNA中回收重组RSV(19). 简言之，在六孔板中80%汇合处的HEp-2细胞以5 PFU/细胞的多重感染（MOI）感染MVA-T7 1 h，然后使用LipofecTACE（马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）转染编码RSV N、P和L蛋白和pA2ΔM2-2的质粒。将转染的HEp-2细胞在35°C下培养5小时后，用含有2%FBS的最小基本培养基替换培养基，并将细胞在35℃下进一步培养3天。从转染细胞中回收的拯救病毒（rA2ΔM2-2[缺乏M2-2开放阅读框的重组RSV]）经三次空斑纯化并在Vero细胞中扩增。通过噬菌斑测定法测定病毒滴度，并通过用多克隆抗RSV A2血清（Biogenesis，Sandown，N.H.）进行免疫染色来观察噬菌斑。
重组RSV在组织培养中的生长分析。
为了比较rA2ΔM2-2和重组RSV A2（rA2）的斑块形态，HEp-2或Vero细胞被每种病毒感染，并覆盖由1%甲基纤维素组成的半固体培养基和含有2%FBS的L15培养基（JRH Biosciences、Lenexa、Kans），用RSV A2株抗血清对感染细胞进行免疫染色。通过从拍摄的显微镜图像测量斑块来确定斑块大小。对HEp-2和Vero细胞进行rA2ΔM2-2的生长周期分析，并与rA2进行比较。在6厘米培养皿中生长的细胞以0.5的MOI感染rA2或rA2ΔM2-2。在室温下吸附1小时后，用磷酸盐缓冲盐水清洗感染细胞三次，用4毫升OptiMEM（生命科技）替换培养基，并在含有5%CO的培养箱中在35°C下培养培养物2在感染后的不同时间，收集200μl培养上清液，并将其储存在−70°C下，直至病毒滴定。取下的每一小份换上等量的新鲜培养基。使用1%甲基纤维素和含有2%FBS的L15培养基覆盖Vero细胞，通过噬斑试验测定病毒滴度。为了分析病毒在不同宿主细胞中的复制，用rA2ΔM2-2或rA2以0.2的MOI感染生长在六孔板中的每个细胞系。感染后三天，收集培养上清液，并通过Vero细胞上的菌斑试验对病毒进行定量。
RNA提取、RT-PCR和Northern印迹分析。
对于逆转录（RT）-PCR，使用RNA提取试剂盒（RNA STAT-50；Tel-Test，Friendswood，Tex）从rA2ΔM2-2和rA2感染的细胞培养上清液中提取病毒RNA。用逆转录酶和与病毒基因组互补的引物从nt7430到nt7449逆转录病毒RNA。用引物V1948（阳性为nt7486～nt7515）和引物V1581（阴性为nt8544～nt8525）对M2基因的cDNA片段进行PCR扩增。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行分析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。
对于Northern杂交分析，使用RNA提取试剂盒（RNA STAT-60；Tel-Test）从rA2ΔM2-2或rA2感染的细胞中提取总细胞RNA。RNA在含有甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上（Amersham Pharmacia Biotech）。该膜与地高辛标记的RSV基因特异性核糖探针杂交。使用核酸数字荧光检测试剂盒（Boehringer-Mannheim生化公司，印第安纳波利斯）对杂交RNA条带进行可视化。为了检测病毒基因组RNA32在Northern杂交中使用了对阴性F基因或N基因特异的P标记核糖探针。为了检测病毒抗原组RNA和mRNA32使用针对阳性F基因或G基因的P标记核糖探针。膜与核糖探针的杂交在65°C下进行。按照标准程序进行膜清洗和信号检测。
病毒多肽的免疫沉淀和免疫印迹。
通过感染细胞提取物的免疫沉淀或Western blotting分析感染细胞产生的病毒特异性蛋白。为了进行免疫沉淀分析，Vero细胞感染了MOI为1.0的病毒，并标记有35S-promix（每个100μCi[35S] Cys和[35S] 每毫升Met；美国伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham）感染后14至18小时。用放射免疫沉淀分析缓冲液溶解标记的细胞单层，用多克隆抗RSV A2血清（生物发生）或抗M2-2蛋白抗血清免疫沉淀多肽。免疫沉淀多肽在含有0.1%十二烷基硫酸钠和4M尿素的17.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并通过放射自显影术检测。对于Western blotting分析，HEp-2和Vero细胞感染rA2ΔM2-2或rA2。在感染后的不同时间，病毒感染的细胞在蛋白裂解缓冲液中进行裂解，细胞裂解物在含有0.1%十二烷基硫酸钠和4M尿素的17.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将蛋白质转移到尼龙膜上。按照Jin等人的描述进行免疫印迹(20)与M2-1蛋白（Jayesh Meanger的礼物）、NS1蛋白或SH蛋白（Jose A.Melero的礼物）的多克隆抗血清。
小鼠和大鼠体内的病毒复制。
用12周龄BALB/c小鼠（加州吉尔罗伊Simonsen Laboratories）和希氏链球菌棉鼠（马里兰州罗克维尔Virion Systems）。6组小鼠或棉鼠在106每只动物0.1-ml接种物中rA2或rA2ΔM2-2的PFU。接种后第4天，CO处死动物2分别获得他们的鼻鼻甲和肺。将组织均质化，并通过Vero细胞上的斑块试验测定病毒滴度。为了评估免疫原性和保护效果，三组小鼠仅在第0天经鼻接种rA2、rA2ΔM2-2或培养基。三周后，将小鼠麻醉，收集血清样本，并接种106生物衍生野生型RSV A2的PFU经鼻给药。在攻击后4天，处死动物，采集鼻甲和肺部，并通过菌斑试验测定病毒滴度。通过60%斑块减少试验测定RSV A2的血清中和抗体(7)以及RSV感染细胞的免疫染色。
结果
生成rA2ΔM2-2。
此前，我们报道了从RSV A2株感染性cDNA克隆中回收重组RSV(19). 为了获得表达M2-2开放阅读框的重组RSV，从感染性RSV cDNA克隆中删除编码M2-2蛋白C末端78个氨基酸的234-nt cDNA片段。保留了主要与M2-1开放阅读框重叠的N端12个氨基酸，因为这12个氨基酸可能不足以保持M2-2蛋白功能（图。A） ●●●●。抗原组cDNA中M2-2开放阅读框的缺失通过限制性内切酶消化和缺失连接处的测序得到证实。得到的抗原cDNA克隆pA2ΔM2-2长14988 nt，比pRSVC4G短234 nt。
由于pA2ΔM2-2没有完全测序，因此获得了两个独立的克隆并用于感染病毒的恢复。为了恢复M2-2开放阅读框被大量删除的重组RSV，在T7启动子的控制下，将pA2ΔM2-2与编码RSV N、P和L蛋白的质粒一起转染到感染了表达T7 RNA聚合酶（MVA-T7）的改良痘苗病毒的HEp-2细胞中。用转染HEp-2细胞的培养上清液感染新鲜HEp-2或Vero细胞，以扩增挽救的病毒。rA2ΔM2-2的恢复通过合胞体的形成来指示，并通过多克隆抗RSV A2血清对感染细胞的阳性染色来证实。回收的rA2ΔM2-2经过三次菌斑纯化，并在Vero细胞中扩增。为了证实rA2ΔM2-2含有M2-2缺失，从病毒中提取病毒RNA，并用跨越M2基因的一对引物进行RT-PCR。如图所示。B、 rA2产生的PCR DNA产物与预测的1029-nt片段相对应，而rA2ΔM2-2产生的PCR产物为795nt，短234nt。RT-PCR产物的产生依赖于RT步骤，表明产物来源于RNA而非DNA污染。来自rA2ΔM2-2的795-nt RT-PCR DNA产物的测序分析也证实了该缺失。
rA2ΔM2-2在组织培养细胞中的复制。
比较rA2ΔM2-2在HEp-2和Vero细胞和rA2细胞中的斑块形成。如图所示。A、 rA2ΔM2-2在HEp-2细胞中形成非常小的斑块，与rA2相比，观察到rA2ΔM2-2的病毒斑块大小减少了约五倍。然而，在感染rA2ΔM2-2的Vero细胞中，斑块大小仅略有减少（30%）。在感染的Vero细胞中，与rA2相比，rA2ΔM2-2形成了非常大的合胞体（图。B） ●●●●。HEp-2细胞中未观察到合胞体形成增加。在HEp-2和Vero细胞中，rA2ΔM2-2的生长周期也与rA2的生长周期进行了比较（图。). 在HEp-2细胞中，rA2ΔM2-2的生长动力学非常缓慢，rA2△M2-2的滴度峰值比rA2的滴度低约2.0 log单位。在Vero细胞中，rA2ΔM2-2达到与rA2类似的滴度峰值。进一步检测rA2ΔM2-2在来自不同组织来源的不同宿主的不同细胞系中的生长特性（表). 在感染的人类HEp-2、MRC-5和HeLa细胞中观察到rA2ΔM2-2的复制显著减少，约比rA2少2个数量级。然而，rA2ΔM2-2在MDBK和LLC-MK2细胞中的复制仅略有减少，这两种细胞分别来源于牛和恒河猴肾细胞。众所周知，来自ATCC的HEp-2细胞含有HeLa细胞标记物；因此，HEp-2细胞的行为可能与HeLa细胞相似。
比较rA2和rA2ΔM2-2形成斑块和合胞体的能力。（A） rA2ΔM2-2和rA2的斑块形态。用rA2ΔM2-2或rA2感染HEp-2或Vero细胞，在由1%甲基纤维素和含有2%FBS的L15培养基组成的半固体覆盖层上培养5天。用山羊抗RSV多克隆抗血清进行免疫染色，观察病毒斑块，并在显微镜下拍照。（B） 合胞体形成的比较。以0.5的MOI用rA2和rA2ΔM2-2感染Vero细胞，并在35°C的液体培养基（OptiMEM）中培养40 h。未经任何处理拍摄感染细胞单层。
rA2ΔM2-2在HEp-2和Vero细胞中的生长曲线。用rA2ΔM2-2或rA2感染Vero细胞或HEp-2细胞，MOI为0.5，每隔24小时采集一份培养液。病毒滴度通过Vero细胞上的斑块试验测定。每个时间点的病毒滴度是两个实验的平均值，这两个实验使用两个独立的病毒分离物。
表1
| 细胞系 | 主机 | 组织起源 | Titer（对数10Pfu/ml）
|
|---|
| rA2型 | rA2ΔM2-2 |
|---|
| 维罗 | 猴子 | 肾 | 6.1 | 6.1 |
| HEp-2型 | 人类 | 喉咙 | 6.2 | 4.3 |
| 移动可变形壁障 | 牛 | 肾 | 6.1 | 5.5 |
| MRC-5型 | 人类 | 肺 | 5.5 | 3 |
| 希拉牌手表 | 人类 | 子宫颈 | 6.6 | 4.5 |
| LLC-MK2型 | 猴子 | 肾 | 6.7 | 6.1 |
rA2ΔM2-2 mRNA合成。
为了检测rA2ΔM2-2和rA2的mRNA合成，采用Northern杂交分析感染Vero细胞中M2 mRNA和其他病毒mRNA产物的积累。将该印迹与M2-2开放阅读框特异性核糖探针杂交，在rA2ΔM2-2感染细胞中未发现任何信号。相反，通过对M2-1开放阅读框特异的核糖探针，在rA2ΔM2-2感染的细胞中检测到短的M2 mRNA（图。A） ●●●●。这些观察结果证实，M2-2开放阅读框从rA2ΔM2-2中删除。此外，还检测了其他9种RSV mRNA转录物的积累，发现rA2ΔM2-2-和rA2感染细胞之间的每种mRNA的数量具有可比性。图中还显示了使用针对N、SH、G或F基因的核糖探针探测的Northern blot的示例。A.由于M2-2开放阅读框的缺失，F-M2双顺反子mRNA的迁移速度稍快。
通过rA2ΔM2-2和rA2表达病毒RNA。（A） 感染后48小时，从rA2或rA2ΔM2-2感染的Vero细胞（MOI，1.0）中提取总RNA，在1.2%琼脂糖-2.2 M甲醛凝胶上电泳分离，并转移到尼龙膜上。每个印迹都与地高辛标记的M2-2、M2-1、F、SH、G或N基因特异性核糖探针杂交。RNA标记的大小显示在左侧。（B） 用rA2或rA2ΔM2-2感染HEp-2和Vero细胞24h，提取细胞总RNA。RNA Northern印迹与32针对负义F基因的P标记核糖探针，用于检测HEp-2和Vero细胞中的病毒基因组RNA，或N基因探针，用于仅检测Vero细胞的病毒基因组RNA。A类32用特异性阳性F基因的P标记核糖探针检测HEp-2和Vero细胞中的病毒抗原RNA和F mRNA，G基因探针仅检测Vero细胞的抗原RNA和G mRNA。右侧Northern印迹的顶部面板（F基因探针）取自下面板中显示的凝胶顶部，并暴露1周以显示抗原组。Northern印迹的下面板暴露3 h以显示F mRNA。显示基因组、抗原组、F mRNA和双顺反子F-M2 RNA。
此前有报道称，M2-2蛋白在微基因组复制试验中是一种有效的转录负调控因子。然而，M2-2蛋白表达的缺乏似乎并不影响感染细胞中病毒mRNA的产生。为了确定rA2ΔM2-2的病毒抗原和基因组RNA水平是否受到M2-2缺失的影响，我们通过Northern杂交检测了感染Vero和HEp-2细胞中产生的病毒基因组和抗原RNA的数量。感染的总细胞RNA与32P-标记的F或N基因核糖探针特异性的负义基因组RNA表明，感染rA2ΔM2-2的细胞比感染rA2的细胞产生的基因组RNA少得多（图。B） ●●●●。复制膜与32P标记的F或G基因核糖探针对阳性RNA具有特异性。在感染rA2ΔM2-2的细胞中检测到极少的抗原RNA；rA2ΔM2-2感染细胞中F或G mRNA的数量与rA2感染细胞中的相当。非常引人注目的是，rA2ΔM2-2感染细胞中的基因组和抗原RNA水平均显著降低。基因组和抗原组RNA量与病毒mRNA量之比的定量表明，在rA2ΔM2-2感染的细胞中观察到抗原组和基因组RNA量减少了至少10倍。因此，似乎RSV基因组和抗原合成因M2-2缺失而下调。这种下调在Vero和HEp-2细胞中均可见，因此不依赖于细胞类型。用不同的核糖探针和两个不同的rA2ΔM2-2分离物观察到了这种现象（图。B） ●●●●。
rA2ΔM2-2蛋白质合成。
由于之前尚未在RSV感染的细胞中鉴定出推测的M2-2蛋白，因此有必要证明M2-2蛋白确实由RSV编码并在感染细胞中产生。我们制备了针对在细菌表达系统中表达的M2-2融合蛋白的多克隆抗血清。用抗M2-2蛋白抗体免疫沉淀rA2感染的Vero细胞裂解物，产生约10 kDa的蛋白带，这是M2-2多肽的预测大小。在rA2ΔM2-2感染细胞中未检测到该多肽（图。A） 确认M2-2蛋白是RSV产生的产物，其表达被rA2ΔM2-2阻断。rA2ΔM2-2的整体多肽模式与rA2的不可区分。然而，免疫沉淀法发现，rA2ΔM2-2感染的Vero细胞中产生了略高水平的P和SH蛋白。然而，正如Western blotting分析所指出的，感染rA2ΔM2-2或rA2的细胞中产生了相当数量的SH蛋白（图。B） ●●●●。
rA2ΔM2-2-和rA2感染细胞中的病毒蛋白表达。（A） 。Mock感染或rA2ΔM2-2-和rA2感染的Vero细胞（MOI，1.0）经代谢标记为35感染后14到18小时之间的S-promix（100μCi/ml）。制备细胞裂解物，用山羊多克隆抗RSV或兔多克隆抗M2-2抗血清进行免疫沉淀。在含有4 M尿素的17.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离免疫沉淀多肽，并进行放射自显影处理。右侧显示了每个病毒蛋白的位置，左侧显示了分子量大小标记（单位：千）。（B） 通过rA2和rA2ΔM2-2表达RSV蛋白的时间过程。HEp-2和Vero细胞感染rA2或rA2ΔM2-2，MOI为1.0。在感染后10、24或48小时，在含有4 M尿素的17.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离出总感染细胞多肽。将蛋白质转移到尼龙膜上，用M2-1、NS1或SH蛋白的多克隆抗血清检测印迹。
Western blotting用于测定Vero和HEp-2细胞系中rA2ΔM2-2的蛋白质合成速率和积累。HEp-2或Vero细胞感染rA2ΔM2-2或rA2；在感染后的不同时间，收集感染细胞，并在含有4M尿素的17.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离多肽。将这些蛋白转移到尼龙膜上，并用针对三种辅助蛋白M2-1、NS1和SH的多克隆抗血清进行检测。所有三种病毒蛋白的蛋白表达水平在HEp-2和Vero细胞中的rA2ΔM2-2和rA2非常相似（图。B） ●●●●。NS1蛋白的合成在感染后10 h检测到，略早于M2-1和SH蛋白的合成，因为NS1蛋白是感染细胞中最丰富的蛋白，因为它位于3′端。当用RSV多克隆抗血清探测膜时，rA2ΔM2-2和rA2也观察到类似的蛋白质合成速率和水平（数据未显示）。两种病毒的M2-1蛋白检测到的水平相当，表明M2-2开放阅读框的缺失不会影响由相同M2 mRNA翻译的M2-1蛋白质的水平。
rA2ΔM2-2在小鼠和大鼠体内的复制。
为了评估rA2ΔM2-2的减毒水平和免疫原性，检测了rA2△M2-2在小鼠和大鼠上下呼吸道的复制。六组小鼠接种10只6鼻腔内rA2ΔM2-2或rA2的PFU。在麻醉后4天处死动物；采集鼻甲和肺组织并进行匀浆，通过斑块试验测定这些组织中的病毒复制水平。从两个实验中获得的病毒复制的几何平均滴度和标准误差如表所示rA2ΔM2-2在感染小鼠的鼻甲和肺部的复制均显示至少2.0个单位的减少。rA2ΔM2-2复制仅在12只感染小鼠中的1只或2只检测到。复制受到限制；在10分时只观察到少数斑块−1稀释组织匀浆。在小鼠的上呼吸道和下呼吸道均检测到rA2复制水平较高。在棉花大鼠中也观察到rA2ΔM2-2的类似程度的衰减。尽管rA2ΔM2-2在小鼠体内的复制受到限制，但对野生型RSV A2的攻击产生了显著的抵抗力（表). 当先前接种rA2ΔM2-2或rA2的小鼠经鼻接种106野生型A2病毒PFU，上下呼吸道未检测到野生型A2毒复制。因此，rA2ΔM2-2对野生型A2病毒的攻击具有完全保护作用。
表2
rA2ΔM2-2和rA2在小鼠体内的复制及对野生型RSV A2攻击的保护
| 免疫病毒 | 病毒复制一（平均对数10PFU/g组织±SE）：
| 质询后RSV A2复制b条（平均对数10PFU/g组织±SE），单位：
|
|---|
| 鼻甲 | 肺 | 鼻甲 | 肺 |
|---|
| rA2型 | 3.72 ± 0.33 | 4.0 ± 0.13 | <1.4 | <1.4 |
| rA2ΔM2-2 | <1.4 | <1.4 | <1.4 | <1.4 |
| 无（对照） | <1.4 | <1.4 | 3.53 ± 0.17 | 4.10 ± 0.13 |
还检测了rA2ΔM2-2的免疫原性。6组小鼠感染rA2ΔM2-2或rA2；3周后采集血清标本。通过60%斑块减少试验测定血清中和滴度。从rA2ΔM2-2-感染的小鼠获得的中和滴度与rA2的中和滴度相当；在平均稀释度为1:32至1:64的情况下，感染这两种病毒的小鼠的斑块减少滴度为60%，而出血前血清的RSV中和滴度为1:4。由于可检测的中和滴度较低，正如之前所报道的那样(17)因此，我们通过对RSV感染细胞进行免疫染色来检测RSV特异性抗体。从rA2ΔM2-2感染小鼠免疫染色的RSV斑块中获得的血清稀释度与rA2相似，证实rA2△M2-2感染的小鼠产生的RSV特异性抗体水平与rA2类似。
讨论
在本研究中，我们报道了一种重组RSV的构建，该病毒缺乏M2-2开放阅读框的大部分（rA2ΔM2-2）。通过RT-PCR、测序、Northern杂交和免疫沉淀分析证实rA2ΔM2-2的恢复。缺乏M2-2蛋白表达的重组RSV在细胞培养中是可行的，但在一些宿主细胞系和啮齿动物宿主中复制能力较差。rA2ΔM2-2的细胞类型依赖性复制表明，在缺乏M2-2蛋白的情况下，宿主因子可能参与RSV的复制。
RSV编码五种独特的蛋白质：NS1、NS2、SH、M2-1和M2-2。据报道，NS2和SH基因对RSV的体外复制是不可或缺的(三,28). 我们的实验表明，M2-2基因对RSV在细胞培养中的复制也不是必需的。因此，M2-2基因是第三个被报道为RSV复制不必要的基因。非常有趣的是，RSV进化为在其基因组中编码至少三个非必需基因。因此，这些辅助基因必须为病毒在宿主中的复制提供某些辅助功能。RSV SH基因的缺失似乎不会影响病毒的体外复制(三)，结果与报道的缺少SH基因的重组SV5非常相似(16). 相反，在某些细胞系中观察到SH敲除型RSV（rA2ΔSH）的复制稍好。虽然在小鼠下呼吸道中没有减弱(三)，rA2ΔSH在黑猩猩的下呼吸道中减弱(31). 去除NS2基因会损害人RSV和牛RSV的病毒生长(2,28). 引入串联终止密码子的NS2敲除RSV（rA2ΔNS2）迅速恢复NS2蛋白表达(28). 当鼻腔和气管内接种到黑猩猩体内时，rA2ΔNS2在上呼吸道轻度衰减，但在下呼吸道高度衰减(31). 这些结果表明NS2蛋白在病毒的完全复制能力中起着重要作用。本研究中的数据表明，M2-2蛋白虽然不是RSV生存所必需的，但却是一种辅助因子，能够在体内外实质性支持病毒生长。需要进一步研究，以了解M2-2蛋白促进病毒在不同细胞类型和动物宿主中生长的机制。
M2-2蛋白已被鉴定为RSV小基因组体外复制的强抑制剂(9). M2-2蛋白抑制RNA合成的作用令人想起水泡性口炎病毒M蛋白的抑制转录功能(5,24). 如果这种抑制作用在感染后期发挥，RNA合成的减少可能有助于病毒限制过度的细胞病理性，从而阻止进一步的子代生成，并使核衣壳在出芽前处于静止状态。事实上，我们已经观察到，感染rA2ΔM2-2的细胞比感染野生型病毒的细胞更早地表现出细胞病理效应，并且具有更大的合胞体。然而，在感染rA2ΔM2-2的细胞中观察到RNA基因组复制的下调而非上调。rA2ΔM2-2感染细胞中检测到大量抗原和基因组RNA。Northern blot杂交数据表明，rA2ΔM2-2感染细胞的mRNA生成量与野生型RSV感染细胞相当。本文报道的实验中获得的数据没有提供任何证据表明M2-2蛋白抑制RSV RNA转录和复制。M2-2蛋白影响感染细胞中mRNA稳定性的可能性尚未得到验证。M2-2蛋白可能参与从RNA转录到复制的转换，从而导致感染rA2ΔM2-2的细胞的抗原和基因组RNA合成减少。
HEp-2细胞系完全允许野生型RSV复制。然而，rA2ΔM2-2在该细胞系中的复制减少；rA2ΔM2-2在HEp-2细胞中形成非常小的斑块并复制到低滴度。为了描述RSV在HEp-2细胞中高效复制所需的M2-2蛋白功能，我们比较了Vero和HEp-2两种细胞中rA2ΔM2-2和rA2的RNA和蛋白合成。令人惊讶的是，rA2ΔM2-2感染的HEp-2细胞表达的RNA和蛋白质数量与rA2感染的细胞表达的相当。HEp-2细胞中rA2ΔM2-2的基因组和抗原RNA合成与Vero细胞相似。此前有报道称，少量M2-2蛋白的添加增加了体外小基因组的包装(29). 很可能，rA2ΔM2-2在HEp-2细胞中复制不良是由于病毒复制后期的缺陷，可能是在病毒组装过程中。rA2ΔM2-2在感染的Vero细胞中形成非常大的合胞体。初步数据表明，在细胞质含量混合实验中，rA2ΔM2-2更易融合（数据未显示）(16). M2-2蛋白的缺乏如何影响RSV融合活性仍有待研究。
仙台病毒和麻疹病毒由于病毒辅助蛋白的丢失而导致病毒复制受损和病毒致病性降低。仙台病毒C蛋白以启动子特异性方式抑制病毒mRNA合成和仙台病毒微基因组扩增(4,27). 然而，在缺乏C蛋白的仙台病毒中，转录、翻译和基因组复制的上调而不是下调。缺乏C蛋白的病毒在天然鼠宿主中高度衰减(22). 麻疹病毒的C蛋白对病毒在Vero细胞中的复制是不可或缺的(25)但在人类外周血细胞中有效复制麻疹病毒所必需的(12). 仙台病毒和麻疹病毒的V蛋白也与病毒的致病性有关(21,30). 当从这些副粘病毒中删除辅助基因时，我们发现M2-2开放阅读框的删除使小鼠和大鼠的上下呼吸道RSV减弱。因为其他RSV蛋白是免疫靶点(6)疫苗病毒中M2-2蛋白的缺失不会影响RSV的免疫原性。rA2ΔM2-2在诱导具有中和功能的RSV特异性抗体以及保护小鼠免受野生型挑战病毒在上呼吸道和下呼吸道复制的能力方面与rA2相似。M2-2基因缺失的病毒很容易与野生型病毒区分开来，并且基因稳定，因此rA2ΔM2-2可能是人类使用的候选疫苗。
致谢
我们感谢Aviron组织培养设施的杨河和朱琳达提供组织培养细胞；Roderick Tang、Robert Brazas和Tai-An Cha寻求建议和帮助；安·阿文（Ann Arvin）和理查德·斯佩特（Richard Spaete）对手稿进行了批判性审查。我们感谢Jayesh Meanger提供了针对M2-1蛋白的抗血清，并感谢Jose A.Melero提供了针对SH蛋白的抗血清。
参考文献
1Atreya P L，Peeples M E，Collins P L。人类呼吸道合胞病毒的NS1蛋白是小基因组转录和RNA复制的有效抑制剂。《维罗尔杂志》。1998;72:1452–1461. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Buchholz U J，Finke S，Conzelmann K K。从cDNA中生成牛呼吸道合胞病毒（BRSV）：BRSV NS2对病毒在组织培养中的复制不是必需的，人类RSV先导区充当BRSV基因组的功能启动子。《维罗尔杂志》。1999;73:251–259. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Bukreyev A、Whitehead S S、Murphy B R、Collins P L。从中删除了整个SH基因的重组呼吸道合胞病毒在细胞培养中高效生长，并在小鼠呼吸道中表现出特定部位的衰减。《维罗尔杂志》。1997;71:8973–8982. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Cadd T、Garcin D、Tapparel C、Itoh M、Homma M、Roux L、Curran J、Kolakofsky D。仙台副粘病毒附属C蛋白以启动子特异性方式抑制病毒基因组扩增。《维罗尔杂志》。1996;70:5067–5074. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Carroll A R，Wagner R R。膜（M）蛋白在水疱性口炎病毒内源性抑制体外转录中的作用。《维罗尔杂志》。1979;29:134–142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Cherrie A H，Anderson K，Wertz G W，Openshaw P J。树突状细胞抗原刺激的人类细胞毒性T细胞识别呼吸道合胞病毒的N、SH、F、M、22K和1b蛋白。《维罗尔杂志》。1992;66:2102–2110. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Coates H V，Alling D W，Chanock R M。通过斑块减少中和试验对呼吸道合胞病毒分离物进行抗原分析。《美国流行病学杂志》。1965;83:299–313.[公共医学][谷歌学者] 8Collins P L、Hill M G、Camargo E、Grosfeld H、Chanock R M、Murphy B R。从克隆的cDNA中生产感染性人类呼吸道合胞病毒证实了M2 mRNA 5′近端开放阅读框中转录延伸因子在基因表达中的重要作用，并为疫苗开发提供了能力。美国国家科学院程序。1995;92:11563–11567. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Collins P L、Hill M G、Cristina J、Grosfeld H。呼吸道合胞病毒（一种非片段化负链RNA病毒）的转录延伸因子。美国国家科学院程序。1996;93:81–85. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Collins P L，Wertz G W。人类呼吸道合胞病毒的包膜相关22K蛋白：mRNA的核苷酸序列和相关的多脚本。《维罗尔杂志》。1985;54:65–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Elango N，Kovamees J，Varsanyi T M，Norrby E.腮腺炎病毒小疏水蛋白基因的mRNA序列和推导的氨基酸序列。《维罗尔杂志》。1989;63:1413–1415. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Escoffier C、Manie S、Vincent S、Muller C P、Billeter M、Gerlier D。非结构C蛋白是麻疹病毒在人类外周血细胞中有效复制所必需的。《维罗尔杂志》。1999;73:1695–1698. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Grosfeld H、Hill M G、Collins P L.呼吸道合胞病毒（RSV）的RNA复制是由N、P和L蛋白引导的；在这些条件下也会发生转录，但需要RSV重叠感染才能有效合成全长mRNA。《维罗尔杂志》。1995;69:5677–5686. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Hardy R W，Harmon S B，Wertz G W。呼吸道合胞病毒的不同基因连接调节转录终止的效率，并对M2介导的反终止反应不同。《维罗尔杂志》。1999;73:170–176. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Hardy R W，Wertz G W。呼吸道合胞病毒M2基因ORF1的产物增强了病毒转录期间基因间连接的通读。《维罗尔杂志》。1998;72:520–526. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16He B、Leser G P、Paterson R G、Lamb R A。副粘病毒SV5小疏水性（SH）蛋白对病毒在组织培养细胞中的生长不是必需的。病毒学。1998;250:30–40.[公共医学][谷歌学者] 17Herlocher M L、Ewasyshyn M、Sambhara S、Gharaee-Hermani M、Cho D、Lai J、Klein M、Maassab H F。人用减毒呼吸道合胞病毒（RSV）活菌斑纯化株的免疫学特性。疫苗。1999;17:172–181.[公共医学][谷歌学者] 18Hiebert S W，Paterson R G，Lamb R A.猴副粘病毒5的一种以前未被识别的小疏水蛋白SH的鉴定和预测序列。《维罗尔杂志》。1985;55:744–751. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19.Jin H，Clarke D，Zhou Z-Y H，Cheng X，Coelingh K，Bryant M，Li S。cDNA重组人呼吸道合胞病毒（RSV）及其亚群A和B嵌合RSV的构建。病毒学。1998;251:206–214.[公共医学][谷歌学者] 20Jin H，Leser G P，Zhang J，Lamb R A.流感病毒血凝素和神经氨酸酶胞浆尾部控制粒子形状。EMBO J。1997;16:1236–1247. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Kato A、Kiyotani K、Sakai Y、Yoshida T、Shioda T、Nagai Y。富含半胱氨酸的V蛋白羧基末端半体在仙台病毒发病机制中的重要性。《维罗尔杂志》。1997;71:7266–7272. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Kurotani A、Kiyotani K、Kato A、Shioda T、Sakai Y、Mizumoto K、Yoshida T、Nagai Y。仙台病毒C蛋白是绝对不重要的基因产物，但沉默其表达会严重损害病毒复制和发病机制。基因细胞。1998;三:111–124.[公共医学][谷歌学者] 23.Lamb R A，Kolakofsky D.副粘病毒科：病毒及其复制。在：Fields B N，Knipe D M，Howley P M等人，编辑。菲尔德病毒学。第三版，宾夕法尼亚州费城：Lippincott-Raven出版社；1996年，第1177-1204页。[谷歌学者] 24Pepeples M E.副粘病毒M蛋白：将其聚集在一起，并在路上使用。收件人：金斯伯里·D·W，编辑。副粘病毒。纽约，N.Y：Plenum Publishing Corp。；1991年，第427–456页。[谷歌学者] 25Radecke F，Billeter M A.非结构C蛋白对Edmonston B株麻疹病毒在培养细胞中的增殖不是必需的。病毒学。1996;217:418–421. [谷歌学者] 26Sutter G，Ohlmann M，Erfle V.非重复痘苗载体有效表达噬菌体T7 RNA聚合酶。FEBS信函。1995;371:9–12.[公共医学][谷歌学者] 27Tapparel C、Hausmann S、Pelet T、Curran J、Kolakofsky D、Roux L。由于启动子增加选择性而抑制仙台病毒基因组复制：辅助C蛋白的可能作用。《维罗尔杂志》。1997;71:9588–9599. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Teng M N，Collins P L.改变了不产生NS2蛋白的重组呼吸道合胞病毒的生长特性。《维罗尔杂志》。1999;73:466–473. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Teng M N，Collins P L.帮助依赖性感染颗粒形成和传代所需的呼吸道合胞病毒蛋白的鉴定。《维罗尔杂志》。1998;72:5707–5716. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30.Tober C、Seufert M、Schneider H、Billeter M A、Johnston I C、Niewiesk S、ter Meulen V、Schneieder-Schaulies S。麻疹病毒V蛋白的表达与致病性和病毒RNA合成的控制有关。《维罗尔杂志》。1998;72:8124–8132. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Whitehead S S、Bukreyev A、Teng M N、Firestone C Y、St.Claire M、Elkins W R、Collins P L、Murphy B R。携带NS2或SH基因缺失的重组呼吸道合胞病毒在黑猩猩中减弱。《维罗尔杂志》。1999;73:3438–3442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Wyatt L S，Moss B，Rozenblatt S.编码噬菌体T7 RNA聚合酶的复制缺陷型痘苗病毒，用于哺乳动物细胞中的瞬时基因表达。病毒学。1995;210:202–205.[公共医学][谷歌学者] 33Yu Q、Hardy R W、Wertz G W。人类呼吸道合胞病毒N、P和L蛋白的功能性cDNA克隆支持RS病毒基因组RNA类似物的复制，并定义了最小值反式-RNA复制的作用要求。《维罗尔杂志》。1995;69:2412–2419. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
