核移位和反式激活
首先,我们确认了629RKLKK公司633模体参与激素诱导的核移位和AR的转录活性(图和补充图). 由于RKLKLGN片段的缺失早先被证明足以诱导更高的AR活性,我们进一步将注意力集中在这部分的阳性残基上。赖氨酸K638的突变似乎也有轻微增加的活性(图a) ●●●●。由于这种增加在统计上并不显著,K638残基被排除在进一步研究之外。
R629和K630对于配体诱导的核移位至关重要(图c和表)这很可能是这些突变体活性降低的原因(图a) ●●●●。K632和K633作为核转位的次级调节因子(图c) ●●●●。我们的数据符合最近描述的AR NLS–importinα复合物的晶体结构[13]. NLS内的单点突变降低了导入蛋白-α的结合亲和力,从而影响核易位。
表1
| 不带SV40-NLS | EGFP-SV40-NLS公司 |
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活动 | 本地化 | DNA结合 | 长不动分数 | 短固定分数 |
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水处理报告 | ↔ | 北卡罗来纳州 | ↔ | 25% | 50% |
Δ629–636 | ↑↑↑ | 否>C | ↓↓ | ↓ | ↓ |
韩国 | ↓ | N<C | ↓↓ | – | ↓↓ |
KK公司 | ↑↑ | 否>C | ↓ | ↓ | – |
RK+KK | ↓ | N<C | – | ND(无损检测) | ND(无损检测) |
带正电残基在调节转录活性中的重要性(图a) 在使用双重或四重替换时得到确认(图a) ●●●●。为了消除核易位变化对各种AR突变体活性的影响,将它们融合到SV40-NLS(图b) ●●●●。这并不影响wtAR和KK蛋白的活性,它们在没有SV40-NLS的情况下已经转移到细胞核中(图c) ●●●●。Δ629–636和RK蛋白在没有SV40-NLS的情况下几乎具有唯一的细胞质部分(图c)[19]. 添加NLS有助于两个突变体的核移位(图a) 并且RK突变体的活性显著增加(图b) ●●●●。在染色模板上,但在瞬时转染中,NLS与KK突变体的融合降低了活性。原因尚不清楚。
用EGFP-NLS-RK进行的实验表明,残基R629和K630对于转移到细胞核是必需的,但对于AR的反式激活特性则不是必需的。这意味着AR的核定位是雄激素诱导的完全反应所必需的,但是这也意味着雄激素诱导反应的核定位629RKLKK公司633模体在AR的反式激活机制中具有额外的独立作用。
DNA结合与核内迁移
AR通过雄激素反应报告基因进行转录激活的一个明显必要步骤是直接结合DNA。这个629RKLKK公司633该基序在体外明显参与AR与雄激素反应元件(AREs)的结合。令人惊讶的是,与wtAR相比,所有体外DNA亲和力降低的突变蛋白都具有更高的活性(表). 然而,当带正电的残留物在629RKLKK公司633基序全部被取代,蛋白质不再具有转录活性,即使被迫进入细胞核。这很可能是RK+KK突变体无法与ARE结合的结果(图b) ●●●●。
为了调和are体外亲和力的强烈降低与反式激活增加之间的关系,我们提出突变AR在雄激素调节增强子处循环更快。核受体(如糖皮质激素受体和雌激素受体)的“打-跑”机制现在已经建立[1,26,27]. 在这个模型中,受体只与启动子短暂相互作用(“hit”)。其他因素被招募,如染色质重塑复合物、组蛋白修饰复合物和转录机制的成分以时间调节的顺序方式[1,26,27]. 受体本身被激素反应元件(“run”)取代。这种快速的“打-射”循环可能会导致更快的招募,从而导致共激活物复合物的循环。更快的循环应该会导致ARE的RNA聚合酶II招募/启动增强。
为了研究629RKLKK公司633我们利用FRAP技术(图a–d)。为此,我们开发了稳定表达上述EGFP-NLS-AR蛋白的细胞系(Hep3B)。激素刺激1h后,所有稳定表达的蛋白主要定位于细胞核。在图中,wtAR的FRAP曲线显示了相对较慢的扩散和二次再分配,这表明该蛋白质同时具有流动和暂时不动部分。对于失去DNA结合的非活性AR突变体(A573D),只能计算出一个流动部分。在我们的FRAP实验中,将这种高流动性DNA结合突变体作为对照。这些数据与以前的报告一致[20].
实验数据的计算分析使我们能够证明wtAR分布在至少三个不同的部分之间:LIF、SIF和自由扩散部分(图e) ●●●●。以前已经证明其他转录因子在两个不动组分之间的分布[29]. 此外,对于AR Klokk等人[26]在染色质化MMTV-LTR启动子阵列上显示两个暂时不动的组分。通过特定AR突变体,我们提供了第一行证据,证明AR作用是通过与亚核结构的交替作用时间在亚核水平上进行调节的,并且这种调节是由铰链区域N末端的带正电残基维持的(表).
基于DNA结合与FRAP数据之间的相关性629RKLKK公司633基序突变体,不动组分的差异很可能是由改变的DNA结合特性来解释的。DNA结合缺失导致AR自由迁移。较低的体外DNA结合亲和力与两种流动组分的减少相关。我们提出LIF与体外DNA高亲和力之间的联系,因为参与强DNA结合的残基R629和K630对LIF也是必不可少的。根据所提供的数据,我们无法排除AR的长不动部分和短不动部分背后的机制。
转录活性增加和DNA结合亲和力降低与LIF中停留时间缩短之间的相关性支持我们的理论,即响应元件的更快循环导致更高的活性(表). 解释这些明显矛盾的一个可能的假设是我们所说的“锚理论”。在最近提出的一个模型中,序列特异性结合蛋白可以在细胞核中快速扩散,并在很短的时间内与染色质非特异性结合[30]. 或者,它可以沿着染色质纤维滑动,直到遇到特定的位点,从而产生更稳定的结合。在我们的锚定理论中,我们建议629RKLKK公司633基序是染色质中DNA相互作用的稳定剂。这可以解释为什么RK和KK突变体对ARE的亲和力降低,LIF和SIF降低。例如,其中一个组分可能含有对染色质进行ARE扫描的受体。
确实很容易推测,不动部分代表DNA或染色质结合受体。然而,不同固定组分之间的AR分布和组成可能不仅取决于DNA结合。看看不同的共激活剂在不同的固定组分中的作用是什么,这将是一件有趣的事情。
转录产物复合物很少在启动子上形成[1,30]. 转录启动需要发生特定的事件序列。每一个这样的事件都是许多快速的随机和短暂的因素碰撞的结果,这些因素都是无效的[1,30]. 事实上,两种固定组分LIF和SIF之间的差异可以通过AR和共同调节器之间的相互作用来解释。我们引入的突变可能对铰链相互作用的协调剂有不同的影响。事实上,大量的共调节因子已被证明在与铰链重叠的位点与AR相互作用,包括共激活因子[10,31–38],也包括共加压剂[10,31,39]. 此外630KLKK公司633基序可以改变共同调节因子p300、HDAC1和NCoR的结合[10,31]. AR的铰链区域可以通过磷酸化、乙酰化、SUMO化、neddylation和泛素化进行修饰,这些共价变化影响受体的稳定性、亚细胞定位以及与其他蛋白质的相互作用[40,41]. 众多可能的交互伙伴可以产生不同的复合物,每个复合物都有自己的移动性和交易激活潜力。
总的来说629RKLKK公司633AR铰链区的基序是一个多功能结构域,它整合了核定位、受体稳定性、DNA结合、反式激活电位和核内流动性(表). 在这项研究中,我们定义了629RKLKK公司633这些过程中的主题。减少DNA结合但保留活性的突变表明核内流动性增加。我们提供的第一行证据表明,AR作用是通过与亚核结构的交替作用时间在亚核水平上调节的,并且629RKLKK公司633铰链区的基序在这些过程中起着至关重要的作用。目前,这些不同组分的特征尚不清楚,但DNA/染色质的相互作用而非辅激活剂的招募似乎是主要因素。