吉西他滨对胰腺癌患者免疫细胞的影响

细胞表面标记

解冻五个提取日期中每一个提取日期的一等分样品，然后用荧光结合抗体对单核细胞进行染色，并用FacsCalibur LSR流式细胞仪进行分析。淋巴细胞和单核细胞的门控策略基于前向光散射（大小）和90°侧面散射（粒度），与临床样本相同。FITC和PE结合小鼠IgG₁而抗CD3-FITC和抗CD4-PE作为设置象限的阳性对照。数据表示为每个标记的阳性染色细胞百分比，减去IgG1背景。对细胞因子抗体进行滴定，以确定低本底染色最大检测的最佳浓度。按照制造商推荐的浓度使用细胞表面标记抗体。所有抗CD荧光偶联单克隆抗体试剂、抗人细胞因子；即IL-4、IL-10、IL-12和IFNγ；小鼠IgG等型-FITC和等型-PE结合对照来自BD Biosources。BDCA试剂来自Miltenyl Biotech。类似的策略用于细胞门控，以测量细胞内细胞因子生成的染色。

细胞内染色以产生细胞因子

细胞与抗CD3和抗CD28共同培养24小时，然后染色细胞内细胞因子的表达。解冻五个提取日期中每个日期的一等分单核细胞，在RPMI 1640中洗涤，并在2×10培养⁶/在24孔板的2 ml孔中加入含有5%FBS和庆大霉素的RPMI 1640。两个孔作为“非刺激”对照，而两个孔接受2μg/ml抗CD3和5μg/ml抗CD28。在收获细胞前6小时，每毫升添加0.75μl莫能菌素（GolgiStop，PharMinen），以增强细胞内细胞因子的积累。采集的细胞按照制造商的单核细胞胞内染色方案进行处理（Cytofix/Cytoperm，PharMinen）。针对干扰素γ（IFNγ）的PE结合抗体用于枚举Th1细胞，IL-4用于枚举Th2细胞，IL-12用于枚举激活的单核细胞。细胞内细胞因子染色与FITC-结合抗CD3染色相结合，以确定T细胞反应。用PE结合的IgG1测定背景染色，并从抗细胞因子染色的细胞中减去背景染色。

抗原呈递

为了研究吉西他滨治疗对T细胞抗原提呈反应的影响，在负载胰腺癌细胞抗原的树突状细胞刺激后进行elispot试验。树突状细胞是从4×10的6孔板中分离的贴壁细胞中产生的⁶用DMEM/F12培养基加20%FBS、2 mM谷氨酰胺和庆大霉素加1000单位/ml GM-CSF（Immunex/Berlex Laboratories）和500单位/ml IL-4（R&D Systems）培养新鲜单核细胞。将每种树突状细胞制备物中的非粘附细胞储存在培养物中，以便在成熟树突状上皮细胞的抗原负载后使用。6至8天后，采集树突状细胞，在无血清AIM-V（Life Technologies/Invitrogen）中清洗，并在修改已发表的程序后，用从Capan2或mPanc96胰腺癌细胞系中分离的3μg/ml RNA进行替换[7–9]. 24小时后，采集树突状细胞，进行清洗，并用解冻和清洗后的非黏附细胞在AIM-V中重新植入，AIM-V补充100单位/ml IL-2（Immunex）和100单位/ml IL-7（R&D Systems）。在含有干扰素γ单克隆抗体的96周免疫斑点板中，淋巴细胞被激发前被刺激两次，共刺激三次。由于树突状细胞的生成和抗原装载需要7–9天的培养，因此第一次（第0天）和第三次抽吸（第7天）的非粘附细胞首先用第一次抽吸产生的树突状上皮细胞进行电镀，然后用第三次抽出产生的树突状上皮细胞重新刺激，并用第四次抽签产生的树突状细胞进行elispot试验。同样，第四次和第五次提取的非粘附细胞首先用第四次提取产生的“抗原”负载的树突细胞刺激（第14天），用第五次提取产生的树突细胞再刺激（第21天），并用第六次提取产生的树突细胞攻击（第28天）。

Elispot分析

根据已公布的方案，进行Elispot分析以列举被刺激产生IFNγ的细胞[10]. 用于elispot分析的抗IFNγ抗体从Endogen中获得，如规定（Pierce）。用新鲜抗原（RNA）负载的树突状细胞以大约15-20个淋巴细胞/树突状上皮细胞的比例对两次刺激的淋巴细胞进行三次激发。一组双刺激淋巴细胞的三倍培养物在elispot平板中未受到挑战，用作背景对照。将伴刀豆球蛋白A（1μg/ml）添加到另一组三倍培养物中，作为试验的阳性对照。使用ImmunoSpot平板读取器（Immuno斑点）读取平板，数据标准化为斑点（产生IFNγ的细胞）/10⁶细胞。

T细胞

临床白细胞计数（wbc），包括中性粒细胞和淋巴细胞的差异分析表明，大多数受试者在首次输注吉西他滨后，细胞绝对数量下降。此后，大多数受试者的这些数字趋于稳定，并保持在正常范围内（表1)，（图。​（图1a）。1a） ●●●●。到第28天，在第四次治疗后，淋巴细胞平均绝对数与治疗前相比差异无统计学意义(第页=0.16). CD3表达定义T细胞群。在某些情况下，T细胞的绝对数量最初减少，这反映了循环淋巴细胞数量的减少（图1b） ●●●●。在其他受试者中，T细胞的绝对数量最初没有变化，但在第三次治疗后下降。在9/10名受试者中，门控淋巴细胞群中的T细胞百分比在健康成人的平均范围内[11]（图。​（图2a）。2a） ●●●●。吉西他滨治疗后，T细胞比例与其他淋巴细胞亚群的关系没有持续变化。最初T细胞百分比低于正常值的9号受试者在第一次使用吉西他滨治疗后T细胞增加，随后在随后的治疗中急剧下降。受试者T细胞的变化反映在CD4水平的类似变化中（图2b） ，以及CD8水平的反向变化（图2c） 这导致CD4/CD8比率大幅下降（图2d） ●●●●。对十名受试者的数据进行统计分析后发现，CD3淋巴细胞的百分比没有显著变化（图2e） 或CD8子集（图2g） ，但在初始剂量吉西他滨后第7天，CD4+T细胞百分比显著增加，第页=0.011（图2f） ●●●●。在第二次服用吉西他滨后，这一平均增加值下降，但与在第0天、第3天或第21天再次观察到的10名患者的初始CD4百分比没有显著差异。总的来说，CD4/CD8比率在治疗期间没有显著变化（图2h） ●●●●。

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图1

大多数受试者的绝对淋巴细胞数最初下降，然后在治疗过程中趋于稳定。一每个受试者的淋巴细胞绝对数量。b条CD3的绝对数⁺每个受试者在治疗期间的淋巴细胞。c（c）CD20的绝对数⁺每个受试者在治疗期间的淋巴细胞。请注意，第0天的数字来自于初始治疗前第4天至第10天进行的淋巴细胞差异，而CD3和CD20百分比则通过第0天抽血的流式细胞术分析获得

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图2

吉西他滨初始治疗增加了CD4的比例⁺T细胞显著，T细胞整体或CD4/CD8比值无明显变化。一CD3的百分比⁺在治疗过程中研究了每个受试者的T细胞。b条CD4细胞⁺T细胞，第7天，*第页=0.011.c（c）CD8（CD8）⁺T细胞。d日CD4/CD8比值。e（电子）CD3的平均±2标准误差⁺T细胞。（f）CD4的平均±2标准误差⁺T细胞。克CD8的平均±2标准误差⁺T细胞。小时CD4/CD8比值的平均±2标准误差

B细胞

CD20表达定义了B细胞系的淋巴细胞。首次输注吉西他滨后，大多数受试者的B细胞绝对数量下降，随后大多数受试对象的B细胞数量趋于稳定，但有一个显著的例外（图1c） ●●●●。在9/10名健康成人的淋巴细胞门检测到的抗CD20的B细胞亚群在正常比例范围内。9号受试者的T细胞比例低于正常值，其B细胞水平相对较高，在吉西他滨治疗后下降（图三a） ●●●●。在吉西他滨治疗期间，十分之七的受试者的B细胞比例下降，预处理（第0天）到第21天之间平均下降32%（图三b） ●●●●。吉西他滨治疗后10名受试者的B细胞百分比平均下降；但未达到统计学显著性，第页=0.19.

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图3

吉西他滨对循环髓系树突状细胞前体有显著影响，但CD20的变化⁺B细胞水平未达到显著水平。一CD20的百分比⁺在治疗过程中，每十名受试者的B细胞。b条CD20的平均值±2 SE⁺B细胞。c（c）BDC-1的百分比⁺单核细胞门检测到循环细胞。d日BDCA-1的平均值±2 SE⁺单核细胞，第3天减少*第页=0.002：第14天，增加21天*第页=0.002.e（电子）BDCA-3的百分比⁺单核细胞门检测到循环细胞。（f）BDCA-3的平均值±2 SE⁺单核细胞，第3天增加*第页=0.011

树突状细胞前体

BDCA-1或CD1b的表达定义了髓系树突状细胞前体的大多数亚群。BDCA-1型⁺在首次输注吉西他滨后，单核细胞门检测到的细胞水平急剧下降，大多数受试者在7天后恢复，然后随着进一步治疗继续增加（图三c） ●●●●。BDCA-1在第3天的百分比下降与第0天的水平显著不同，第页=0.002，第7天，第页=0.011，在第14天和第21天，第页=0.002（图三d） ●●●●。然而，第0天、第7天、第14天和第21天的平均水平没有显著差异。BDCA-3定义了一个被命名为MDC2的髓系树突状细胞亚群。BDCA-3型⁺在首次吉西他滨治疗后3-4天，也在单核细胞门检测到的树突状细胞表现出显著的相互增加，第页=0.011，然后在第7、14和21天下降到与第0天没有显著差异的水平（图三e、 f）。

功能性免疫细胞亚群

所研究的特定功能和调节亚群是那些如果免疫治疗与吉西他滨联合使用可能在肿瘤免疫反应中发挥作用的亚群。

抗原呈递细胞

CD86和CD80作为抗原提呈细胞上的共刺激分子。在吉西他滨治疗之前，CD80表达正常，单核细胞门中表达CD80的细胞少于0.2%。在第一次治疗后的3-4天内，该水平持续升高，通常是几倍，然后下降到接近正常水平，八分之五的受试者保持在该水平，或在第二次治疗后其余三名受试者的水平出现不同程度的升高（图4a） ●●●●。CD86表达也在正常范围内，未经治疗的受试者68-97%的单核细胞显示阳性表达（图4b） ●●●●。CD86的百分比⁺八名受试者的细胞在整个治疗过程中保持稳定，没有显著变化。

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图4

吉西他滨治疗胰腺癌患者对表达CD80和CD86的抗原呈递细胞几乎没有抑制作用。CD80和CD86的表达通过流式细胞术在单核细胞门定量

激活/记忆单元

不同受试者在吉西他滨治疗的不同时间点，CD69淋巴细胞的百分比表现出不同的效果（图5a） ●●●●。统计分析显示，CD69的百分比平均增加⁺第21天的细胞与所有早期提取的细胞显著不同，第页=0.027，尤其是第7天，第页=0.011和14，第页=0.011，（图5b） 表明细胞活化增加。

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图5

吉西他滨治疗胰腺癌患者对循环激活的记忆淋巴细胞有显著影响。一CD69的表达在大多数受试者中差异很大。b条10名受试者CD69表达的平均±2 SE显示CD69显著增加⁺第三次输注吉西他滨后第21天、第7天细胞数*第页=0.027.c（c）CD45RO总水平⁺大多数受试者在第一次输注吉西他滨后，细胞数首次增加，下降到低于基线水平（第0天）。d日10名受试者CD45RO表达的平均±2 SE显示CD45ROs显著降低⁺第二次和第三次注射吉西他滨后第14天和第21天、第7天的细胞*第页=0.011.e（电子）CD3的百分比⁺，CD45RO⁺在治疗过程中研究了10名受试者的T细胞。（f）治疗期间，10名受试者表达CD45RO的CD3+细胞的平均±2 SE显著变化，首次输注后第7天增加*第页=0.033; 在持续治疗的第14天和第21天，该值随后下降*第14天，第页=0.011; * 第21天，第页=0.011,克CD45RA的变化⁺单元格，或小时在CD4中⁺，CD25⁺T细胞未达到显著水平

CD45RO淋巴细胞数据显示第7天记忆细胞的比例增加，第页=0.033，逐渐下降，在第14天和第21天达到显著水平，第页=0.011（图5c、 d）。考虑到吉西他滨治疗可能会显著影响CD45RO细胞的特定亚群。对CD3、CD45RO、CD4、CD45RU、CD8、CD45RAO和CD20、CD45REO双阳性亚群进行评估。仅在CD3、CD45RO亚群中发现显著变化，第页=0.033，第二次输注后下降，表明吉西他滨减少记忆T细胞，第页=0.011（图5e、 f）。吉西他滨治疗期间，CD45RO双阳性亚群CD4、CD8或CD20的百分比没有出现统计学意义的变化（未提供数据）。类似地，未分化CD45RA亚群细胞的百分比没有显著变化（图5g） ，第页=0.27.

调节性T细胞

最近的研究表明，吉西他滨治疗对CD4、CD25双阳性T细胞亚群的调节作用[12–15]. CD4的百分比⁺CD25型⁺未经治疗的胰腺癌患者的T细胞范围为<2到8。在一些受试者中，CD4⁺CD25型⁺在治疗过程中，T细胞增加了三分之一至两倍。在其他情况下，CD4的百分比⁺CD25型⁺T细胞变化不大或有所下降（图5h） ●●●●。总的来说，没有统计上的显著变化，第页=0.36.

T细胞活化后细胞因子的产生

研究了吉西他滨对现有免疫细胞功能和免疫细胞活化能力的影响。细胞因子的表达通过细胞内染色研究（有和无T细胞激活）进行测量。使用抗CD3和抗CD28来触发通常介导T细胞受体对抗原刺激反应的途径。在吉西他滨治疗之前和期间，对活化细胞的数量进行了计数。大多数受试者在首次输注吉西他滨后3-4或7天，产生IFNγ的T细胞数量增加（图6a） ●●●●。在3周的治疗过程中，产生IFNγ的T细胞数量波动，但在21天时，大多数受试者的水平仍略有升高。然而，这十名受试者产生IFNγ的T细胞的平均变化没有统计学意义，第页=0.19，（图6b） ●●●●。在没有激活的情况下，不到1%的T细胞在治疗前或治疗期间表达任何测试的细胞因子（数据未显示）。虽然观察到产生IL-10和IL-4的活化T细胞数量的变化，但在首次注射吉西他滨后3-4天，在产生IL-10的细胞数量可检测到的受试者中，唯一一致的发现是出现了抑制水平（图6c） ●●●●。尽管继续使用吉西他滨治疗，这些抑制的IL-10生成细胞数量通常在接下来的10天内反弹，并且通常恢复到接近预处理水平。

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图6

用抗CD3和抗CD28激活的T细胞显示，在吉西他滨治疗后，一些受试者的γ-干扰素细胞内表达增加，对IL-10表达有明显的交互作用。一治疗前后T细胞活化IFN-γ表达的细胞内检测。b条激活与非激活T细胞中IFN-γ表达的平均±2 SE。表达水平的平均变化没有达到显著性。c（c）10名受试者活化T细胞中IL-10表达的细胞内检测。平均变化也没有达到显著性

这项工作得到了礼来研究实验室和沃兹沃斯基金会的部分支持。