化疗拓宽了细胞毒性CD8所见肿瘤抗原的范围⁺体内T细胞

小鼠肿瘤细胞系

AE17是一种恶性间皮瘤（MM）细胞系，来源于注射石棉（青石棉）纤维后的C57BL/6J小鼠腹腔[21]. 将AE17细胞注射到幼年小鼠体内导致MM肿瘤，其组织学与人类MM相似[21]. AE17sOVA是通过转染带有分泌性卵清蛋白（sOVA[21]). 将AE17细胞维持在由RPMI 1640（Invitrogen）组成的培养基中，该培养基补充有10%胎牛血清（FCS；Invitrogen，奥克兰，新西兰）、50μg/ml庆大霉素（Pharmacia，Bentley，澳大利亚）和60μg/ml苄青霉素（CSL，墨尔本，澳大利亚）。将转染的AE17sOVA肿瘤细胞系保存在添加400μg/L新霉素类似物G418（基因素；Invitrogen）的相同培养基中。细胞在37°C和5%CO中培养₂增湿的大气。所有细胞系均通过PCR常规检测支原体，且始终无感染。

化疗药物和白细胞介素-2

吉西他滨（美国印第安纳波利斯礼来公司）是一种抗代谢药物，可防止细胞制造或修复DNA，而顺铂（美国布里斯托尔·迈耶斯-斯奎布公司）则是一种铂类化合物，可交联DNA，防止细胞分裂。接受吉西他滨的小鼠每3天接受一次之前报告的最大耐受剂量为120μg/g体重/剂量，共五次[22,23]. 顺铂以6μg/g体重/剂量给药，每周一次，分三次给药[24]. 每只小鼠通过腹腔注射接受300μl吉西他滨或顺铂稀释在PBS中。重组人IL-2（Cetus Corporation，Emeryville，California，USA）在PBS中稀释至所需浓度，并通过26-G针头直接注入肿瘤中100μl。

细胞活力检测

AE17sOVA细胞以5×10接种于96周板（美国Becton–Dickinson）中^三每个孔的细胞数。37°C，5%CO中24小时后₂将每种化疗的100μl系列稀释液添加到微孔中，并在37°C和5%CO中培养₂，持续24小时。然后用50μl的2 mg/ml的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴在PBS中处理每个孔，并在37°C的黑暗中培养4小时。在25°C下以1000 rpm离心5分钟后，用100μl二甲基亚砜处理细胞颗粒，并在室温下在黑暗中连续摇晃培养30分钟。使用Biorad 3550微孔板阅读器在595 nm处读取微孔。

体内肿瘤生长

使用胰蛋白酶采集80%融合的AE17sOVA肿瘤细胞，并在PBS中洗涤两次以备注射。活率始终大于90%。小鼠左侧皮下注射5×10⁵100μl PBS中每只小鼠的AE17sOVA肿瘤细胞数。定期监测肿瘤生长，并使用微脂质对肿瘤进行测量。当肿瘤直径为140 mm时，使用甲氧氟烷（美国国际医学发展）杀死小鼠²符合AEC的要求。

采集肿瘤和器官进行FACS染色

使用甲氧氟烷杀死小鼠，并切除肿瘤和器官。对于FACS分析，通过在两个磨砂玻璃载玻片之间轻轻捣碎肿瘤和器官，通过30μm尼龙网（BD Falcon）过滤去除碎屑，以1200 rpm离心细胞6分钟，并将细胞颗粒重新悬浮在PBS/2%FCS中，获得单细胞悬浮液。在相关情况下，使用裂解缓冲液（1 M Tris–HCL，pH 7.2）裂解红细胞。

FACS染色和分析

细胞在PBS/2%FCS中清洗，调整为1×10⁶/ml和200μl/孔，转移到96 well板（BD Falcon）中并染色以进行FACS分析。PI和膜联蛋白V染色按照制造商的说明进行（BD Pharmingen）。使用的抗体包括抗小鼠CD8（克隆53-6.7，BD-Pharmingen）、抗小鼠CD11c（克隆N418）、抗鼠F4/80（克隆BM8）、抗鼠MHCⅠ类（克隆AF6-88.5）和抗鼠MHCⅡ类（克隆AF6-120.1），均来自Biolegend。以5μg/ml的浓度使用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）。细胞与抗体在4°C下孵育15分钟至1小时，和/或与DAPI在室温下在黑暗中孵育15min。所有样品在PBS中清洗，并使用Diva（BD Biosciences）在FACS Canto II（BD生物科学，CA）上分析或FlowJo软件（美国俄勒冈州Treestar）。

肽类

优势肽OVA_257–264（SIINFEKL）和两种亚优势肽OVA_55–62（KVVRFDKL）[25]和OVA_176–183（NAIVFKGL）[26]以及一种隐蔽肽OVA_11–18（CFDVFKEL），由细胞和分子生物学中心（西澳大利亚大学珀斯分校）制造，纯度>89%。

肿瘤抗原交叉呈现的体内分析

如前所述，对5,6-羧基琥珀酰亚胺基荧光素酯（CFSE；Molecular Probes，Eugene，USA）进行标记[27,28]. 简言之，将来自TCR转基因OT-1小鼠的淋巴结（LN）细胞以2×10重新悬浮在RPMI中⁷细胞/ml，并在室温下用2.5μM CFSE（DMSO中的5 mM储备溶液）培养10分钟。细胞通过FCS底层清洗两次，单独清洗PBS两次，1×10⁷将细胞静脉注射到每个受体小鼠体内。CFSE标记的细胞在过继转移后24小时从次级淋巴器官中回收，并且CD8⁺细胞经FACS分析。将数据作为分裂指数进行分析，该指数显示了反应细胞经历的分裂数，并作为增殖指数进行分析。在该指数中，所有世代的细胞总数除以原始亲本细胞的数量。

CTL功能的体内分析

在本研究中，我们使用了我们之前描述的“3峰”体内CTL检测[27]. 简单地说，对来自C57BL/6J混合脾脏和淋巴结细胞悬浮液的红细胞进行裂解，清洗细胞，然后将其分为三个群体。一个群体被10个⁻⁶ 其中一个肽的M和第二个群体用10脉冲⁻⁶ 另一种肽（如结果部分所述）在37°C下放置90分钟，然后在PBS中洗涤，并分别标记高（5μM）或低（0.05μM）CFSE浓度。用中等浓度的CFSE（0.5μM）标记对照未涂层靶细胞（第三群体）。静脉注射，1×10⁷将每个群体的细胞混合在每个受体小鼠200μl PBS中。通过收集静脉注射后16–18小时受体小鼠的排泄LNs（DLN）、非排泄LNs（非DLN）和脾脏，以及通过流式细胞术检测差异标记的荧光靶细胞群，来确定特定的体内细胞毒性。

体外肽再刺激

将从脾脏和DLN制备的单细胞悬浮液汇集在一起，用CFSE标记并在1×10培养⁶细胞/孔中含有不同浓度的SIINFEKL、KVVRFDKL或NAIVFKGL。3天后，样品用抗CD8抗体染色，用2%多聚甲醛在4°C下固定15分钟，用PBS/2%FCS/0.1%皂苷渗透15分钟，并在4°C下用抗小鼠IFN-γ（克隆XMG1.2，Biolegend）在黑暗中染色30分钟。样品在PBS中洗涤，并用FACS分析。

CD8消耗

在化疗治疗之前，每天腹腔注射两次剂量（150μg/剂量）的YTS-169（欧洲动物细胞培养物收集中心；ECACC，英国索尔兹伯里），并持续三次剂量/周（100-150μg/次），持续2周。FACS分析显示CD8⁺细胞耗竭有效率为95-99%（数据未显示[21]).

顺铂和吉西他滨在体内产生抗间皮瘤活性

虽然上述数据表明，顺铂和吉西他滨在体外对小鼠间皮瘤细胞都有直接毒性，但由于穿透肿瘤微环境的浓度未知，它们在体内的作用可能不同。因此，我们接下来的目标是确定一种明显诱导肿瘤退化的治疗方案。给荷瘤小鼠单剂量或多剂量顺铂或吉西他滨（图2a） 使用先前描述的方案[23]并监测肿瘤生长情况。单剂量顺铂并没有显著改变存活率（图2b） 或肿瘤生长率（图2c） ；然而，将治疗次数增加到每周三次，显著减缓了肿瘤生长，治愈了50%的小鼠（图2b、 c）。相比之下，即使是单剂量的吉西他滨也能减缓肿瘤生长，而五次多次给药也能改善这种效果（图2d） 50天后，小鼠100%无瘤（图2b） ●●●●。这些数据表明肿瘤细胞在体内死亡。DAPI染色显示，两种剂量的化疗均可在肿瘤微环境中诱导显著的细胞死亡（图2e） ●●●●。

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图2

顺铂和吉西他滨在体内发挥抗间皮瘤活性。对携带AE17sOVA的小鼠进行单剂量或多剂量治疗(一)顺铂（Cis；6µg/g/剂量）或吉西他滨（Gem；120µg//剂量）。生存(b条)以及顺铂后的肿瘤生长(c（c）)或吉西他滨(d日)被监测；箭头代表化疗剂量。数据来自三个实验中的一个代表性实验；每个实验组有5只小鼠；c和d中的数据显示为平均值±SEM。在一项单独的体内实验中，在第二剂量顺铂或吉西他滨治疗4天后切除的肿瘤被分解成单细胞悬浮液，并用DAPI和F4/80染色以证明肿瘤细胞死亡⁺（F4/80⁺巨噬细胞占肿瘤细胞的30%以上）。肿瘤细胞在F4/80中富集^否定DAPI染色检测人群(e（电子）)：每组三只小鼠的一次实验数据显示为平均值±SEM* 第页 < 0.05, ** 第页治疗组与PBS治疗对照组比较<0.01

顺铂和吉西他滨略微增强AE17sOVA间皮瘤模型中肿瘤抗原的表达

AE17sOVA已稳定转染标记物或“间谍”抗原（卵清蛋白；OVA），以便分析肿瘤抗原特异性免疫反应。在这一系列实验中，CFSE标记的OVA-特异性CD8的增殖⁺来自OT-1 TCR小鼠的T细胞被用作实时体内肿瘤抗原向CD8呈递的指示物⁺DLN中出现的T细胞。请注意，OT-1 T细胞对OVA的显性表位即SIINFEKL作出反应。

在过继转移CFSE标记的OT-1细胞和24小时后的FACS分析之前，给予两种剂量顺铂或吉西他滨的AE17sOVA荷瘤小鼠待4天恢复（图三a） ●●●●。对从DLN制备的分离细胞进行CD8染色和门控⁺电池（图三b） ●●●●。增殖性CD8⁺OT-1细胞通过其CFSE表达进行鉴定（图三c–f）。失去亲代峰值（即OT-1细胞，如图所示，这些细胞根本没有增殖三c–f）说明抗原呈现的质量。在给予OVA蛋白的阳性对照小鼠的DLN中，父母峰和大多数子峰完全消失（图三c） 这意味着所有转移的OT-1细胞都必须被激活和增殖，因此具有强大的抗原提呈能力。注意，如我们之前所示，肿瘤抗原很容易在这个模型中出现[21]. 数据作为增殖指数进行分析，其中所有世代的细胞总数除以原始亲本细胞的数量。随着化疗的进行，增殖指数呈增加趋势（图三g） ；然而，这一差异并没有达到统计学意义。数据也作为分裂指数进行分析，以显示反应细胞经历的分裂数。分裂指数显示，从化疗小鼠中回收的OT-1细胞比PBS治疗组多分裂一次或两次（补充图1，在线提供）。综合起来，这些数据表明化疗略微改善了CD8的肿瘤抗原表达⁺CTL。这一观察结果可能是由于肿瘤浸润CD11c的比例略有增加所致⁺化疗期间发现的树突状细胞（DC）（补充图2a，在线获取）表达较高水平的MHC I类分子（图三h） ●●●●。有趣的是，CD11c上MHC II类分子的表达⁺化疗期间DC减少（补充图2b，在线）。

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图3

顺铂和吉西他滨与体内肿瘤抗原呈递。AE17sOVA荷瘤小鼠分别给予PBS、顺铂（Cis）和吉西他滨（Gem）两种剂量，静置4天后，再静脉注射1×10⁷CFSE标记的OVA-特异性CD8⁺OT-1 TCR小鼠T细胞(一). 20小时后，收集引流淋巴结（DLN），将其分解为单细胞悬浮液，并对其进行CD8表达染色。通过CD8上的门控来分析增殖的OT-1细胞⁺单元格(b条). OVA处理小鼠的代表性直方图(c（c）)、PBS(d日)，吉西他滨(e（电子）)或顺铂(（f）)如图所示。显示增殖指数的汇总数据，其中所有世代的细胞总数除以原始亲本细胞的数量(克)用于说明抗原呈现质量的变化；数据来自五只对照小鼠的一次实验，每个化疗组四只小鼠，再加上两只接受完整OVA蛋白治疗的小鼠。在另一项实验中，肿瘤相关CD11c⁺在第二次给药4天后，用流式细胞术检测给予两次化疗或PBS的小鼠树突状细胞中MHCⅠ类表达水平（MFI）的变化(小时); 汇总数据来自每组三只小鼠的一次实验。所有汇总数据均显示为平均值±SEM

吉西他滨促进肿瘤特异性T细胞浸润

还评估了肿瘤浸润免疫细胞的变化。与PBS对照组相比，接受顺铂或吉西他滨治疗的小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的比例降低（补充图3a，在线提供）。然而，值得注意的是，对照组肿瘤相对于化疗组小鼠的肿瘤较大。CD8上的选通⁺细胞（在线补充图3b）显示肿瘤浸润CD8的比例⁺与对照组相比，化疗组小鼠的细胞数量减少（补充图3c，在线）。在PBS治疗和顺铂治疗小鼠的肿瘤中，几乎没有发现OT-1 T细胞。相反，用吉西他滨治疗的小鼠四种肿瘤中有两种肿瘤的OT-1细胞水平升高；即大于CD8的5%⁺T细胞为OT-1细胞（补充图3d，在线）。

对显性表位SIINFEKL的CTL反应减少

上述数据并未显示显性OVA的体内呈现显著增加_257–264卵巢抗原表位，SIINFEKL，在DLN中。然而，OVA表达几种已知的与MHC I类H-2K结合的表位^b条小鼠在C57BL/6J背景下表达的分子。本研究中使用的另外两个表位因其诱导弱CTL反应的能力而被归类为次优势表位，称为OVA_55–62KVVRFDKL公司[25]和OVA_176–183NAIVFKGL表位[26]. 虽然由于缺乏试剂，无法像上述研究那样在体内测量亚显性表位的抗原呈递，但可以研究体内CTL功能的变化。因此，接下来的一系列实验检测了接受或不接受两次化疗的AE17sOVA荷瘤小鼠对所有三个表位产生的体内CTL反应。进一步的对照组包括幼稚小鼠（图中没有肿瘤小鼠）4a） ●●●●。这是通过体内CTL试验实现的，该试验涉及制备只能被特定于每种感兴趣肽的CTL识别的靶细胞；也就是说，靶细胞携带表面MHC I类分子上的肽；因此，当用流式细胞术分析时，可以看到它们因CTL的杀伤而消失。

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图4

化疗显示CTL的肿瘤抗原范围更广。如上所述，给AE17sOVA荷瘤小鼠服用或不服用两种剂量的顺铂或吉西他滨。最后一次化疗四天后，所有组的小鼠均静脉注射靶细胞。靶细胞为混合LN细胞，脾细胞取自C57BL/6J幼年小鼠，分为三个群体。体外用高浓度CFSE标记SIINFEKL脉冲群。第二个群体用一种次优势肽进行脉冲处理，并用低CFSE浓度进行标记。没有用中等浓度的CFSE标记肽对照靶细胞。将这三个群体合并并静脉注射到小鼠中，用于18小时后器官的FACS分析；显示了无肿瘤控制的代表性直方图(一)，AE17sOVA PBS处理(b条)，AE17sOVA顺铂治疗(c（c）)和AE17sOVA吉西他滨治疗(d日). 靶细胞相对于对照组的丢失表明CTL被杀死。SIINFEKL显示了单个小鼠的数据(e（电子）)，KVVRFDKL(（f）)和NAIVFKGL(克). 每个实验组有三到五只小鼠，每个实验组各有两个实验的汇总数据显示为平均值±SEM。在另一个实验中，携带AE17sOVA的小鼠的CD8被耗尽⁺在顺铂或吉西他滨（gem；小时)化疗。按照图中的多剂量方案进行化疗2a、 消耗持续14天。每组5只小鼠的一个实验数据显示为平均值±SEM* 第页 < 0.05, ** 第页 < 0.01, *** 第页 < 0.001

在本试验中，从幼年C57BL/6J小鼠的LN和脾脏中提取的混合靶细胞被分为三个群体。用SIINFEKL对一个群体进行脉冲处理，并在体外用高浓度CFSE标记进行鉴定（图中显示为SIIN）4a–d）。第二个群体用一种次优势肽进行脉冲处理，并用低CFSE浓度标记（图中显示为KV）4a–d）。没有用中等浓度的CFSE标记肽对照靶细胞（如图中的参考4a–d）。在最后一次化疗剂量后4天，将这三个群体合并并静脉注射到小鼠体内。18小时后对分解的器官进行FACS分析（图4a–d）。

未涂层百分比之间的比率（参考峰如图所示4a–d）和肽包被靶点（KV或SIIN峰值如图所示4a–d）（CFSE^裁判/CFSE公司^{KV或SIIN或NAIV})计算每个小鼠的细胞毒性数值。为了使数据正常化，允许进行实验间比较，数据是相对于每个实验中包含的非肿瘤对照小鼠表达的。也就是说，通过测定非肿瘤对照小鼠和荷瘤小鼠中肽包被靶点的百分比之间的比率，并乘以100得出百分比值，从而计算相对杀伤。

如我们之前所示，PBS治疗的对照小鼠对SIINFEKL产生了强烈的CTL反应[21]. 相反，顺铂和吉西他滨治疗的小鼠在SIINFEKL特异性CTL反应中均表现出不同程度的降低，尽管具有统计学意义（图4e） ●●●●。

化疗显示CTL的肿瘤抗原范围更广

对两个亚显性表位的CTL反应分析表明，PBS治疗的AE17sOVA荷瘤小鼠对KVVRFDKL的反应非常微弱（图4f） ●●●●。这些数据表明，在正常肿瘤生长过程中，对该表位的CTL识别水平较低。顺铂而不是吉西他滨的治疗扩大了KVVRFDKL的特异性反应，十分之四的小鼠表现出显著的杀伤作用（图4f） ●●●●。相反，PBS治疗的小鼠对NAIVFKGL没有反应，而顺铂和吉西他滨在所有受试小鼠中都显著扩大了这种反应（图4g） ●●●●。这些数据表明，化疗扩大了CTL所代表的肿瘤抗原的范围。未发现对隐秘肽OVA有反应_11-18（CFDVFKEL：数据未显示）。

上述数据暗示CD8的作用⁺化疗期间的T细胞。通过消耗CD8证实了这一点⁺顺铂和吉西他滨治疗前和治疗2周的细胞。CD8缺失对顺铂的完全消融抗肿瘤反应和对吉西他滨的部分消融反应（图4h） ●●●●。这些数据清楚地证明了CD8的作用⁺顺铂和吉西他滨化疗期间的CTL细胞。

化疗激活的亚显性NAIVFKGL特异性CTL分泌IFNγ

进一步探讨显性和亚显性表位特异性CD8的作用⁺用SIINFEKL、NAIFKGL和KVVRFDKL肽中的每一种在体外刺激第二次化疗剂量后4天从小鼠收集的T细胞、脾脏和DLN细胞3天（补充图4a，在线提供）。数据表明，吉西他滨治疗可扩增CD8⁺NAIVFKGL特异性T细胞在刺激下增殖（补充图4b和c，在线提供）。顺铂治疗后SIINFEKL特异性CTL没有增殖，给予吉西他滨的小鼠反应很弱（数据未显示）。顺铂和吉西他滨治疗均引起CD8低水平IFNγ分泌增加⁺SIINFEKL特异性T细胞和NAIVFKGL特异性CTL中较高的IFNγ分泌（补充图4d和e，在线提供）。我们没有看到对KVVRFDKL刺激的反应（数据未显示）。综上所述，体内和体外数据表明NAIVFKGL特异性CD8的作用⁺T细胞，尤其是吉西他滨治疗小鼠的T细胞。体外研究中对SIINFEKL的最小反应支持体内观察结果，即化疗期间SIINFEQL反应减弱。

这项工作得到了西澳大利亚州癌症委员会和新南威尔士州尘肺疾病委员会的支持。