《维罗尔杂志》。1998年11月；72(11): 8586–8596.
新型Bcl-2相互作用蛋白Beclin对致死性Sindbis病毒性脑炎的保护作用
,1 ,1 姜慧慧,,2 ,三 ,2 ,2,†和1,* 肖焕亮
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
琳达·K·克莱曼
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
杰拉尔德·戈登
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
詹姆斯·戈德曼
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
盖尔·贝里
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
布莱恩·赫尔曼
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
贝斯·莱文
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
医学部1和病理学，三哥伦比亚大学外科医生学院，纽约州纽约市，邮编：10032，北卡罗来纳大学教堂山细胞生物学与解剖学系，北卡罗莱纳州教堂山，邮编：275992
†现住址：德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心细胞和结构生物学系，邮编78284。
摘要
bcl-2基因原型细胞抗凋亡基因减少了Sindbis病毒的复制，并导致小鼠大脑中Sindbis毒株诱导的凋亡，从而对致命性脑炎起到保护作用。为了研究Bcl-2保护中枢神经系统免受Sindbis病毒感染的潜在机制，我们进行了酵母双杂交筛选，以在成年小鼠脑库中鉴定Bcl-2相互作用的基因产物。我们鉴定了一种新的60-kDa线圈蛋白Beclin，我们使用荧光共振能量转移显微镜证实了其与哺乳动物细胞中的Bcl-2相互作用。为了检测Beclin在Sindbis病毒发病机制中的作用，我们构建了表达全长人Beclin（SIN/贝克林)，Beclin缺乏假定的Bcl-2-结合域（SIN/贝克林ΔBcl-2BD），或在5′末端（SIN）附近含有提前终止密码子的Beclin/贝克林停止）。SIN感染小鼠的存活率/贝克林显著高于SIN感染小鼠的存活率（71%）/贝克林ΔBcl-2BD（9%）或SIN/贝克林停止（7%）(P（P）< 0.001). SIN感染小鼠的大脑/贝克林与SIN感染小鼠的大脑相比，Sindbis病毒RNA阳性细胞更少，凋亡细胞更少，病毒滴度更低/贝克林ΔBcl-2BD或SIN/贝克林停止。这些发现表明，Beclin是一种新型的Bcl-2相互作用细胞蛋白，可能在抗病毒宿主防御中发挥作用。
细胞抗凋亡基因bcl-2基因代表一类新型抗病毒宿主防御分子，通过限制病毒复制和防止病毒诱导的细胞死亡发挥作用。Bcl-2在体外阻断包括Sindbis病毒在内的几种不同RNA病毒诱导的细胞凋亡(18,41)，流感病毒(13,26)，呼肠孤病毒(31)、塞姆利基森林病毒(34)、君越病毒(29)和日本乙型脑炎病毒(21). 此前，我们已经表明，Bcl-2在体内病毒感染的神经元中的过表达也可以保护小鼠免受由原型α病毒Sindbis病毒引起的致命脑炎的影响(17). Bcl-2对致命性Sindbis病毒性脑炎的保护作用与减少神经元凋亡死亡和中枢神经系统（CNS）病毒复制有关。在培养的AT3细胞中，Sindbis病毒感染期间观察到Bcl-2过表达的类似抗病毒作用(41)以及流感病毒感染MDCK细胞期间(26)、日本乙型脑炎病毒感染N18细胞(21)以及AT3细胞的Semliki Forest病毒感染(34). 尽管内源性Bcl-2在抗病毒防御中的作用尚待评估，但这些研究支持Bcl-2在保护细胞免受病毒感染方面可能很重要的假设。
以往大多数研究都是针对嗜神经RNA病毒（例如Sindbis病毒、呼肠孤病毒、Semliki Forest病毒、LaCrosse病毒和日本B病毒）来检测Bcl-2对病毒感染的影响(18,21,29,31,34,41). 虽然Bcl-2可能影响非嗜神经性病毒（如流感病毒）的病毒复制和病毒诱导的凋亡(13,26)在病毒感染重要的、不可再生的细胞群体（如神经元）时，宿主抑制凋亡的机制可能特别重要。在这种情况下，病毒诱导的神经元凋亡死亡可能导致中枢神经系统不可逆转的病理改变和宿主的死亡(1,17,19,25). 因此，虽然其他细胞类型中的凋亡可能是一种适应性宿主防御策略，可降低机体的总病毒负担（参考文献综述11,16,36、和39)，可能已经进化出独特的策略来控制CNS病毒复制，而不会导致受感染神经元的凋亡死亡。因此，在正常神经元发育过程中起防止细胞凋亡作用的细胞基因（例如。，bcl-2基因和bcl-x公司L（左）)（参考文献中审查23)可能在调节中枢神经系统病毒复制和防御嗜神经病毒诱导的细胞凋亡方面也很重要。
为了进一步了解细胞基因bcl-2基因在CNS病毒感染期间发挥抗凋亡和抗病毒作用，我们进行了酵母双杂交筛选，以确定成年小鼠脑中Bcl-2相互作用的基因产物。在本研究中，我们描述了一种新的Bcl-2相互作用基因产物的鉴定，我们将其命名为Beclin，因为其预测的线圈结构（因此，后缀为“-In”）及其与Bcl-2（Becl）的相互作用。与Bcl-2过表达一样，Beclin在体内神经元中的过表达可以抑制Sindbis病毒的复制，减少CNS凋亡，并对致命的Sindbis感染提供保护。缺乏假定的Bcl-2结合域的Beclin结构体不能提供保护，也没有抗病毒活性。因此，我们的发现确定了一种新的蛋白质，Beclin，它可能在宿主防御Sindbis病毒感染中发挥作用。此外，他们认为与Bcl-2样蛋白的相互作用可能对Beclin的保护活性很重要。
材料和方法
质粒。
构建哺乳动物细胞瞬时表达载体bcl-2基因，标记抗原表位的人类贝克林，和标记表位标签贝克林删除的核苷酸238至453被克隆到pSG5（Stratagene）中。为了构建病毒cDNA克隆，使用之前描述的神经毒力双亚基因Sindbis病毒载体dsTE12(17). 全长标志表位标记的人类贝克林，人类贝克林包含插入核苷酸位置270的终止密码子，人类贝克林包含核苷酸238至453的帧内缺失，人类bcl-2基因、和人类bcl-2基因在118位核苷酸上包含一个终止密码子的基因被克隆到Bst公司dsTE12产生质粒SIN的EII位点/贝克林、SIN/贝克林停止，SIN/贝克林Δbcl-2BD，正弦/bcl-2基因和SIN/bcl-2基因分别停止。为了构建酵母双杂交研究的载体，编码人类氨基酸（aa）1至218的序列bcl-2基因，第1至212页，共页bcl-x公司L（左），第1至149页，共页bcl-x公司秒，和1到171bax（巴克斯）在带有GAL4 DNA结合域的框架中克隆到pGBT9中。为了避免蛋白质靶向细胞核的困难，编码C末端跨膜结构域的序列bcl-2基因家庭成员被省略。从Clontech中获得含有层粘连蛋白（pLAM5′）和p53（pVA3）插入物的对照pGBT9质粒。
酵母双杂交筛。
酿酒酵母SFY526细胞与pGBT9共转化/bcl-2基因和106来自成年小鼠大脑文库的cDNA分子融合到GAL4激活域载体（pGAD10；Clontech）上，镀到缺乏色氨酸和亮氨酸的SD培养基上，在30°C下培养4天，然后通过菌落提升过滤试验筛选LacZ活性。推测的相互作用克隆是通过在leuB大肠杆菌进一步检测pGBT9和对照质粒。pGBT9之间的β-半乳糖苷酶阳性反应/bcl-2基因在10到15分钟内获得克隆F1。为了分析Beclin和Bcl-2家族成员之间的相互作用，pGBT9质粒含有bcl-2基因家庭成员与人类碎片共同转化贝克林（1至450、262至450和1至708）融合到pGAD424中的GAL4激活域，并筛选转化子以检测LacZ活性。
人类的序列分析贝克林。
小鼠部分核苷酸序列贝克林从测序克隆F1获得的克隆与从人类乳腺分离的重叠克隆GT197对齐(32). 紧邻预测开放阅读框上游和下游的引物被用于扩增人类的编码序列贝克林来自标准化人类婴儿大脑cDNA文库(37). 从几个独立反应中得到的PCR产物被克隆到pCRII中，并使用Sequenase（美国生化）和自动测序在两个方向上进行测序。使用BLAST算法，将得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列用于扫描各种数据库（GenBank、EMBL、SwissProt和PIR）中的同源序列(2). PROSITE程序也对氨基酸序列进行了分析，以确定功能基序，COILS程序则对线圈区域进行了分析(22).
Northern印迹分析。
人和小鼠多组织印迹（Clontech）与32P随机标记人类或小鼠贝克林探针（核苷酸1至485），如制造商（Clontech）所指示。通过与β-肌动蛋白探针杂交，证实了等负荷[2μg poly（A）RNA]。
重组病毒的生产。
病毒SIN/贝克林、SIN/贝克林停止，SIN/贝克林ΔBcl-2BD，SIN/bcl-2基因和SIN/bcl-2基因如前所述，从病毒cDNA克隆中生成stop(17). 简单地说，5′端转录物是由线性化的cDNA克隆合成的Pvu公司I（代表贝克林-包含病毒）或Xho公司I（代表bcl-2基因-含病毒），用SP6 DNA依赖的RNA聚合酶在体外转录，并根据制造商的说明使用脂蛋白转染BHK细胞。转染后20小时，收集转染细胞单层的含病毒颗粒的上清液，在70°C的等分溶液中冷冻，并用于所有后续实验。用斑块滴定法测定BHK-21细胞上的病毒滴度。
动物实验。
将10日龄CD1小鼠胎仔用每种重组病毒1000个PFU接种在0.03 ml Hanks平衡盐溶液中的右侧大脑半球。在死亡率实验中，将每种病毒分别接种三到六窝小鼠，并通过感染后3周内对小鼠的每日观察来确定死亡率。为了进行病毒滴定和组织病理学实验，每个实验组在接种后第1、2和4天处死3到6只小鼠。解剖右侧大脑半球并将其储存在−70°C下，使用冻融组织在Hanks平衡盐溶液中制备10%的匀浆，用于斑块分析滴定。左侧大脑半球用3%多聚甲醛浸泡固定。
组织病理学。
将装有副甲醛的小鼠大脑嵌入石蜡中，在嗅球水平切割一系列4μm的副矢状切面，从嗅球的尾部延伸至小脑和髓质。对每个大脑，连续切片用苏木精和伊红染色以检测组织病理学，原位末端标记（ISEL）检测凋亡细胞核，原位杂交检测Sindbis病毒RNA，免疫过氧化物酶检测flag-Beclin蛋白表达。ISEL和原位杂交采用与之前描述的SIN相同的方法进行/bcl-2基因-受感染的小鼠大脑(17). 免疫过氧化物酶染色检测SIN中flag Beclin蛋白的表达/贝克林-、SIN/贝克林ΔBcl-2BD-和SIN/贝克林根据制造商的说明，通过使用单克隆抗flag抗体M2（5μg/ml；VWR）和抗生物素-生物素过氧化物酶法（Vectastain ABC试剂盒；Vector Laboratories）来停止感染的小鼠大脑。
用Image-ProPlus软件定量每个脑切片中病毒RNA阳性和ISEL阳性细胞的数量。计算每个脑切片的阳性细胞数，不重叠0.25毫米2扫描整个大脑切片的显微镜视野，设置10倍客观恒定的亮度、对比度和阳性事件阈值。每个脑切片的阳性事件数（即RNA-阳性细胞或ISEL-阳性细胞）通过将所有分析的单个字段的总和相加来确定。每个大脑切片的阳性事件总数除以大脑切片的总面积，得出每平方毫米大脑中RNA阳性或ISEL阳性细胞的平均数量。
用843对成人海马和前皮质切片进行染色，这是一种针对人Beclin肽的多克隆抗体，对应于aa 1至15（1:200倍稀释；比利时Seraing的Eurogenetics），并用亲和素-生物素过氧化物酶法检测人类Beclin。
质粒转染。
质粒pSG5/bcl-2基因和pSG5/flag-贝克林或pSG5/bcl-2基因和pSG5/flag-贝克林根据制造商的说明，使用Superfect（Qiagen）将ΔBcl-2BD（每个1μg）瞬时转染到COS7细胞中。
蛋白质检测。
对于免疫荧光研究，COS7细胞在转染100%乙醇后24小时固定。用抗标记表位抗体（M2；1:20；VWR）和异硫氰酸荧光素（FITC）结合马抗鼠免疫球蛋白G检测鞭毛-贝宁和鞭毛-突变BeclinΔBcl-2BD突变体的表达。用多克隆兔抗Bcl-2抗体（1:100；Pharmingen）检测Bcl-2的表达罗丹明结合山羊抗兔抗体。SERCA（内质网钙2+ATPase）用抗SERCA抗体检测（1:500；Research Design，Inc.）。Western blot分析检测SIN感染BHK细胞中flag-Beclin的表达/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林使用M2抗体（20μg/ml）或抗人Beclin肽抗体843（1:200）进行ΔBcl-2BD，并按照制造商（Amersham）的指示进行增强化学发光检测。
法国。
荧光共振能量转移（FRET）显微镜如前所述，在与bcl-2基因和贝克林表达载体(9). 供体（FITC）滤光片组具有以下参数：激发（ex）=450至490nm；二向色镜（dm）=510nm；发射（em）=590长程。受体（罗丹明）滤光片组具有以下参数：ex=546nm；dm=580nm，em=590长程。使用这两个滤光片组获得的图像直接量化每个荧光团的强度。FRET滤波器组记录的信号（ex=450至490 nm；dm=580 nm；em=590 nm长通）来自从FITC转移到罗丹明分子的能量。前面描述的映射程序(9)用于绘制荧光细胞图并量化每个细胞内的强度。对这些映射图像进行定量分析需要求解三个方程，每个滤波器组一个方程，这三个方程解释了所有三个滤波器组中两个标签的激发和检测，以及供体和受体分子的浓度和转移概率。测量的数量表示如下，其中第一个字母（大写）表示滤波器组(A类，受体；F类，FRET；D类，downer）和第二个字母（小写）表示存在标签(一，仅受体；（f），受体和供体；d日，仅捐赠者）。方程的解是E类=1/[aconc(韩国+1）]，其中aconc=(AdFf−FdAf)/[(AdFa/Aa公司) −Fd公司];R（右）= (DaFf/Fa−Df)/[aconc公司((脂肪酸/脂肪酸) −FdDa/DdAa) −F=FdDf/Dd]; 和K（K）与两个标签的量子产率之比和两个标签绝对检测效率之比的乘积成正比。
结果
的标识贝克林，染色体17q21上的一个新基因。
以前，我们证明Bcl-2抑制Sindbis病毒复制并阻止Sindbis毒株诱导的小鼠神经元凋亡(17). 为了进一步了解Bcl-2保护神经元免受Sindbis病毒感染的机制，我们对成年小鼠大脑文库进行了酵母双杂交筛选，筛选出与细胞死亡抑制剂Bcl-2结合的互补DNA编码蛋白。我们构建了一个诱饵质粒（pGBT9/bcl-2基因)通过融合人类bcl-2基因（缺乏确保转位到细胞核的C末端信号锚定序列）到GAL4 DNA结合域，该结构域与GAL4激活域载体pGAD10中的寡核苷酸（dT）和随机六聚体鼠脑cDNA融合文库共转化。在100万个转化子中，一个阳性菌落被5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-吡喃半乳糖苷（X-Gal）过滤分析。对从该菌落（F1）中救出的cDNA质粒进行测序分析，发现GAL4激活域下游有一个42 bp的终止密码子，在核苷酸124和1843之间有几个预测的短开放阅读框，以及一个更长的预测开放阅读框（具有良好的Kozak一致序列和多个上游终止密码子）从核苷酸1855跨越到插入物的3′端。因此，14-aa融合蛋白要么与Bcl-2相互作用，要么下游的一个开放阅读框编码了一个含有自身激活域并与Bcl-2.相互作用的蛋白质。为了鉴定F1的Bcl-2相互作用区，我们将核苷酸1至1854和1855至2500融合到pGAD424中的GAL4激活结构域，并测试其与Bcl-2的相互作用。核苷酸1855至2500，但不是1至1854，编码与融合到GAL4 DNA结合域的Bcl-2相互作用的蛋白质（表)但不适用于含有p53、lamin的对照GAL4 DNA结合域质粒（表)或Sindbis病毒糖蛋白（数据未显示）。
表1
| GAL4激活域质粒b条 | β-半乳糖苷酶与GAL4结合结构域的反应一
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|---|
| 清空 | Bcl-2基因 | Bcl-x公司L（左） | Bcl-x公司秒 | Bax公司 | 拉明 | 第53页 |
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| 清空 | − | − | − | + | − | − | − |
| 一层楼 |
| 1–2563 | − | + | + | ND（无损检测） | − | − | − |
| 1–1855 | − | − | − | ND（无损检测） | − | − | − |
| 1856–2563 (穆斯贝克林1-708） | − | + | + | ND（无损检测） | − | − | − |
| 人类Beclin |
| 1–708 | − | + | + | ND（无损检测） | − | − | − |
| 贝克林1-450 | − | + | + | ND（无损检测） | − | − | − |
| 贝克林1–258 | − | − | − | ND（无损检测） | − | − | − |
| 贝克林262–450 | − | + | + | ND（无损检测） | − | − | − |
| 贝克林451–708 | − | − | − | ND（无损检测） | − | − | − |
| 贝克林1–1353 | − | − | − | ND（无损检测） | − | − | − |
数据库搜索显示，F1的核苷酸序列（1855至2500）与从默克EST（表位标签序列）数据库中的标准化婴儿人脑cDNA文库中分离的几个克隆的序列以及从人类乳房（GT197）中分离的克隆重叠(32)和人成纤维细胞（B32）(8). 这些克隆只包含一个新基因的部分开放阅读框，该基因用卷曲线圈编码蛋白质。如上所述，我们指定了名称贝克林由于其编码的蛋白质与Bcl-2的相互作用以及其编码的蛋白质的预测的卷曲螺旋结构。克隆GT197和B32都是在17q21染色体上乳腺癌易感性位点的转录图生成过程中分离出来的，并被定位到该基因约100kb着丝粒的区域巴西航空公司1在散发性上皮性卵巢癌中，它们位于Tangir等人绘制的400-kb最小缺失单元内(38).
我们将GenBank中重叠的部分克隆与我们的鼠标对齐贝克林序列以获得人类全长开放阅读框架的预测序列贝克林和孤立的人类贝克林来自标准化人类婴儿大脑cDNA文库(37). 人类贝克林预计编码一个新的450-aa，60-kDa蛋白，该蛋白包含一个与肌球蛋白类蛋白同源性为25-28%的卷曲-卷曲区域（图。). 它与小鼠在核苷酸水平上的同源性为93%，在氨基酸水平上的相似性为98%贝克林在酵母双杂交筛选中鉴定出的序列。人类Beclin也与秀丽隐杆线虫T19E7.3基因产品（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U42843”，“term_id”：“14574233”，“term_text”：“U42843”}}U42843电话)以及酿酒酵母基因产物Lph7p（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U43503”，“term_id”：“83853945”，“term_text”：“U43503“}}U43503型)（在145和137个残基上分别有38和37%的相同），表明进化保护程度很高。人类Beclin的PROSITE分析确定了几个潜在的糖基化、磷酸化和肉豆蔻酰化位点，但没有其他功能序列基序。
推导了人Beclin的氨基酸序列。方框区域表示人体Beclin的Bcl-2-结合域（表)，下划线区域对应于预计具有线圈构象的区域。
无处不在的贝克林mRNA在小鼠和人体组织中的表达。
检查组织特异性模式贝克林表达，我们将小鼠和人类多组织Northern印迹与贝克林-特定探针。RNA印迹分析显示贝克林mRNA在小鼠和成人组织中广泛存在（图。A） ●●●●。A类贝克林-特异性探针与2.2kb转录物杂交，该转录物在人类骨骼肌中含量最高，但在所有被检组织中都可以检测到。该转录本的大小与之前观察到的克隆GT197和B32的大小大致相同(8,32). 在一些组织中，观察到额外的1.7kb和1.4kb转录物，这表明存在选择性剪接转录物。
Beclin mRNA和蛋白表达。（A） Northern印迹分析贝克林mRNA在人和小鼠组织中的表达。sm.，小；m.，肌肉。（B） 用抗人Beclin肽的多克隆抗体对成人海马切片进行免疫过氧化物酶染色。箭头标记一个Beclin阳性神经元。放大倍数，×450。
Beclin在人类神经元中表达。
为了检测Beclin蛋白是否在神经元（Sindbis病毒感染的主要中枢神经系统靶细胞类型）中表达，我们对成人大脑切片进行了免疫过氧化物酶染色。我们使用兔免疫血清843，该血清是针对与aa 1至15相对应的人类Beclin肽生成的。843与BHK细胞制备的裂解液中的61-kDa蛋白发生反应，该裂解液是在感染含有标记人类抗原表位的重组Sindbis病毒后制备的贝克林插入（SIN/贝克林)（图。B） ●●●●。该蛋白迁移至SIN中用抗标记表位抗体检测到的主带/贝克林-感染的BHK细胞裂解物（图。A） 以及体外翻译的鞭毛-Beclin（数据未显示）。海马和额叶皮质人脑切片的免疫过氧化物酶染色显示，这些区域的许多神经元以及一些胶质细胞中存在Beclin免疫反应。在神经元中，Beclin显示出一种颗粒状、点状的染色模式，几乎只在核周区域发现（图。B） ●●●●。在血管中膜、室管膜细胞和脉络丛中也观察到Beclin免疫反应。在用兔免疫前血清843染色的人脑中未观察到染色（数据未显示）。
病毒载体SIN构建的flag-Beclin蛋白的表达/贝克林、SIN/贝克林停止和SIN/贝克林ΔBcl-2BD。（A和B）用抗标记表位抗体M2（A）或多克隆兔抗Beclin抗血清（B）对病毒感染的BHK细胞裂解物进行Western blot分析。SIN第1车道/贝克林; SIN第2车道/贝克林停止；SIN第3车道/贝克林ΔBcl-2BD；车道4，空Sindbis病毒载体。SIN感染2天后用鼠脑抗标记表位抗体M2进行（C至E）免疫过氧化物酶染色/贝克林（C） 、SIN/贝克林停止（D）或SIN/贝克林ΔBcl-2BD（E）。放大倍数，×111。
Beclin和Bcl-2的相互作用。
我们进行了额外的酵母双杂交研究，以确认人类贝克林，像老鼠一样贝克林，编码与人类Bcl-2相互作用的蛋白质，并进一步定义人类Beclin的Bcl-2交互作用区域（表). 我们发现，与酵母双杂交筛选（aa 1至236）中分离的小鼠基因产物相对应的人类Beclin区域也与Bcl-2相互作用。进一步的缺失突变分析表明，Beclin的aa 88至150足以介导与Bcl-2的相互作用。有趣的是，在默克EST数据库中的一些人类婴儿大脑cDNA克隆中，Beclin这一区域的编码序列被删除，这表明Beclin至少以两种形式存在，包括一种含有Bcl-2结合域，另一种缺乏该域。在酵母双杂交系统中，全长β-珠蛋白不与Bcl-2相互作用。如下文所述，当在瞬时转染分析中表达时，带鞭毛标记的全长人Beclin显示点状免疫反应模式，提示与细胞内细胞器相关，并与细胞溶解后的不溶性部分相关。相反，带鞭毛标记的截断Beclin（aa 1至236）（对应于酵母双杂交筛中分离的区域）显示出弥漫的细胞质染色模式，在细胞裂解后可溶。全长和截短的Beclin之间的这些差异被认为是在酵母双杂交分析中易位到酵母细胞核和与Bcl-2相互作用的能力差异的原因。
为了直接检测全长人Beclin和Bcl-2在哺乳动物细胞中是否相互作用，我们对与Bcl-2和标记表位的Beclin共同转染的COS7细胞进行了FRET研究。Beclin被预测为一种可能和细胞骨架有关的卷曲蛋白，在细胞溶解后，它和不溶性部分分离。由于这一技术原因，无法对Bcl-2和Beclin之间的体内相互作用进行生化分析。FRET是一种荧光技术，可以用作光谱标尺来研究和量化细胞成分之间的相互作用（参考文献中综述6,12、和35). 在FRET中，处于激发态的荧光团（施主）可以通过偶极-偶极相互作用以非辐射方式将其激发能量传递给相邻的发色团（受体）。该过程的效率随着供体和受体发色团分离距离的六次方的倒数而变化，并且在实践中，要求供体和受体荧光团之间的距离短（通常小于50）。能量传递效率对供体-受体分离的依赖性为这一现象在细胞-组分相互作用研究中的应用提供了基础。许多研究人员使用FRET来检查细胞成分的相互作用（在6,12、和35)如内膜融合事件、配体依赖性生长因子受体聚集、病毒和细胞蛋白与凋亡调控因子的相互作用(20)和细胞骨架成分的相互作用(33).
在测量FRET之前，我们首先使用共焦激光显微镜（图。). 已知Bcl-2与线粒体外膜、内质网和核周膜相关，并显示出胞质免疫反应的点状模式（参考文献综述28). 我们发现，在通过共聚焦激光显微镜分析检测的所有共转染的COS7细胞中，flag Beclin总是显示出与Bcl-2相同的免疫反应模式（图。A至C）。此外，我们发现Beclin中假定的Bcl-2结合域的缺失并没有改变其免疫反应模式；鞭毛BeclinΔBcl-2BD的染色模式与全长Beclin相似，与全长Becln相似，它在共转染细胞中与Bcl-2共定位（图。D至F）。核周区的这种Beclin免疫反应颗粒模式与在人类神经元中观察到的内源性Beclin相似（对比图。B、，A、 和D） ●●●●。
表达Bcl-2和Beclin的COS7细胞的共焦激光扫描显微镜。pSG5共转染的（A和B）细胞/bcl-2基因和pSG5/flag-贝克林并用抗凝表位（A）和抗人Bcl-2（B）抗体染色。与pSG5共转染的（D和E）细胞/bcl-2基因和pSG5/flag-贝克林DBcl-2BD并用抗标记表位（D）和抗人Bcl-2（E）抗体染色。（C和F）面板A和B（C）以及面板D和E（F）的计算机叠加；黄色对应于FITC和罗丹明染色的重叠。共聚焦载玻片厚度为1μm。
在确认Bcl-2和Beclin以及Bcl-2与BeclinΔBcl-2BD的共定位后，我们使用FRET分析来确定Bcl-2是否与Beclin-物理相互作用。我们比较了转染COS7细胞中Bcl-2与全长Beclin、Bcl-2和BeclinΔBcl-2BD之间的FRET量，以及Bcl-2及对照蛋白SERCA。显微图像的定量分析（对过滤器组与供体和受体浓度之间的串扰进行校正后）显示，标记全长Beclin和Bcl-2的细胞中FRET显著增加(E类贝克林-Bcl-2= 0.000578 ± 0.000262; 平均值的平均值±标准误差[SEM]，n个=410）比标有BeclinΔBcl-2BD和Bcl-2的细胞(E类贝格林ΔBcl-2BD-Bcl-2= 0.000189 ± 0.000151;n个= 2,946) (P（P）= 0.0068,t吨试验）或在标有SERCA和Bcl-2的细胞中(E类SERCA-Bcl-2型= 0.0000639 ± 0.0000390;n个= 775) (P（P）= 0.0021,t吨测试）。这些定量分析表明，Beclin和Bcl-2表现出FRET，并提供了这两种蛋白质在哺乳动物细胞中相互作用的证据。此外，在酵母双杂交研究中定位的Beclin的Bcl-2结合域的缺失不会改变转染Beclin细胞的空间取向，但会显著降低FRET。该观察结果表明，在全长Beclin和Bcl-2之间观察到的FRET反映了这些蛋白质在体内的特定关联，而不是过度表达后的伪影。
Beclin与Bcl-2家族死亡抑制因子成员的选择性相互作用。
为了研究Beclin是否与其他积极或消极调节细胞凋亡的Bcl-2家族成员相互作用，我们融合了bax（巴克斯）,bcl-x公司秒、和bcl-x公司L（左）加入GAL4结合域载体，并在酵母双杂交系统中测试与Beclin的相互作用（表). Bcl-x秒GAL4结合域自行构建激活转录，因此无法测试与Beclin的相互作用。与Bcl-2相互作用的Beclin的同一区域（aa 88至150）也与Bcl-x相互作用L（左），一个抑制细胞凋亡的相关Bcl-2家族成员(4). 相反，Beclin对Bax没有反应，Bax是一个促进细胞凋亡的家族成员(27). 这种相互作用模式，即与Bcl-2和Bcl-xL（左）而不是Bax，与之前鉴定的Bcl-2家族以外的所有Bcl-2相互作用蛋白的观察结果相同（参考文献综述30).
Bcl-2和Bcl-x的突变L（左）阻断死亡阻遏物活性也阻断与Beclin的结合。
Cheng等人已经证明Bcl-2和Bcl-xL（左）过度表达可以延缓Sindbis病毒诱导的BHK细胞死亡(5). 评估Bcl-2–Beclin和Bcl-xL（左）-Beclin相互作用可能与Bcl-2和Bcl-x的这种能力有关L（左）为了抑制Sindbis病毒诱导的细胞凋亡，我们构建了包含bcl-2基因和bcl-x公司L（左）在保守BH1结构域中发生突变的结构体，已知其可阻断死亡阻遏物活性。Bcl-2第145位氨基酸的Gly-Ala突变完全消除了白细胞介素-3剥夺、γ-辐射和糖皮质激素诱导的细胞凋亡中Bcl-2死亡抑制因子的活性(42)并在酵母双杂交系统中阻断Bcl-2与Beclin的结合（表). 类似地，将Bcl-x的aa 136替换为138L（左）（VNX→AIL）完全消除Sindbis病毒诱导的凋亡中的死亡抑制活性(5)也阻止Bcl-xL（左）绑定到Beclin（表). Bcl-2（G→A145）和Bcl-x的这些突变L（左）（VNW→AIL）没有改变Bcl-2或Bcl-x的水平L（左）在酵母细胞中的表达（数据未显示），表明缺乏相互作用不能归因于突变对酵母蛋白表达的影响。因此，这些数据表明，阻断Bcl-2和Bcl-x抗死亡活性的突变L（左）也可将砌块绑定到Beclin。
表2
BH1结构域突变对Bcl-2和Bcl-x能力的影响L（左）在酵母双杂交试验中与Beclin结合
| 构造一 | 保留的BH1域 | 抑制凋亡（参考） | 贝克林胶订 |
|---|
| 重量Bcl-2 | ELFRDGVNWGRIVAFFEFGG公司 | + | + |
| 重量Bcl-xL（左） | ELFRDGVNWGRIVAFFSFGG公司 | + | + |
| 手动变速箱Bcl-2 | ---------A类---------- | − (42) | − |
| MT Bcl-x公司L（左） | ------AIL公司----------- | − (5) | − |
Beclin保护小鼠免受Sindbis病毒TE12神经毒株引起的致命性脑炎。
在确认Beclin是一种在神经元中表达的新型Bcl-2相互作用蛋白后，我们有兴趣研究其对Sindbis病毒感染的影响。为了直接评估Beclin的作用及其与Bcl-2样蛋白在调节Sindbis病毒发病机制中的潜在相互作用，我们比较了小鼠感染表达野生型人类Beclin（SIN）的重组嵌合病毒的自然史/贝克林)人Beclin缺乏假定的Bcl-2-结合域（SIN/贝克林ΔBcl-2BD），或人类Beclin在核苷酸位置270处含有提前终止密码子（SIN/贝克林停止）。
为了构建这些病毒，我们使用了与之前描述的表达人类Bcl-2的Sindbis病毒嵌合体相同的策略(17)但我们使用了一种更具神经毒力的Sindbis病毒背景毒株dsTE12。我们选择了dsTE12，而不是以前使用的毒力较低的菌株ds633，因为较大尺寸的人类贝克林开放阅读框插入物将对Sindbis病毒的神经毒力产生减弱作用。虽然ds633仅对新生小鼠具有神经毒性，但dsTE12对老年小鼠也具有神经毒性(40). ds633和dsTE12在E2包膜糖蛋白的一个氨基酸位置（ds633中的Gln-55；dsTE12中的His-55）和E1糖蛋白的两个氨基酸位置上不同（ds632中的Val-72和Gly-313；dsTE12中的Ala-72和Asp-313）。以前对重组病毒的研究已经将老年小鼠神经毒力的氨基酸残基定位在E2的55位(40,41).
我们确认SIN/贝克林和SIN/贝克林ΔBcl-2BD通过用抗标记表位单克隆抗体和多克隆抗人Beclin肽抗体对感染的BHK细胞裂解物进行Western blot分析，表达预测分子量的蛋白质（图。A和B）。SIN公司/贝克林表达61kDa蛋白和SIN/贝克林ΔBcl-2BD表达了一种与抗标记表位和抗Beclin抗体反应的52-kDa蛋白。我们还通过在感染后第1天、第2天和第4天对小鼠大脑进行免疫过氧化物酶染色，证实了人类鞭毛-β-β和鞭毛-δBcl-2BD在病毒感染的神经元中表达（典型的显微照片如图。C和E）。虽然我们没有通过对感染SIN的BHK细胞裂解物的Western blot分析检测到任何鞭毛-β蛋白表达/贝克林在感染SIN的小鼠脑中也观察到了stop，flag免疫反应/贝克林停止（图。D） ●●●●。仅感染dsTE12载体的对照鼠脑中未发现标记免疫反应（数据未显示）。SIN中观察到较少的鞭毛免疫活性细胞/贝克林-比SIN感染/贝克林ΔBcl-2-和SIN/贝克林阻止感染的小鼠大脑。
我们比较了脑内感染CD1小鼠10天胎仔的存活率和SIN的1000个PFU/贝克林、SIN/贝克林ΔBcl-2BD和SIN/贝克林停止（图。A） ●●●●。SIN感染小鼠的存活率/贝克林为71%，而SIN感染后仅为9%和7%/贝克林ΔBcl-2BD和SIN/贝克林停止。SIN感染组间生存率的差异/贝克林与SIN相比/贝克林ΔBcl-2BD和SIN/贝克林与SIN相比/贝克林止步非常显著(P（P）< 0.001; 生命表分析）。因此，在病毒感染的神经细胞中的全长Beclin过度表达可显著预防致命的Sindbis病毒性脑炎。此外，感染表达缺乏Bcl-2结合域的Beclin突变形式的病毒后的高死亡率表明，与Bcl-2或Bcl-2样蛋白的结合对于Beclin对Sindbis病毒性脑炎生存的保护作用很重要。
Beclin和Bcl-2对Sindbis病毒TE12株感染小鼠存活的影响。（A） SIN感染小鼠的存活曲线/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林ΔBcl-2BD。数据表示四到六只独立幼崽的组合存活概率。（B） SIN感染小鼠的存活曲线/bcl-2基因和SIN/bcl-2基因停止。数据表示三只独立幼崽的组合存活概率。
Bcl-2不能预防由TE12引起的致命性脑炎。
以前，我们发现在ds633 Sindbis病毒载体中表达的Bcl-2可以保护新生小鼠免受致命的Sindbis感染(17). 然而，在AT3/bcl-2细胞的体外研究中，TE12菌株克服了bcl-2所赋予的保护作用(41). 为了直接比较Beclin和Bcl-2对10日龄小鼠TE12预防脑炎的能力，我们克隆了人bcl-2基因和人类bcl-2基因在dsTE12载体的核苷酸位置118后包含一个提前终止密码子以生成构建体SIN/bcl-2基因和SIN/bcl-2基因停止。与SIN不同/贝克林与SIN相比/贝克林停止（图。A） ，SIN感染小鼠的存活率没有差异/bcl-2基因与SIN相比/bcl-2基因停止（图。B） ●●●●。连同以前的结果(17)这些数据表明，Bcl-2可以预防由含有野生型谷氨酰胺的Sindbis病毒株E2位55引起的致命性脑炎，但不能预防由含有组氨酸突变（E2-55组氨酸突变）的神经毒力更强的Sindbi病毒株E255引起的致死性脑炎。
Beclin减少小鼠大脑中Sindbis病毒的复制。
为了检测Beclin过度表达是否影响Sindbis病毒复制，我们测量了小鼠脑匀浆的病毒滴度，并对小鼠脑切片进行原位杂交，以检测消息感病毒RNA。感染SIN的小鼠在感染后第1天的平均病毒滴度降低了5倍，第2天和第4天的病毒滴度减少了50倍/贝克林与SIN感染小鼠的大脑相比/贝克林停止或SIN/贝克林Δbcl-2BD（图。). 受感染小鼠大脑中病毒RNA阳性细胞的计算机定量图像分析显示，Beclin对病毒复制的抑制作用与通过病毒滴度测量观察到的类似，但时间模式略有不同（图。). SIN感染的大脑中病毒RNA阳性细胞的平均数量显著降低/贝克林比SIN感染的大脑/贝克林感染后第4天停止（100±36 vs 494±55；P（P）= 0.004,t吨但在感染后第2天相当（575±272 vs 507±216；P（P）= 0.854,t吨测试）。SIN感染后2天小鼠脑内病毒滴度降低，但病毒RNA阳性细胞未降低/贝克林提示Beclin可能对病毒复制的转录后阶段产生抑制作用。此外，SIN的病毒滴度/贝克林ΔBcl-2BD感染的小鼠大脑与SIN的滴度没有显著差异/贝克林停止感染小鼠大脑，但SIN中第2天和第4天病毒RNA阳性细胞的数量较高/贝克林ΔBcl-2BD受影响程度高于SIN/贝克林阻止感染的小鼠大脑。在第4天，差异显著（905±72 vs 494±55；P（P）= 0.01,t吨试验），但不在第2天（1190±375对507±216；P（P）= 0.190,t吨测试）。
SIN的病毒生长/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林小鼠脑内ΔBcl-2BD。每个数据点代表三到六只小鼠大脑的几何平均病毒滴度±SEM。
SIN感染小鼠脑内病毒RNA阳性细胞/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林ΔBcl-2BD。每个数据点代表三到六只小鼠大脑每平方毫米大脑中Sindbis病毒信息感测RNA阳性细胞的平均±SEM数。
不同病毒感染组间RNA阳性细胞的解剖分布没有差异；病毒RNA阳性细胞呈簇状分布于整个大脑，最常见于脑室下区、后新皮质、丘、海马、纹状体和嗅球。然而，在给定的集群中，SIN中的细胞数量通常最低/贝克林-受感染的小鼠大脑和最大SIN/贝克林ΔBcl-2BD感染小鼠大脑（见图中的代表性显微照片）。).
用于感染SIN的小鼠大脑中病毒RNA（A至C）和ISEL（D至F）阳性细胞的计算机定量图像分析的场的代表性显微照片/贝克林（A和D），SIN/贝克林停止（B和E）和SIN/贝克林图中ΔBcl-2BD（C和F）。和分别是。所有显微照片均取自感染后4天脑切片的丘区，与放大10倍观察到的图像相对应。箭头表示Image-ProPlus软件程序评分为阳性的代表性单元格。
Beclin减少Sindbis病毒诱导的小鼠脑细胞死亡。
为了检测CNS Beclin过度表达是否减少凋亡细胞死亡，我们定量了感染嵌合病毒SIN的小鼠大脑中凋亡细胞核的数量/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林ΔBcl-2BD（图。). 在每只小鼠的大脑中，几乎所有的凋亡细胞核都位于原位杂交检测到病毒RNA的区域（图。)以及有神经元死亡组织病理学证据的区域。在三个不同的病毒治疗组中，每个时间点的凋亡细胞核平均数与病毒RNA阳性细胞平均数之间存在密切关联（图。和). 在感染SIN的小鼠脑内/贝克林和SIN/贝克林停止，感染后第1天和第2天出现少量细胞死亡，并且每平方毫米大脑中凋亡细胞的数量在这些组之间没有差异。感染SIN小鼠的大脑在感染后第2天出现更多凋亡细胞核/贝克林ΔBcl-2BD（604±211）比感染SIN的小鼠大脑中的ΔBcl-2BD（604±211）/贝克林（133±90）或SIN/贝克林停止（91±52）；这种差异几乎具有统计学意义(P（P）=0.078，方差分析）。感染后第4天，SIN患者每平方毫米大脑中凋亡细胞的平均数量显著增加/贝克林停止（1490±29）和SIN/贝克林ΔBcl-2BD（1044±430）与SIN/贝克林-感染小鼠大脑（101±10；P（P）=0.001，方差分析）。这些数据表明，Beclin过度表达可减少感染了Sindbis病毒TE12株的小鼠大脑的凋亡死亡。
SIN感染小鼠脑内凋亡细胞核/贝克林、SIN/贝克林停止，和SIN/贝克林ΔBcl-2BD。每个数据点代表三到六只小鼠大脑每平方毫米大脑中ISEL阳性细胞核的平均±SEM数。
讨论
在这项研究中，我们描述了一种新型线圈60-kDa蛋白Beclin的鉴定，该蛋白与细胞死亡调节因子Bcl-2相互作用。我们证明，Beclin在体内病毒感染神经元中的过度表达可有效防止Sindbis病毒诱导的疾病。感染表达野生型Beclin的重组Sindbis病毒的小鼠与感染表达Beclin缺失突变体的重组病毒的小鼠相比，神经细胞凋亡较少，病毒复制减少，死亡率显著降低。此外，Beclin的Bcl-2结合域是Beclin对CNS Sindbis病毒感染的抗病毒、抗凋亡和促进生存作用所必需的。这些发现表明，Beclin通过与Bcl-2样分子的相互作用，可以在体内作为抗病毒宿主防御分子在中枢神经系统发挥作用。
我们的结论是，Beclin的保护性和抗病毒作用是通过与Bcl-2（或与Beclin同一区域结合的Bcl-2样分子）的相互作用介导的，这一结论得到了表达Beclin缺失aa 88至151的嵌合Sindbis病毒的数据支持。Beclin的氨基酸88到150足以介导与Bcl-2和Bcl-x的相互作用L（左）在酵母双杂交试验中，从全长Beclin中删除这些氨基酸会显著降低哺乳动物细胞中Beclin-Bcl-2相互作用的强度。表达缺乏aa 88至150（SIN）的Beclin的Sindbis病毒结构/贝克林ΔBcl-2BD）在小鼠脑内复制到高水平，导致神经细胞凋亡，并导致小鼠与表达90-aa截断Beclin蛋白（SIN）的对照重组病毒相同的死亡率/贝克林停止）。与全长Beclin相比，BeclinΔBcl-2BD缺乏保护活性不能归因于SIN感染后Beclin△Bcl-2BN表达水平较低/贝克林ΔBcl-2BD。鞭毛蛋白ΔBcl-2BD的水平等于或大于SIN感染的BHK细胞裂解物的免疫印迹分析检测到的鞭毛蛋白水平/贝克林和SIN/贝克林ΔBcl-2BD。此外，SIN/贝克林ΔBcl-2BD感染的小鼠大脑比SIN感染的小鼠脑有更多的鞭毛免疫活性细胞/贝克林因此，BeclinΔBcl-2缺乏保护活性，这与Beclin的抗病毒作用是通过与Bcl-2样蛋白的相互作用介导的假设最为一致。
本研究中的一些数据表明，病毒SIN/贝克林ΔBcl-2BD可能比SIN病毒更具神经毒性/贝克林停止。SIN感染小鼠/贝克林在感染后第2天和第4天，ΔBcl-2BD的脑内病毒RNA阳性细胞比SIN感染的小鼠多/贝克林停止。与感染传播速度更快相对应的是，感染SIN小鼠的大脑在感染后早期出现更多细胞死亡/贝克林ΔBcl-2BD与SIN的比较/贝克林停止。尽管SIN感染小鼠的总死亡率/贝克林ΔBcl-2BD与SIN/贝克林停止时间没有差异，但SIN感染小鼠的平均死亡日略低/贝克林ΔBcl-2BD与SIN/贝克林停止。这些观察结果提出了缺乏Bcl-2结合结构域的Beclin作为显性阴性突变体发挥作用的可能性。由此推论，大脑中天然存在的缺乏Bcl-2结合域的Beclin亚型可能是一种致命的分子。
Beclin可通过与Bcl-2、Bcl-x的相互作用发挥抗病毒作用L（左），或尚未确认的Bcl-2家族成员。在酵母双杂交试验中，我们发现Beclin的同一区域与Bcl-2和Bcl-x相互作用L（左）Bcl-2和Bcl-x保守BH1结构域的功能丧失突变L（左）阻断与Beclin的结合。而Bcl-2和Bcl-xL（左）是神经元凋亡的重要调节器（参考文献综述23)，我们发现Bcl-2，但不是Bcl-xL（左），保护小鼠免受致命性脑炎的侵袭，并延缓Sindbis病毒诱导的培养大鼠背根神经节神经元死亡(14,17). 因此，Bcl-2可能比Bcl-x更重要L（左）作为Sindbis病毒诱导神经细胞死亡的调节器。在Bcl-2缺乏的小鼠中检测Beclin对Sindbis病毒感染的影响的其他研究可能有助于确定Bcl-2是否是中枢神经系统体内抗病毒途径中重要的Beclin结合伴侣。
Beclin与Bcl-2样蛋白协同抑制Sindbis病毒复制和Sindbis毒株诱导的神经元死亡的机制尚不清楚。Semliki Forest病毒和Sindbis病毒通过半胱氨酸蛋白酶诱导的Bcl-2裂解，使转染成纤维细胞中Bcl-2的抗凋亡功能失活(10). 此外，Nava等人表明临界电流提高Sindbis病毒感染小鼠的存活率(24)，建议角色临界电流-抑制性CNS半胱天冬酶活性在致命性脑炎发病机制中的作用。因此，一种可能性是，与Beclin的结合以某种方式保护Bcl-2（或Bcl-x）L（左）)防止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分裂，从而防止Sindbis病毒诱导的细胞死亡。第二种可能性是Beclin–Bcl-2样蛋白复合物阻断了由Sindbis病毒E2和E1包膜糖蛋白触发的内质网应激信号。Bcl-2和Bcl-may抑制凋亡的机制之一是通过调节细胞膜的通透性（参考文献综述30). 最近，我们发现Sindbis病毒E2和E1包膜糖蛋白跨膜结构域的过度表达可诱导AT3细胞凋亡(15). 此外，诸如Beclin等线圈蛋白可能在将膜信号转导事件和细胞骨架联系起来方面发挥作用。因此，我们推测Beclin，一种定位于细胞膜的蛋白质，可能是与Bcl-2样蛋白复合物的一部分，该复合物调节由内质网中Sindbis病毒包膜糖蛋白启动的信号事件。
本研究的结果与我们之前研究Bcl-2过度表达对Sindbis病毒性脑炎自然病史的影响的工作存在许多相似之处。正如Beclin在这项研究中观察到的那样，Bcl-2在病毒感染的神经元中的过度表达已经被证明可以减少CNS凋亡，减少CNS Sindbis病毒复制，并降低Sindbis的死亡率(17). 然而，在本研究中，我们还发现了Bcl-2和Beclin之间的一个显著生物学差异；也就是说，Beclin可以对Sindbis病毒的神经毒性毒株的感染发挥保护作用，该毒株可以克服Bcl-2的保护作用。Ubol等人证明，在Sindbis病毒E2包膜糖蛋白的55位用组氨酸替代野生型谷氨酰胺足以使病毒杀死表达Bcl-2的细胞(41). 同样，我们之前发现，在55位含有谷氨酰胺的Sindbis菌株（菌株633）中表达的Bcl-2可预防致命性脑炎(17)但在本研究中，我们发现在55位含有组氨酸的Sindbis菌株（菌株TE12）中表达的Bcl-2对致命疾病没有保护作用。然而，当在含有E2-55组氨酸的Sindbis病毒背景毒株中表达时，Beclin具有显著的保护作用。因此，赋予神经毒力的E2突变可以对抗Bcl-2的保护作用，但不能对抗Beclin的保护作用。
已经提出了几种解释来解释E2-55组氨酸突变赋予Bcl-2抵抗Sindbis病毒诱导的死亡的能力。Ubol等人认为E2中的神经毒性突变可能以某种方式改变了内质网中E2和Bcl-2之间的直接相互作用或Bcl-2对E2蛋白折叠或翻译后修饰的可能影响(41). 最近，Grandgirard等人提出了E2突变促进半胱氨酸蛋白酶进入Bcl-2并随后触发Bcl-2裂解的可能性(10). 如果caspase诱导的Bcl-2裂解的病毒激活确实证明是含E2-55组氨酸的Sindbis病毒株的神经毒力的重要机制，我们的数据表明Beclin可能是抵抗这种神经毒力策略的重要宿主防御因子。这一假设基于Beclin，一种Bcl-2相互作用蛋白，能够保护Sindbis病毒TE12株诱导的神经元死亡。
我们的发现表明，在Sindbis病毒感染的小鼠大脑中观察到的Beclin抗病毒作用可能是在病毒RNA合成后的病毒复制阶段发挥的。在嵌合病毒感染后2天，Beclin过表达与病毒滴度降低50倍有关，但病毒RNA阳性细胞的数量没有减少。这一发现表明，Sindbis病毒结构蛋白的翻译、病毒糖蛋白的翻译后修饰、病毒组装或出芽水平存在障碍或异常。该观察结果与之前研究Bcl-2对相关α病毒Semliki Forest病毒感染的影响形成对比(34). 根据病毒RNA的原位杂交研究和病毒蛋白的免疫染色，Scallan等人得出结论：bcl-2基因在病毒生命周期的早期阶段，无论是进入、转录前事件还是转录，都能抑制Semliki Forest病毒的复制(34). Scallan等人的发现与本研究中报告的结果之间的差异可能反映了Beclin和Bcl-2抗病毒作用之间的根本差异，Sindbis病毒和Semliki Forest病毒之间的差异，或感染细胞类型之间的差异。或者，Bcl-2和/或Beclin可能在α病毒生命周期的多个重叠阶段发挥作用，这两项研究中的不同实验设计揭示了对不同复制阶段的影响。鉴于缺乏Bcl-2结合结构域的Beclin缺乏抗病毒活性，Beclin和Bcl-2抑制Sindbis病毒在小鼠脑中复制的机制似乎相似。
本研究的结果不允许我们评估Beclin对Sindbis病毒诱导的死亡率的有益影响是否是抗病毒作用、抗凋亡作用或两者结合的结果。目前尚不清楚Beclin是否仅仅通过减少Sindbis病毒在神经元中的复制来防止神经细胞死亡，或者Beclin的抗凋亡作用是否独立于其对病毒复制的影响。有必要进一步研究Beclin对非病毒刺激引起的凋亡死亡的影响，以确定Beclin是否像Bcl-2一样发挥一般凋亡抑制剂的作用。如果是这样，Beclin的结构-功能分析可能有助于绘制抗病毒和抗凋亡功能重要的结构域，并确定这两个特性是相互关联还是相互独立的。
以前，根据我们对Bcl-2和Sindbis病毒感染的观察，我们推测病毒复制的细胞调节和神经元凋亡死亡的细胞调节之间可能存在分子联系(17). 我们发现Beclin具有抗病毒活性，并且Beclin与细胞死亡调节因子Bcl-2相互作用，进一步支持了这一假设。在分裂细胞中，通过病毒编码的细胞死亡抑制剂（如p35）抑制病毒诱导的细胞死亡(7)腺病毒E1B可以增加病毒复制(三). 然而，在非分裂、终末分化的细胞（如神经元）中，可能存在允许保存细胞生命的遗传途径，而不会对生物体造成总病毒负荷增加的不利后果。基因，如bcl-2基因和贝克林哺乳动物神经元中正常表达的蛋白可能是这些通路的重要组成部分。
鸣谢
前两位作者对这项工作贡献均等。
我们感谢M.B.Soares提供标准化的人类婴儿大脑cDNA文库，Takaki Sato提供bcl-x公司秒,bcl-x公司L（左）、和bax（巴克斯）普拉斯，史蒂文·格林伯格和米尔顿·帕克进行有益的讨论，特蕾西·柯兰提供秘书协助。
这项工作得到了James S.McDonnell基金会学者奖（B.L.）的支持，国家卫生研究院授予AIO1217（B.L..）、AI40246（B.L..AG07218（B.H.）、AG13797（B.H..AG13637）。B.L.获得了美国癌症学会青年教师研究奖和Irma T.Hirschl信托职业科学家奖的支持。
参考文献
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