人类免疫缺陷病毒1型E亚型启动子NF-κB增强子和TATA盒的调控失调

摘要

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B亚型是最初在印度、泰国和南非共和国等国描述的病毒；然而，这些国家目前的异性恋流行是由后来进入的其他HIV-1基因型引起的(8,23,25,27,28). 泰国几乎所有新的异性传播艾滋病毒感染者现在都是HIV-1E，据报道，在静脉注射吸毒者中，HIV-1E的相对比例正在增加(24)表明HIV-1E在该环境中的竞争效率高于HIV-1B基因型(14).

调节HIV-1的转录对于建立生产性感染至关重要。启动子区域内明显细微的核苷酸变化会显著影响HIV-1的表达，启动子区域包括TATA盒，TATA盒是补充TATA结合蛋白（TBP）和启动RNA合成所必需的基本DNA元件；NF-κB增强子，一个由阳性宿主细胞调节器NFκB:p50:p65识别的串联DNA结合位点；和RNA增强子TAR，病毒转录激活子Tat与之结合（综述见参考文献7). 除了在招募独特因子方面的作用外，这些位点还并列参与蛋白质相互作用的核酸结合蛋白，例如TAT-TBP(11)和Rel-TBP(12).

HIV-1E基因型包含一个独特的调控结构，表明病毒调控存在潜在的重要差异(16). 值得注意的是，HIV-1转录的NF-κB:p65（RelA）依赖性激活被证明与NFκB增强子的拷贝数相关，因此包含一个κB位点的E亚型分离株的诱导性始终低于包含一个标准的两个NF-κB位点的B亚型隔离株。NF-κB增强子的拷贝数可能会影响复制速率，因为含有两个串联NF-κ子B位点的病毒的复制效率高于κB突变病毒(4).

由于HIV-1E亚型正在有效传播，HIV-1E启动子中单个NF-κB位点的存在促使我们确定生理相关激活物，如肿瘤坏死因子α（TNF-α），是否仍然可以有效激活HIV-1E。许多研究表明，免疫调节细胞因子TNF-α在激活HIV-1基因表达和HIV-1感染相关致病性后遗症中的重要作用（如果不是中心作用）。TNF-α介导的HIV-1活化与Rel异二聚体p50:p65核转位的诱导以及随后NF-κB增强子的结合活性有关(2,18).

HIV-1 E亚型启动子的另一个独特特征是，与更常见的TATA盒（ATAAA）相比，变异TATA盒和变异TAR隆起区的流行率都较高，其中包含核苷酸缺失，两侧有两个多态性。先前的研究旨在评估TATA盒在HIV-1B亚型评估突变体中的作用，这些突变体类似于E TATA亚型（E-TATA）序列，并显示显著降低转录活性(三). 因此，这种自然发生的HIV-1E TATA序列变异的流行似乎意味着活性可能降低。

为了确认之前观察到的HIV-1E启动子差异是否稳定，我们对另外10个流行病学无关的分离株进行了测序。如前所观察到的，所有HIV-1E分离株都含有缺陷的NF-κB II位点（图。​（图1a）。1a） ●●●●。此外，还确认了最初在TATA盒和TAR区域中发现的替换，例如15株HIV-1E分离株中有14株含有HIV-1E-特异性TATA盒（ATAAAA）以及TAR隆起区域中的替换。为了测试这些启动子序列的比较诱导，lacZ公司产生了报告基因（图。​（图1b）1b） 其包含天然存在的长末端重复序列（LTR）或在以下区域具有替换的LTR序列：HIV-E的TATA盒（E18ltr.t）、TAR凸出环区域（E18ltr.tb和E18ltr.b）和NF-κb II位点（E18ltr.κb）。为了测试Tat激活的作用，对HIV-1E和HIV-1B主要分离株的第一个外显子（外显子1）进行PCR分离并克隆到表达载体中，如图所示（图。​（图1b）。1b） ●●●●。

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图1

κB增强子区域通过TATA-TAR区域（−108至+46）的DNA序列比对以及本研究中使用的质粒构建。（a） 图中显示了HIV-1B和HIV-1E分离株中包含NF-κB位点的区域。每个NF-κB位点都有阴影。请注意，所有HIV-1E分离株都含有缺陷的NF-κB II位点。图中还显示了通过TAR包围TATA盒的区域。所有HIV-1E隔离株和HIV-1A参考隔离株U455(17)，包含核苷酸缺失（T25Δ），预计会产生相对于HIV-1B的2核苷酸隆起。所有的HIV-1E分离株在TAR隆起区还含有两个额外的替代物A22G和T31C。（b） 报告基因构建包含原始和突变的LTR序列，通过寡核苷酸定向突变制成，并直接克隆到千磅我-Hin公司如图所示，pBgal-Basic载体的dIII位点（Clontech，Palo Alto，Calif.）。HIV-1E Tat和HIV-1B Tat外显子1序列被工程到Hin公司dIII型-Pst（磅/平方英尺）表达载体pCDNA3.1/Zeo的I位点（Invitrogen，Carlsbad，Calif.）。从R.Suttuent（泰国曼谷马希隆大学）获得异性传播分离物J35至J48的外周血单核细胞衍生DNA样本。如前所述，通过ABI自动测序对样品进行测序（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF080159”，“term_id”：“3396084”，“term_text”：“AF080159“}}AF080159型通过{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF080168”，“term_id”：“3396093”，“term_text”：“AF080168“}}AF080168型). 用于创建突变位点和Tat质粒的内部DNA寡核苷酸序列如下：E18-Btata+，5′-CAG ATG CTG CAT ATA AGC CGC T-3′和E18-Bstata−，5′-AGC GGC TGC TTA Tat GCA GCA TCT G-3′；E18-Bbulg+，5′-GAC CAG ATC TGA GCC TGG GAG CTC T-3′；E18-Bbulge−，5′-AGA GCT CCC AGG CTC AGA TCT GGT C-3′；E18BkB+，5′-TTC TAC AAG GGA CTT TCC GCT GGG GAC-3′；E18BkB−，5′-GTC CCC AGC GGA AAG TCC CTT GTA GAA-3′。Hin公司dIII-状态+，5′-CCA AGC TTA CCT GCC ATG GAG CCG GTA GAT CCT AAC CTA GAG CCC-3′；Pst（磅/平方英尺）I-Etat−，5′-A AAC TGC AGT TAC TGC TCT GGT ATA GGA TTT TGA TGA TCC-3′；Hin公司dIII-状态+，5′-CCA AGC TTA CCT GCC ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC-3′；Pst（磅/平方英尺）I-Btat−，5′-A AAC TGC AGT TAC TTT GAT AAA ACT TGA TGA GTC-3′。

由于B亚型和E亚型之间的NF-κB增强子拷贝数不同，并且TNF-α细胞因子的激活已被证明依赖于NFκB增强子，因此我们评估了TNF-β介导的典型亚型启动子的诱导。如图所示。​图2，2HIV-1E亚型包含一个功能性NF-κB位点，与HIV-1B相比，两个Jurkat T细胞中的TNF-α反应性降低（图。​（图2a；2a；将通道1和2与3和4以及293单元格（图。​（图2b；2b；将通道1至3与通道4至6进行比较）。

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图2

变异体NF-κB和TATA序列影响HIV-1E LTR的激活。在共转染分析中，与HIV-1B相比，在Jurkat T细胞（面板2a；将通道1和2与3和4进行比较）和293细胞（面板B；将通道1-3与4-6进行比较）中，HIV-1E亚型显示出降低的TNF-α反应性。更换有缺陷的上游站点改善了TNF-α响应（面板b；将通道7至9与通道4至6进行比较）。与野生型HIV-1E LTR结构（E18ltr）相比，两种亚型Tat对含有B-TATA（E18ultr.t）的HIV-1E嵌合启动子的激活在293个细胞中意外减少（面板c；比较通道11至15和6至10）。添加补偿性B-TAR（E18ltr.tb）恢复了Tat介导的激活（面板c，16至20道）。仅用HIV-1B TAR替换HIV-1E TAR并没有显著影响Tat的激活（面板c，21至25道）。荧光单位和折叠激活表示典型转染的平均重复。靶质粒转染100 ng基因组DNA/10⁵293个细胞或10μg基因组DNA/5×10⁶Jurkat T细胞。表达载体按指示量转染。转染后18至24小时，在Jurkat和293细胞中以5至100 ng/ml的浓度刺激TNF-α（Genzyme，Cambridge，Mass.）。细胞转染后48小时通过甲基伞形花序基-β-葡萄糖醛酸苷分析测定β-半乳糖苷酶活性。荧光测定采用Fluoroskan平板阅读器（Flow Laboratories，Helsinki，Finland），2-核苷酸TAR隆起。

HIV-1E TATA盒包含一个单一稳定的核苷酸多态性，它与其他HIV-1亚型（ATA）有区别A类AA与ATAAA（带下划线的差异）。虽然在其他HIV-1亚型中不存在，但这种变异体TATA序列在非洲绿猴中的猿猴免疫缺陷病毒（SIV）株中存在(9). HIV-1E TAR序列包含三个相关的核苷酸变化：一个2-核苷酸隆起（U25Δ）和两个侧翼变异核苷酸（A22G和U31C）[参见图中TAR的分子模型。​图3b]）三b] ）预计与结合Tat蛋白非常接近(13,26). 如前所述，HIV-1A亚型和某些SIV分离株也含有2核苷酸隆起(6). 为了测试HIV-1E中改变的TATA和/或TAR序列是否代表非中性遗传替代，我们创建了嵌合LTR驱动的报告基因，在HIV-1E LTR的背景下用“B-TATA”（E18ltr.t）和“B-TAR”（E18mltr.tb）替换E-TATA。由于HIV-1 Tat功能先前已被证明对TATA和TAR序列敏感，因此我们选择评估HIV-1B Tat和同源HIV-1E Tat对这些结构的激活。如图所示。​图2c，2c、 与野生型HIV-1E LTR结构（E18ltr）相比，两种亚型Tat对含有B-TATA（E18ultr.t）的HIV-1E嵌合启动子的激活意外减少（图。​（图2c；2c；将车道11至15与车道6至10进行比较）。这可能表明HIV-1E TATA序列代表了最佳Tat功能所必需的上下文依赖性适应。由于Tat蛋白已被证明与TFIID的一种成分TBP相互作用(11)TBP-Tat活性可能受TATA盒和TAR的核苷酸序列和遗传背景的影响。因此，我们推断，改变TATA序列可能需要相容的TAR改变才能实现有效的TBP-Tat复合物功能和活性。如图所示。​图2c2c（16至20道），补偿性B-TAR隆起包含报告基因（E18ltr.tb）的存在恢复了Tat介导的激活。有趣的是，仅用HIV-1B TAR替换HIV-1E TAR并没有显著影响Tat的活化（图。​（图2c，2c、 21至25车道）。这表明TATA-TBP和Tat-TAR复合物的活性受遗传背景的指导。

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图3

TBP-TFIIB-TATA组装的凝胶位移分析（a）、TAR二级结构（b）和系统发育差异（c）。（a） 在凝胶位移分析中，在B-TATA寡核苷酸上组装TBP-TFIIB-TATA复合物对TFIIB重组蛋白水平的增加具有剂量反应性（左面板，40 ng TBP加上0、15和30 ng TFIIB），而在TFIIB蛋白水平增加的情况下，E-TATA寡核苷酸发生了最小的组装（右图为40 ng TBP加上0、15和30 ng TFIIB）。将重组TATA结合蛋白和TFIIB（Santa Cruz Biotechnology）与放射性标记的HIV-1B或HIV-1E TATA寡核苷酸（24-mers，相对于转录起始，−39至−15）在室温下在结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl）中共25μl孵育30分钟₂100 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇、100 ng/μl牛血清白蛋白、0.01%诺奈德P-40和300μg dG-dC）。将DNA-蛋白质复合物在5%天然聚丙烯酰胺凝胶中在200V下溶解约1小时，干燥并暴露于膜中。（b） 预测HIV-1B（b-TAR）、HIV-1A（A-TAR）和HIV-1E（E-TAR）TAR隆起区的二级结构。HIV-1B亚型包含一个3-核苷酸突起，而HIV-1A和E亚型各自包含一个2-核苷酸突起。E-TAR与A-TAR和B-TAR的不同之处在于有两个额外的核苷酸替换，即A22G和U31C（箭头表示与HIV-1B TAR的差异）。图中还显示了HIV-1B TAR结构的模型，用于表示变异核苷酸的位置（使用InsightII软件生成[MSI，加州圣地亚哥]）。（c） 如图所示，使用完整的LTR（−450至+46，整个U3至TAR[左]）或TATA-TAR区域（−70至+46[右]）对选定序列进行最小进化系统发育分析（γ=0.5[F84模型]）。请注意，整个LTR解析不同的亚型，而TATA-TAR核心将HIV-1E亚型作为其他亚型的异常值（请注意引导值）。

为了进一步研究变异HIV-1E TATA盒的潜在作用，我们选择在凝胶位移试验中，通过评估重组TBP-TFIIB组装在B-TATA和E-TATA寡核苷酸上发生的能力来确定RNA聚合酶II（Pol II）招募的早期步骤是否受到影响。许多研究先前表明，TFIIB作为TBP和Pol II之间的桥梁，在Pol II全复合物的组装中起着关键作用(22). 如图所示。​图3a，三a、 TBP-TFIIB-TATA复合物在B-TATA寡核苷酸上的组装随着TFIIB浓度的增加呈剂量反应性，而对E-TATA寡核苷酸的组装影响最小。组装的改变可能表明不同亚型TATA盒在起始前复合物的形成和TBP相关因子的招募方面不同。

根据RNA折叠标准，亚型A和E TAR序列均被描述为含有2核苷酸隆起（U25Δ），而HIV-1B TAR序列则含有3核苷酸隆起(6). 隆起区域内的A和E亚型的相似性具有挑衅性，因为对E亚型整个基因组的分析揭示了A-E重组结构(6)，使用环境价值和LTR区域不同于亚型A的区域，可能是共选的。E亚型突起区域可能与TATA盒多态性在功能上相关，这促使对a亚型进行了更深入的分析，a亚型具有“B样”TATA和“E样”2-核苷酸突起。凸起区域的二级结构预测（图。​（图3b）三b） 揭示了HIV-1A凸起区与b亚型的不同之处仅在于具有2-核苷酸凸起，而E亚型与b和a亚型的不同之处在于包含两个额外的取代（A22G和U31C）。整个LTR区域与TATA-TAR区域的比较系统发育分析（图。​（图3c；三c；比较左系和右系）支持这样的观点，即HIV-1E TATA-TAR是不同的，而所有其他亚型都分解为一个单系群（注意bootstrap值）。这可能表明HIV-1E TATA-TAR区域发生了明显的遗传变化，这可能是实现最佳Tat活性所必需的。

HIV不同的病毒基因型在传播效率和自然史中都起着重要作用。我们小组进行的研究已经证实，在同一组女性性工作者中，HIV-1的传播效率是HIV-2的5-10倍(10). 同样，其他人的研究表明，HIV-2母婴传播的频率要低得多(1,5). 我们还观察到HIV-1和HIV-2之间的毒力差异(15)最近在不同的HIV-1亚型之间(第九章).

本研究侧重于HIV-1E的特定特征，并扩展了我们小组先前的观察结果，这些观察结果描述了扩展亚型启动子序列中的功能和结构差异。我们观察到NF-κB增强子拷贝数的差异，似乎赋予了对炎症细胞因子TNF-α（一种HIV-1基因表达的有效和关键激活物）的差异性和相关反应。TATA和TAR区域内的遗传变化似乎也经历了适应环境的变化，以潜在地维持Tat功能。总之，这些观察结果支持亚型之间的遗传差异可以提供改变转录激活和启动前复合物组装的能力。

HIV-1E对TNF-α应答的失调与上游NF-κB II位点缺陷相关，因为恢复该上游位点的突变体改善了TNF-β应答。这一表型可能表明，HIV-1E基因型可能发生了遗传变化，通过差异利用已知和潜在的未知转录控制机制，实现了另一种转录策略，该基因型在整个东南亚的传播似乎非常有效。差异调节的证据，特别是获得功能转录，可能有助于阐明转录强度、病毒复制和最终流行传播之间的因果关系。最近，GLI-2/THP-1转录因子已被证明可增强Tat对HIV-1 LTR的激活(3a年). 在转染研究中，我们观察到HIV-1E（和HIV-1C）LTR靶点相对于HIV-1B应答的功能获得差异（未发表数据）。这种新的转录控制获得功能机制可能在全球扩展的亚型之间观察到的明显差异传播中发挥作用。

迄今为止，可能有10%的HIV-1分离株代表基因型间重组体(19——21). 例如，HIV-1E亚型包含独特的包膜和LTR序列，而病毒基因组的其余部分代表A亚型序列。重组基因组可能引入影响病毒功能的新基因结构。虽然这项研究的重点是影响LTR内活动的基因配置，但在其他基因座中发现的越来越多的基因型间重组体提出了一个更大的问题，即改变的遗传背景在HIV-1的致病进化中可能发挥什么作用。

剩下的一个问题是，是否只从非洲非人灵长类动物中的SIV感染了HIV-1，或者是否发生了多次感染（最有可能的是，所有亚型都没有单一的共同祖先，但某些亚型，例如B和D，有一个共同的祖先）。最近对金沙萨1959年血浆样本（Z59）中的HIV-1序列进行了系统发育分析，将该分离物放在HIV-1B、-D和-F的祖先节点附近，并推测该序列可能代表人类的创始病毒基因型或密切相关的创始基因型(29). 如果Z59代表一个创始基因型，那么目前正在超越HIV-1B的亚型，如HIV-1E（和HIV-1C），可能代表更新的启动子配置，可能适合在人群中更有效地传播。

致谢

参考文献