HCMV的主要早期转录本。
在人巨细胞病毒（HCMV）的β类基因中，一个2.7 kb的未片段化聚腺苷酸RNA起源于长独特片段两侧的两个反向重复序列(8,39)（图。a） ●●●●。病毒DNA中β2.7转录本的两个拷贝都有一个开放阅读框（ORF），命名为TRL4或IRL4（EMBL登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X17403”，“term_id”：“59591”，“term_text”：“X17403”}}X17403型). β2.7是最丰富的转录物，占感染期间病毒总mRNA的20%以上(17,28). 其启动子元件被称为β2.7启动子，包含在转录起始位点上游213 bp的区域内，与已知转录因子结合位点具有同源性(20,38). 该启动子被HCMV的早期1和2基因产物反式激活，但其他病毒因子对其充分、高水平表达是必要的(19). 从感染后4小时开始，该转录物在整个复制周期中逐渐积累；它在8到14小时之间表现出最大放大(29).
构建质粒的示意图。（a） TRL4和IRL4在反向重复序列（TR）中的定位L（左）和IRL（左）)侧翼为独特的长节段（UL（左）)HCMV基因组。（b） 真核表达质粒pAD/ORF3*和pTo/ORF3*2，包含来自AD169的ORF3和连接到FLAG序列（*）的Towne，并构建pAD/ORF1-2-3*2和pTo/ORF1-2-3*，其中相应的插入被包括uORF1和uORF2的相应5′区延伸。pTo/ORF3含有来自Towne的不含FLAG序列的ORF3。Towne和AD169在5′端部件编码信息方面的差异通过预测ORF（黑箱）的转录产物（黑线）的比例描述来说明。MIEP，主要中间早期启动子；T7、T7启动子。
非许可细胞感染后，β2.7转录物似乎仅限于细胞核(40). 然而，在生产性感染期间，它主要局限于细胞质中，并与多聚体有关(25,39). 尽管这种本地化模式与生产性感染期间的活动翻译一致，但目前尚未检测到特定的翻译产品(14)支持另一种功能假说，即RNA本身在感染过程中可能具有某些调节作用(30).
除了TRL4，它有513个核苷酸（nt）长(14)在这里也被称为ORF3，两个短上游ORF（uORF），ORF1和ORF2，已在β2.7转录物序列中鉴定。ORF1位于转录起始位点的81 nt处，其24 nt序列在Towne和AD169株中都是保守的(5,13). 相反，ORF2在两个实验室菌株中差异很大。在Towne，它从ORF1末端下游20 nt处开始，长18 nt，而在AD169，它从ORF1下游34 nt处开始并由108 nt组成。
之前的分析，使用瞬时转染分析lacZ公司作为一个指示基因，已经确定了β2.7转录物5′端先导的调控域(1,13). 这些研究证明了抑制作用的存在顺式-通过抑制下游报告基因的翻译而在转录后水平操作的作用信号。这种抑制似乎也改变了感染周期中的表达动力学。导致这种效应的序列需要完整的ORF1和32个下游核苷酸，包括ORF2的AUG密码子(11).
含有一个或多个短uORF的mRNAs在病毒和细胞系统中都有特征(21,22). 在某些情况下，当真核核糖体将这些uORF的AUG密码子识别为有效的起始密码子时，它们似乎对下游翻译起到了负调控作用(7,15,16,33,36). 根据Kozak的模型，这些uORF的抑制作用可能是由于短顺反子间隙在随后的内部起始位点激发了无效的再启动，或者是由于uORF有效翻译后核糖体与mRNA完全分离(24). 或者，如Geballe和Morris所建议的，由uORF编码的新生肽可以与核糖体相互作用并阻止其分解，从而阻断扫描机制(10,12).
在本研究中，我们研究了β2.7转录物的ORF。在无细胞实验中真核表达TRL4后，合成了约24kDa的特异产物；这是第一个证据，证明从这个序列中可以在体外产生稳定的蛋白质。在对各种细胞类型进行瞬时转染后，发现TRL4产物pTRL4主要定位于核内小体（核仁）内，并标记有免疫反应表位FLAG。重要的是，TRL4在HCMV株中基本保守，这与其在病毒感染中的预测作用一致。该蛋白的表达似乎在转录后水平上受到其mRNA的5′先导序列的高度调节，该序列带有两个短uORF。本研究是对β2.7转录物编码的假定蛋白的初步评估，旨在进行实验，以确定病毒裂解感染或潜在和持续感染中TRL4的表达。
TRL4在体外编码蛋白质。编码19.6 kDa假定产物的TRL4被克隆到载体pcDNA3（Invitrogen）中，在T7启动子和HCMV的主要早期启动子/增强子元件的转录控制下（图。b） ●●●●。所得质粒pTo/ORF3在兔网织红细胞裂解物（RRL）（Tn个T系统；Promega），检测到约24 kDa的稳定产物（图。，车道2）。虽然在RRL中的表达不是很有效，但这些数据表明TRL4起始密码子被真核翻译机制识别。在原核系统中，尽管使用了不同的融合伙伴，但我们无法获得含有来自TRL4的全长肽的稳定产物。由于没有可用的多克隆抗体，将一种称为FLAG的免疫反应性八肽（在构建体名称中用星号表示）融合到pTRL4的羧基末端，产生构建体pTo/ORF3*。
（a） 用RRL进行体外转录和翻译分析。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影术可检测到与构建物pTo/ORF3（通道2）反应中的24kDa产物对应的带，而在与质粒pcDNA3的对照反应中未检测到产物（泳道1）。通过质粒pTo/ORF3*，获得了25kDa的产物（通道3）。泳道4和5分别对应于用质粒pTo/ORF1-2-3*和pAD/ORF1-2-3*进行的体外测定。很明显，与在缺乏5′区的结构上进行反应相比，25-kDa蛋白的产生大大减少。（b） 来自体外转录和翻译分析的RNA的Northern blot分析。从含有两组质粒pTo/ORF3*和pTo/ORF1-2-3*（通道1）以及pAD/ORF3**和pAD/ORF1-2-3*（通道2）的反应混合物中提取的总RNA通过使用32P标记片段作为对应ORF3的探针。ORF1-2-3*（0.8 kb）和ORF3*（0.5 kb）检测到同等数量的转录物。
标记蛋白的预期分子量约为25kDa，表明添加该表位不会影响产品的稳定性（图。，车道3）。
人星形细胞瘤（U373-MG）细胞允许HCMV复制，用构建物pTo/ORF3*瞬时转染。使用抗FLAG单克隆抗体（MAb）M2（伊士曼-柯达公司）进行间接免疫荧光检测，显示特定产物的表达具有特征性的细胞内定位。在亚核结构中积累的蛋白质，通过相控显微镜证明与核仁相对应（图。a和c）。核质内未检测到融合蛋白，除核仁染色外，约50%的阳性细胞显示出弥漫性细胞质染色（图。b和d）。在人胚肺成纤维细胞和猴肾（COS7）细胞中也观察到这种特殊模式，这意味着在不同类型的细胞中存在类似的靶向pTRL4的机制。
pTRL4*在U373-MG细胞中的细胞内定位。在用pAD/ORF3*转染后，细胞被固定并用抗FLAG MAb M2进行探测。荧光信号总是局限于核仁（a和b），通过与相控图像（c和d）的比较进行了验证。在大约50%的阳性细胞中，细胞质中也检测到一些阳性细胞（b）。
小于40到60 kDa的蛋白质类pTRL4可以通过核孔复合体自由扩散(34). 然而，观察到的核定位非常独特，表明是一种特定的迁移，而不是被动扩散。对推导出的pTRL4一级结构的分析表明，存在一小段碱性氨基酸（KRVKRKK；氨基酸[aa]88至94），与猴病毒40大T抗原的原型核定位信号密切相关(18). 此外，该结构域类似于二分核定位信号，第二簇碱性氨基酸（RRIQSRR；aa 107至113）位于12个残基之间(35). 此外，一个带正电的区域（RRIQSRRFPTRENRTKTR；aa 107至124）与报告的核仁定位信号具有同源性(6,27,37)存在。该区域也是一个富含精氨酸的基序，已知其具有RNA-结合活性(2). 因此，pTRL4的核定位和核仁定位都可以由其氨基酸序列中的特定基序决定。
两个假定的N糖基化位点（aa 119至121和aa 141至143）已在之前确定(14). 由于我们在细胞核内检测到TRL4产物，它似乎不太可能进入内质网，在内质网中，这些信号可以被膜相关糖基转移酶处理。
所有这些信息都来自菌株AD169的序列。在对Towne的TRL4进行DNA测序（使用Sequenase 2.0；Amersham）时，我们在4261、4232和4224位发现了三个核苷酸转换，导致预测的氨基酸序列相对于AD169的两个替换；aa 11是缬氨酸而不是丙氨酸，并且aa 61是丙氨酸而不是缬氨酸。Towne的ORF1和ORF3之间的DNA序列显示了四个核苷酸转换，三个位于4429、4415和4346位，一个已经报道的转换位于4450位(13).
uORF抑制TRL4的翻译。
AD169和Towne的5′前导序列分别插入pcDNA3上游ORF3，因为它们出现在它们的天然mRNA中。由此产生的两个结构，pTo/ORF1-2-3*和pAD/ORF1-2-3*（图。b） ，用于体外转录-翻译耦合分析，以确定pTRL4是否也在uORF存在的情况下产生。在这两种情况下，放射自显影分析均显示一条微弱的带，对应于带有标记pTRL4分子量的产品（图。，车道4和5）。这表明，在其原始背景下，ORF3仍能被核糖体识别，但与缺乏5′先导物时相比，其表达量极低（图。，泳道3）。
为了排除这种减少是由于转录差异造成的可能性，将质粒pTo/ORF3∗添加到混合物中，用于使用上述两种结构进行的每个反应。总mRNA的Northern blot分析表明，在该体外系统中，带有和不带有5′先导区的转录物的合成效率相当（图。b） ●●●●。该观察结果表明，转录后过程是导致TRL4表达减少的原因。此外，uORF2编码信息中的菌株多样性不影响这种抑制作用。
为了研究真核细胞中的这种现象，HEF、U373-MG细胞和COS7细胞被构建物pTo/ORF1-2-3*和pAD/ORF1-2-3*瞬时转染。MAb M2的重复间接免疫荧光检测不到特定产物的任何表达。在相同的实验中，根据所用的细胞类型，在用对照质粒pTo/ORF3*转染的细胞中检测到1到5%的FLAG表位。此外，对转染COS7细胞提取的总RNA的分析显示，转录物的细胞内数量没有显著差异（图。). 这些发现支持5′先导序列的存在对ORF3表达的翻译抑制，证实了无细胞分析的结果。
通过Northern blot分析从COS7细胞中提取的总RNA，这些细胞转染了对照载体（通道1）和质粒pTo/ORF3*（通道2）、pTo/ORF1-2-3*（通道3）和pAD/ORF1-2-3*（通道4）。对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）转录物的检测证实存在等量的细胞RNA。放射自显影术显示，所有三种质粒产生的转录物在转染细胞（1、2和3道）中的数量相似。
来自Towne和AD169的序列也获得了相同的效果，它们显示相同的uORF1，但uORF2有很大不同，而RNA的整个二级结构很可能是保守的。这可能表明抑制主要取决于uORF1的翻译。根据Geballe和Morris的模型(12)，核糖体停滞(26)即使uORF1的AUG密码子由于其非最佳共识背景而很少被识别，也可以解释显著的抑制作用(4). 或者，mRNA的特定二级结构可以解释启动效率的提高(23).
然而，这种体外系统不能准确反映体内发生的情况，因为病毒转录物中存在的3′非翻译区可能含有调节元件，这些调节元件被发现可以调节特定mRNA的翻译调节(32).
虽然在体外实验中，5′先导的存在显著降低了TRL4的表达，但在转染细胞中抑制作用是完全的。这种差异可归因于这两个系统的灵敏度阈值。正如Cao和Geballe所建议的那样，停滞核糖体在细胞中的影响可能比在无细胞系统中更明显(三). 在RRL中检测到TRL4的低表达可以用漏扫描机制解释，即一些核糖体无法在uORF1启动翻译并沿着信使继续扫描(24).
由于体外合成的RNA或转染实验中设计构建的RNA不能反映体内发生的情况，我们的研究结果无法回答β2.7信使在感染期间是否表达蛋白质的问题。事实上，文献中已经报道过体外表达病毒蛋白的例子(9)但在体内实验中尚未得到证实。
根据我们的研究结果和以前的报告显示，在病毒复制过程中，β2.7转录物5′末端下游ORF的表达暂时受到调节(13)，我们认为，我们观察到的构成性抑制作用可以在溶解感染或潜在和持续感染中部分或完全释放。这种基因表达的转录后调控并不罕见，因为一些关键真核基因、癌蛋白、受体和转录因子受到5′先导区的组成性抑制(20)可以通过生理条件和细胞分化过程进行调节(31). 因此，在与细胞类型和/或细胞分化相关的特定条件下，最有可能被uORF抑制的TRL4翻译可能发生。
