水泡性口炎病毒基质蛋白对宿主RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ诱导转录的影响

摘要

细胞感染水疱性口炎病毒（VSV）会导致宿主大分子合成迅速而有力地被阻断，包括抑制宿主DNA、RNA和蛋白质合成。VSV抑制宿主转录的能力已被广泛研究，已知发生在宿主RNA聚合酶的启动水平(30). VSV感染抑制了所有三种宿主RNA聚合酶（RNA聚合物I[RNAPI]、-II和-III）的活性，但RNAPII转录的基因似乎比RNAPI和RNAPIII转录的基因对病毒感染的影响更敏感(28,30).

先前的实验表明，病毒转录对于VSV阻断宿主转录至关重要(29)并暗示领导RNA参与其中。然而，最近发现病毒基质（M）蛋白在与VSV感染相关的细胞病变中发挥作用。M蛋白是一种主要的结构蛋白，通常通过在出芽过程中将病毒的核糖核蛋白核心与宿主质膜结合而在病毒组装中发挥作用（参考文献综述21). 然而，当M蛋白在缺乏其他病毒成分的情况下表达时，会导致VSV感染的细胞圆形特征(5,23,31). 此外，在缺乏其他病毒基因成分的情况下，M蛋白能够在体内抑制RNAPII依赖性启动子的宿主定向转录(2,三,11,25). M蛋白抑制宿主转录的能力非常强大，因为感染细胞中产生的M蛋白比M蛋白50%抑制靶基因表达所需的多1000倍(22). M蛋白抑制宿主转录的机制尚不清楚。

条件温度敏感性VSV突变体为M蛋白在抑制宿主基因表达中的作用提供了进一步证据，ts秒O82型(9).ts秒O82病毒在阻断宿主RNA合成和诱导VSV感染的细胞圆形特征方面存在缺陷(1,9,23). 的M基因ts秒O82病毒包含一个单点突变，导致蛋白质序列第51位的蛋氨酸到精氨酸替换。M51R突变与最近在T1026R1突变病毒的M蛋白中发现的突变相同，之前发现该病毒在阻断宿主RNA和蛋白质合成方面存在缺陷(10——12,27). 这种突变导致ts秒O82 M蛋白在所有温度下都有抑制RNAPII-依赖转录的能力缺陷，但不影响其在病毒组装中的功能，如互补分析所确定的(三,19). 这些结果表明，M蛋白在抑制宿主基因表达中的作用与其在病毒组装中的功能在遗传学上是不同的。MN1突变体强化了这一结论，该突变体是通过删除跨越氨基酸4到21的M蛋白区域而产生的。MN1蛋白表现出与ts秒O82M蛋白在抑制宿主基因表达方面表现出完全的活性，但其在病毒组装中的功能被消除(三). 最近，对从持续感染细胞中分离出的病毒的M基因进行了分析。v6病毒是从持续感染VSV的L细胞培养上清液中纯化出来的斑块(1,14,32). 当测试其抑制总宿主RNA合成的能力时，v6的有效性大约是野生型VSV的两倍，但没有ts秒O82病毒(1). v6病毒抑制宿主RNA合成的能力降低与M蛋白序列163位的突变有关，该突变导致天冬酰胺-天冬氨酸（N163D）替代(1). 因此，来自这两方面的数据ts秒O82和v6突变表明，M基因突变有助于减少病毒感染的细胞病变效应。

在M蛋白诱导的RNAPII抑制宿主细胞转录中，启动子的特异性很小（如果有的话）(22). 被M蛋白抑制的RNAPII-依赖性启动子包括具有多种激活序列的启动子，例如：猴病毒40（SV40）早期启动子(1——三); 腺病毒主要晚期启动子(22); 单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(22); 人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列启动子(25)，Rous肉瘤病毒(22)和小鼠乳腺肿瘤病毒（未发表结果）；Ⅰ类主要组织相容性复合体的细胞启动子(22)和β-干扰素(11); 和二氢叶酸还原酶的TATA-非依赖性启动子(22). 以前有报道称，一些RNAPII-依赖性启动子对VSV感染的抑制作用具有相对抗性，例如对干扰素刺激反应的基因(6). 然而，这种耐药性似乎需要在病毒感染后表达双链RNA。这些启动子对在缺乏其他病毒成分的情况下表达的M蛋白的抑制作用没有抵抗力(22). 所有被检测的启动子，包括那些带有干扰素刺激反应元件的启动子似乎与SV40启动子一样容易受到M蛋白诱导的抑制(22和未发布的结果）。

在M蛋白诱导的RNAPII-依赖性转录抑制中缺乏启动子特异性，这表明M蛋白使基础转录机制的某些成分失活。然而，目前尚不清楚M蛋白是否单独抑制其他宿主RNA聚合酶、RNAPI和RNAPII的转录。或者，其他病毒成分可能参与抑制RNAPI-或RNAPII-依赖性转录。这里提出的实验定义了M蛋白在单独表达和病毒感染的情况下抑制每个宿主RNA聚合酶定向转录的能力。发现M蛋白突变ts秒O82病毒和来自持续感染细胞的v6病毒降低了VSV抑制poly（A）合成的能力⁺和聚（A）⁻RNA。核径流分析表明，VSV抑制了18S rRNA和α-微管蛋白基因的转录，这两个基因分别依赖于RNAPI和RNAPII，而wt病毒感染可增强RNAPII对5S rRNA的转录。同样，如共转染实验所示，在没有其他病毒基因产物的情况下，M蛋白抑制来自RNAPI-和RNAPII-依赖性启动子的转录。然而，RNAPII对转录的抑制似乎取决于启动子的性质。M蛋白的表达抑制了RNAPIII依赖性腺病毒VA启动子的转录，但刺激了5S rRNA的转录。

wt、v6和ts秒聚（A）上的O82病毒⁺和聚（A）⁻通过测定RNA合成来区分M蛋白通过RNAPII与通过RNAPI和RNAPII抑制转录的能力。BHK和小鼠L细胞感染了wt、v6和ts秒O82病毒（或模拟感染）多重感染20 PFU/细胞。在感染后2、4和6小时，细胞被标记为[^三H] 尿苷（20μCi/ml）30分钟，标记宿主RNA和病毒RNA。在放线菌素D存在下培养并标记平行样品，以测量病毒特异性RNA合成。收集细胞并将其重新悬浮在十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液中，将裂解产物在寡聚（dT）纤维素（InVitrogen）存在下培养，以将RNA物种分离为聚（A）⁺和聚（A）⁻分数。用三氯乙酸沉淀这些分离组分的等分，并通过闪烁计数测定酸不溶性放射性。从总计数中减去在放线菌素D存在下培养的样品值，以确定宿主RNA合成速率。

表中显示了感染L细胞的代表性实验（四个独立实验）的数据​表1。1感染wt-VSV的L细胞显示，两种poly（a）的放线菌素D抗性病毒RNA合成逐渐增加，宿主RNA合成逐渐减少⁺和聚（A）⁻实验过程中的RNA。与其他单元格类型中的先前数据相比(28,30)，聚（A）⁻RNA合成对VSV诱导的抑制至少与poly（A）一样敏感⁺RNA合成。在感染了ts秒O82病毒含有M51R M基因突变，病毒RNA的合成水平与感染wt-VSV的细胞相似。ts秒O82病毒抑制poly（A）的能力下降⁺和聚（A）⁻宿主RNA合成，支持M蛋白参与抑制poly（A）合成的观点⁺和聚（A）⁻RNA。同样，含有N163D M基因突变的v6病毒未能抑制poly（A）⁺和聚（A）⁻宿主RNA合成与wt-VSV一样有效。感染v6病毒的细胞合成的病毒RNA比感染wt-VSV的细胞少得多，尽管病毒蛋白的合成水平与感染wt-VSV的细胞相当(1,14). 这是由于从持续感染的细胞中分离出的病毒感染细胞的翻译控制不同，导致病毒mRNA的翻译效率更高(14).

BHK细胞也获得了类似的数据。宿主poly（A）⁺感染BHK细胞的RNA合成如图所示。​图1A1A为未感染控制值的百分比。wt VSV抑制聚（A）⁺感染后6小时RNA合成几乎完全，而ts秒O82和v6病毒对poly（A）有缺陷的抑制作用⁺RNA合成。在感染后2小时，poly（A）没有检测到抑制作用⁺RNA合成ts秒O82病毒和v6病毒的抑制介于ts秒O82病毒和wt VSV。v6病毒抑制poly（A）的能力⁺感染后6小时，未感染对照组的RNA合成达到50-60%的恒定水平，而ts秒O82病毒继续逐步抑制poly（A）⁺随着时间的推移，RNA合成，因此到感染后6小时，这两种病毒抑制宿主RNA合成的程度相似。图中显示了类似的趋势。​图1B1B演示wt和突变病毒对宿主poly（A）的影响⁻RNA合成。聚（A）的抑制⁻通过wt-VSV合成RNA（图。​（图1B）1B） 没有poly（A）的抑制速度快⁺RNA合成（图。​（图1A）。1A） ●●●●。M基因突变降低了病毒抑制poly（A）的能力⁻RNA合成。然而，聚（A）⁺RNAPII介导的RNA合成似乎比poly（A）对M基因突变的影响更敏感⁻RNAPI和RNAPII合成RNA。来自L细胞和BHK细胞的数据表明，M基因突变的病毒在减少poly（A）的能力上不如wt-VSV有效⁺和聚（A）⁻RNA合成，支持M蛋白参与抑制两个poly（A）的转录的观点⁺和聚（A）⁻RNA。

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图1

聚乙烯（A）⁺（A） 和聚（A）⁻（B） 感染wt的BHK细胞中的RNA合成，ts秒O82和v6病毒。BHK细胞感染wt（开环），ts秒O82（闭合正方形）和v6（闭合三角形）病毒的感染倍数为20PFU/细胞。在放线菌素D的存在下感染平行样本。在感染后2、4和6小时，细胞被标记为[^三H] 尿苷（20μCi/ml）30分钟。收集细胞并在SDS裂解缓冲液中进行裂解。分离多边形（A）⁺和聚（A）⁻RNA、裂解物在低聚（dT）纤维素（Invitrogen）存在下培养，在高盐缓冲液中洗涤，并在低盐缓冲液洗脱。然后用7%的三氯乙酸将样品沉淀在冰上，并用7%三氯乙酸洗涤两次。用闪烁计数法测量酸沉降放射性。从总计数中减去在放线菌素D存在下培养的样品值，以确定宿主RNA合成速率。所示数据为四个实验的平均值±标准偏差。

在没有其他病毒成分的情况下，通过将含有RNAPI-、RNAPII-和RNAPII-dependendent启动子的质粒DNA与体外转录的M mRNA一起共转染到BHK细胞，检测M蛋白对每个宿主RNA聚合酶指导的转录的影响。M蛋白通过体外转录的M mRNA表达，而不是通过转染质粒DNA表达，以避免M蛋白对需要宿主转录活性的DNA载体自身合成的抑制(2,4). 在核径流试验中测量这些共转染细胞的转录活性，其中分离的细胞核在含有[α]的体外转录反应混合物中孵育-³²P] UTP公司。核径流分析的基础是，只有在分离细胞核之前启动的转录物在径流反应中被拉长，因此标记量反映了体内活跃转录的聚合酶数量。然后将标记的RNA与DNA探针杂交，DNA探针固定在硝酸纤维素膜过滤器的缝隙中，并通过放射自显影术进行分析。这是测量单个RNA体内转录率的首选方法，不同于通过Northern印迹等技术测量稳态RNA水平(16). 含有RNAPI启动子pHrMr的转染质粒DNA编码小鼠rRNA基因，该基因被BHK细胞中的仓鼠聚合酶识别(26). 然而，产生的转录物与内源性仓鼠rRNA基因没有足够的序列相似性，无法进行杂交。因此，在这些实验中只测量了转染细胞中也表达M蛋白的转录。

为了通过RNAPI、BHK细胞在直径100 mm的培养皿（约3×10）中测定M蛋白对转录的影响⁶将M mRNA（36或360 ng）或酵母RNA（360 ng）共同转染作为阴性对照(1)以及恒定量的pHrMr质粒DNA。转染后24小时，分离细胞核，在核径流反应中拉长总RNA(2). 标记的RNA与线性化的质粒DNA杂交，其放射自显影图如图所示。​图2A。2A.wt M蛋白对pHrMr中RNAPI依赖启动子转录的剂量依赖性抑制很明显。作为对照，pHrCr质粒DNA与ts秒O82 M mRNA没有导致可检测到的转录抑制（图。​（图2B）。2B） ●●●●。作为额外的对照，没有与未转染pHrMr DNA的细胞的标记RNA杂交（图。​（图2C），2C） 这表明在这些实验中只测量了转染细胞中的转录，该细胞也表达M蛋白。这些数据表明，在没有其他病毒基因产物的情况下，wt-VSV的M蛋白抑制RNAPI依赖性转录。

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图2

M蛋白对依赖于RNAPI的基因转录活性的影响。（A） 用pHrCr质粒DNA和0、36或360 ng经体外转录的wt M mRNA共同转染BHK细胞。未接受M mRNA的细胞用360 ng酵母RNA作为阴性对照。在转染后24小时，在[α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维膜过滤器上的线性化pHrCr质粒DNA杂交。（B） 将BHK细胞与pHrMr质粒DNA和0或360ngts秒O82 M mRNA。通过上述A组的核径流分析检测pHrMr DNA的转录。（C）BHK细胞转染pHrCr DNA或不转染质粒DNA作为杂交特异性的对照。通过上述A组的核径流分析检测pHrMr DNA的转录。（D）BHK细胞以20PFU/细胞的多重感染率感染wt或ts秒O82病毒。模型感染细胞作为对照。在感染后6小时分离细胞核，在存在[α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维素膜上的18S rRNA的cDNA片段杂交。（E） 通过密度测定法对四个（A和D）或三个（B）单独实验的数据进行量化，并表示为转染实验中不含M mRNA的对照的百分比，以及病毒感染细胞的未感染对照的百分比。数据为平均值±标准偏差。

在核径流实验中，通过RNAPI定量比较转染mRNA表达的M蛋白对转录的影响和病毒感染的影响。BHK细胞感染wt或ts秒O82病毒多次感染20个PFU/细胞或被模拟感染。在感染后6小时分离细胞核，总RNA在核径流反应中被拉长。将标记的RNA与BHK细胞总RNA逆转录-PCR产生的300-bp 18S rRNA cDNA探针杂交。图中的自动放射自显影。​图2D2D显示wt-VSV抑制18S rRNA基因的转录，而ts秒O82病毒并不像wt-VSV那样有效地抑制转录。四个独立实验的结果类似于图。​图2A，2A、 B和D通过密度测定法定量（图。​（图2E）。2E） ●●●●。数据表示为病毒感染细胞结果的未感染对照的百分比，或转染实验中未转染M mRNA的对照细胞的百分比。当360 ng M mRNA与pHrMr共同转染时，wt-VSV对18S rRNA合成的抑制程度与M蛋白相似，表明M蛋白对RNAPI依赖性转录的抑制程度相当于病毒感染期间观察到的抑制程度。There was little or no inhibition byts秒O82 M蛋白在病毒感染和转染mRNA中表达ts秒感染后6小时在核径流实验中观察到O82病毒（图。​（图2E）2E） 与[^三H] 尿苷并入聚（A）⁻RNA（图。​（图11B） ●●●●。

M蛋白对RNAPII介导的转录的影响。

核径流实验类似于图。​图22通过RNAPII比较了转染mRNA表达的M蛋白与病毒感染对转录的影响（图。​（图3）。三). 用M mRNA和pSV2.CAT质粒DNA共转染BHK细胞。pSV2.CAT含有氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因，受RNAPII-依赖性SV40早期启动子控制(15). 在图1所示的实验中。​图3A，三A、 用wt M mRNA（36或360 ng）或酵母RNA（360 ng；阴性对照）与恒定量的pSV2.CAT质粒DNA共同转染BHK细胞。转染后24小时收集细胞，通过核径流分析检测pSV2的转录。wt M蛋白的表达以剂量依赖的方式抑制了来自pSV2.CAT质粒DNA的RNAPII依赖性转录（图。​（图3A），三A） ，而在与ts秒O82 M mRNA（图。​（图3B）。三B） ●●●●。由于pSV2.CAT仅包含病毒或细菌序列，因此在核径流实验中没有检测到与未转染细胞转录物的交叉杂交（图。​（图3C）。三C） ●●●●。在这些核径流实验中，wt M蛋白对pSV2.CAT依赖性转录的抑制程度（图。​（图3E）三E） 与之前发表的实验中用相同比例的每细胞M mRNA进行的酶活性测量的CAT表达抑制程度相似（参见，例如参考文献22). 这些数据也与之前的核径流和Northern印迹实验一致，在这些实验中，M蛋白是从质粒DNA而不是转染的mRNA表达的(2).

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图3

M蛋白对RNAPII依赖基因转录活性的影响。（A） 用pSV2.CAT质粒DNA和0、36或360 ng经体外转录的wt M mRNA共同转染BHK细胞。未接受M mRNA的细胞用360 ng酵母RNA作为阴性对照。转染后24小时，分离细胞核，并在α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维膜过滤器上的线性化pSV2.CAT质粒DNA杂交。（B） BHK细胞与pSV2.CAT质粒DNA和0或360 ngts秒O82 M mRNA。通过上述A组的核径流分析测定pSV2的转录。（C）BHK细胞转染pSV2。CAT DNA或无质粒DNA作为杂交特异性的对照。如上文所述，通过核径流分析对A组pSV2.CAT DNA的转录进行分析ts秒O82病毒。模型感染细胞作为对照。在感染后6小时分离细胞核，在存在[α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维素膜上的α-微管蛋白mRNA的cDNA片段杂交。（E） 通过密度测定法对四个（A和B）或两个（D）单独实验的数据进行量化，并表示为转染实验中不含M mRNA的对照的百分比，以及病毒感染细胞中未感染对照的百分比。数据为平均值±标准偏差。

利用病毒感染细胞中细胞α-微管蛋白基因的转录，定量比较转染mRNA表达的M蛋白与病毒感染对核径流分析中RNAPII依赖性转录的影响。选择α-微管蛋白基因是因为它能产生丰富的细胞转录物，被认为是RNAPII活性的代表。BHK细胞感染了wt-VSV或ts秒O82病毒多次感染20个PFU/细胞或被模拟感染。感染后6小时，分离细胞核并在核径流反应中孵育。将标记的RNA与从仓鼠肾脏cDNA中扩增的600-bpα-微管蛋白cDNA片段杂交，该cDNA由随机六聚体和寡核苷酸（dT）引物的poly（a）RNA制成（由威克森林大学医学院Paul Dawson提供）。

wt-VSV对α-微管蛋白基因转录的抑制程度大于ts秒O82病毒（图。​（图3D三D和E）。然而，在核径流测定中，wt VSV对α-微管蛋白基因转录的抑制作用（35%的对照未感染细胞）不如病毒诱导的对[^三H] 尿苷并入聚（A）⁺RNA（<10%的对照未感染细胞，图。​图1A）。1A） ●●●●。这与18S rRNA转录的核径流分析和[^三H] 尿苷并入聚（A）⁻RNA（图。​（图1B1B和​和2D）2D） 并且可能反映了α-微管蛋白基因转录相对于其他RNAPII-依赖转录物对病毒感染抑制作用的抵抗。因此，通过转染M mRNA（360 ng）对pSV2.CAT的RNAPII依赖性转录的抑制实际上大于通过感染wt-VSV对α-微管蛋白基因转录的抑制（图。​（图3三E） ●●●●。

在图中所示的实验中。​图4A，4A、 用wt M mRNA（36或360 ng）或酵母RNA（360 ng；阴性对照）与pAdVantage质粒DNA（Promega）共同转染BHK细胞，pAdVantige质粒DNA包含腺病毒VAI和VAII RNA的RNAPII-依赖性启动子。在转染后24小时，收集细胞，通过核径流分析检测pAdVantage DNA的转录。wt M蛋白的表达以剂量依赖的方式抑制来自pAdVantage质粒DNA的RNAPII-依赖性转录（图。​（图4A），4A） ，而在与ts秒O82 M mRNA（图。​（图4B）。4B） ●●●●。由于pAdVantage仅包含病毒或细菌序列，因此在核径流实验中没有检测到与未转染细胞转录物的交叉杂交（图。​（图4C）。4C） ●●●●。RNAPII-依赖性转录的抑制水平（图。​（图4D）4D） 与图中观察到的RNAPI-和RNAPII-依赖转录的抑制水平相似。​图22和​和3。三因此，腺病毒VA启动子驱动的转录与RNAPI或RNAPII依赖性启动子对M蛋白诱导抑制的敏感性没有显著差异。本研究中使用的启动子先前已被描述为唯一依赖于RNAPI、-II或-III进行转录。然而，如果M蛋白表达允许改变聚合酶的使用，则有可能由于另一个聚合酶转录的贡献而低估了其中一个聚酶的抑制程度。

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图4

M蛋白对依赖RNAPII的腺病毒VA基因转录活性的影响。（A） 用pAdVantage（pAdV）质粒DNA和0、36或360 ng经体外转录的wt M mRNA共同转染BHK细胞。未接受M mRNA的细胞与360 ng酵母RNA共同转导作为阴性对照。转染后24小时，分离细胞核，并在α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维膜过滤器上的线性化pAdV质粒DNA杂交。（B） 用pAdV质粒DNA和0或360 ngts秒O82 M mRNA。通过上述A组的核径流分析检测pAdV DNA的转录。（C）BHK细胞转染pAdV DNA或不转染质粒DNA作为杂交特异性的对照。pAdVantage DNA的转录通过上述A组的核径流分析进行分析。（D）四个（A）或三个（B）单独实验的数据通过密度测定法进行量化，并表示为不含M mRNA的对照组的百分比。数据为平均值±标准差。

与腺病毒VA启动子的抑制作用相反，M蛋白的表达刺激了5S rRNA的RNAPII-依赖性转录。在图中的实验中。​图5A，5A、 用wt M mRNA（360 ng）或酵母RNA（360 ng；阴性对照）转染BHK细胞，并在转染后24小时通过核径流分析进行分析。相比之下，细胞感染了wt-VSV或ts秒O82病毒或模拟感染，然后在感染后6小时进行分析（图。​（图5B）。5B） ●●●●。将核径流反应中产生的标记RNA与仓鼠5S rRNA cDNA探针杂交(17)并通过放射自显影和密度计进行分析。与未感染细胞相比，wt VSV感染细胞中的5S rRNA转录受到大约六倍的刺激，而合成ts秒O82病毒感染的细胞显示出与未感染细胞相似的水平（图。​（图5C）。5C） ●●●●。同样，在转染M mRNA的细胞中，5S rRNA转录受到三倍的刺激。在这些实验中使用的条件下，大约40%到60%的细胞被转染(23). 因此，图中的数据。​图5C5C低估了M蛋白的刺激程度，因为测量的转录率包含了转染细胞和未转染细胞的贡献。这种5S rRNA转录的刺激与腺病毒VA RNA转录的抑制形成显著对比。

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图5

M蛋白对依赖RNAPII的5S rRNA基因转录活性的影响。（A） 用0或360 ng经体外转录的wt M mRNA转染BHK细胞-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维膜过滤器上的5S rRNA的线性cDNA杂交。（B） BHK细胞以每细胞20个PFU的多重感染率感染wt或ts秒O82病毒。模型感染细胞作为对照。在感染后6小时分离细胞核，在存在[α-³²P] UTP公司。分离标记的RNA并与固定在硝化纤维素膜上的5S rRNA的cDNA杂交。（C） 通过密度测定法对四个单独实验的数据进行量化，并表示为转染实验中不含M mRNA的对照组的百分比，以及病毒感染细胞中未感染对照组的百分数。数据为平均值±标准偏差，并绘制在对数刻度上，以容纳所有值。

之前的一项研究检查了在VSV感染期间RNAPII和RNAPII产生的单个小RNA转录物的合成，表明5.8S、U1和U2 RNA的合成减少，而5S和4S RNA的合成没有显著减少(13). 然而，在之前的研究中未观察到VSV刺激5S RNA转录。与我们结果的差异可能与他们使用连续标记[^三H] 尿苷贯穿感染与感染后6h的核径流测定。尽管如此，这些结果都与早期的工作一致，这表明RNAPII的转录对病毒感染最不敏感(28). 然而，RNAPII-依赖性VAI和VAII启动子对M蛋白诱导的宿主转录抑制的敏感性至少与RNAPI-和RNAPII-dependent启动子相同。因此，RNAPII对转录的抑制依赖于启动子的性质。

M蛋白对RNAPII-依赖启动子转录的影响的差异可能是由于5S rRNA启动子具有不同于VA启动子的结构。VA启动子与tRNA基因启动子相似，因为它们有两个分离的可变空间元件，即方框A和方框B(20). 启动复合物的形成发生在TFIIIC识别框B时，而框A将转录因子定向于起始位点。结合的TFIIIC允许多亚单位复合物TFIIIB的结合，这是RNAPII招募和转录启动的关键步骤。5S rRNA基因启动子不包含A盒和B盒，因此没有TFIIIC结合位点。转录起始是由一个称为box C元件的基因内控制区介导的。该元素被TFIIIA识别，促进TFIIIC的结合，从而允许TFIIIB的后续结合。然而，有一些证据表明，细胞中存在预先形成的TFIIIA-TFIIIC复合物，以促进RNAPIII转录(20,34). 5S和VA RNAPII启动子之间的这种差异可以解释病毒感染以及在没有其他病毒成分的情况下表达M蛋白对转录的不同影响。

这里的实验结果与M蛋白在VSV介导的所有三种宿主RNA聚合酶的转录关闭中发挥重要作用的观点一致。M蛋白通过一种共同的机制抑制所有三种宿主RNA聚合酶的转录的假设是有吸引力的。一种可能性是M蛋白的表达使所有三种宿主RNA聚合酶所需的细胞因子失活，例如TATA-结合蛋白（TBP），它是所有三种聚合酶的转录起始因子的亚单位(34). 事实上，最近的证据表明，VSV诱导的RNAPII-依赖性转录的抑制涉及TBP的失活(33). 如果TBP的失活导致所有三种宿主RNA聚合酶的抑制，则失活不得阻止含有TBP的TFIIIB与TFIIIA在5S rRNA基因转录中的相互作用。观察到的刺激可能是由于其他RNAPIII依赖性启动子的抑制导致TFIIIB的可用性增加。或者，M蛋白可以通过不同的细胞靶点来抑制每个宿主RNA聚合酶。这与脊髓灰质炎病毒的情况类似，其中病毒3C蛋白酶通过TBP失活抑制RNAPII-依赖性转录(8)但通过TFIIIC失活抑制RNAPIII依赖性转录(7).

最近在爪蟾M蛋白抑制RAN GTPase及其鸟嘌呤核苷酸交换因子RCC1介导的RNA和蛋白质核质转运的卵母细胞(18). 因此，抑制宿主转录可能是M蛋白诱导的核质转运抑制的间接作用，这可能导致所有三种宿主RNA聚合酶的转录起始因子的可用性降低。这似乎不太可能，因为BHK细胞中温度敏感性RCC1突变对核转运的抑制不会像病毒感染细胞中那样显著影响转录速率(24). 此外，病毒诱导的TBP活性抑制似乎与核提取物中TBP水平的差异无关(33). 确定每种宿主RNA聚合酶M蛋白作用的细胞靶点的未来实验将解决所有三种聚合酶失活是单一机制还是多重机制的问题。

致谢

参考文献