麻疹病毒(MV)是一种负链、包膜RNA病毒,属于麻疹病毒中的属副粘病毒科家庭。血液中感染的原代细胞是单核细胞(8),感染的单核细胞可能负责病毒从呼吸道传播,就像在MV感染的动物模型中发生的那样(15). 在麻疹继发病毒血症阶段,全身小血管的内皮细胞(EC)受到感染,这通常伴随着单核浸润和周围组织的感染(有关综述,请参阅参考文献10). 目前,尚不清楚EC的传播是由无细胞病毒感染还是与循环中感染MV的细胞相互作用所致。
体外单核细胞MV感染诱导白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的表面表达(1,26)是细胞粘附分子整合素家族的成员。LFA-1通过与内皮细胞上的主要反受体细胞间粘附分子-1(ICAM-1)结合,介导细胞间粘附,促进白细胞向内皮细胞募集并随后通过内皮细胞连接迁移。因此,LFA-1在单核细胞上的表达增加可能导致对内皮细胞的粘附性增强,并有助于病毒传播。
有人提出,MV的野生型(wt)菌株比减毒疫苗菌株是更好的LFA-1表达调节剂(1,26)这可能是这些菌株类型之间的一个重要区别,以增强细胞间的相互作用和病毒的传播。然而,之前的LFA-1研究只分析了有限数量的菌株(1,2,22,26). 在本研究中,我们检测了一系列MV菌株对LFA-1的诱导作用。我们确定了诱导LFA-1的wt和疫苗菌株以及其他未能诱导的菌株。我们还评估了MV感染的单核细胞的粘附和病毒对内皮细胞的传播,以确定不同MV菌株改变LFA-1表达的能力与其致病潜力之间是否存在关系。
MV感染的单核细胞中LFA-1的表达。U937细胞在添加了10%胎牛血清(FCS;HyClone,Logan,Utah)和PSG(每毫升100 U青霉素,每毫升100μg链霉素,和每毫升2 mM)的RPMI 1640中悬浮培养我-谷氨酰胺[GIBCO BRL,纽约州格兰德岛])。莫兰人(MOR)(12)萨格勒布(ZAG)(13)和CAM-70(CAM)(24)如前所述,将减毒活菌株作为冻干疫苗提供,并在非洲绿猴肾Vero细胞中繁殖(19). jm77(18)、Chi1(18)和Pa2(20)从未接种麻疹疫苗的个体中分离出wt株,并在Vero细胞中最少传代5-8次。Ph26 wt菌株(9)然而,在我们实验室的Vero细胞中繁殖之前,已广泛传代。U937细胞的感染倍数为0.1,详见其他章节(2). 感染后24小时间隔(p.i.),5×105细胞分别在含有5%FCS(PBS–5%FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS;GIBCO BRL)和维生素(GIBCO BREL)中清洗一次,然后用异硫氰酸荧光素结合鼠单克隆抗体(MAbs;Ancell,Bayport,Mich.)在冰上孵育。针对MV血凝素(H)蛋白制备的MAb 81-I-366(三)因此,使用标记有异硫氰酸荧光素的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体(Southern Biotechnology Associates,Inc.,阿拉巴马州伯明翰)进行第二个培养步骤。染色细胞用PBS–5%FCS清洗三次,并在1%多聚甲醛溶液中重新悬浮(密苏里州圣路易斯市西格玛),然后在FACScan流式细胞仪上进行分析,并使用适当的门控(加利福尼亚州圣何塞市贝克顿·迪金森)。
U937人单核细胞系用于评估LFA-1的表达,因为据报道,U937细胞表面蛋白的变化与新鲜分离的外周血单核细胞的变化一致(1). 通过荧光激活细胞分选(FACS)分析,在24至96 h p.i.期间监测LFA-1的表面表达(表). 在整个感染过程中,90%以上的模拟和MV感染的U937细胞LFA-1表达阳性。只有在感染MOR和ZAG疫苗株以及Ph26 wt后,才能观察到LFA-1染色的细胞的平均荧光强度(MFI)通道值增加。图中FACS生成的直方图向右移动说明了这一点。相反,在感染jm77、Chi1或Pa2 wt株和CAM疫苗株后,没有诱导LFA-1。MFI平均倍数增加的比较显示,到96小时p.i.时,感染MOR、ZAG或Ph26的细胞中LFA-1表达的诱导几乎是模拟感染细胞中的两到三倍(图。a) ●●●●。然而,值得注意的是,我们用MOR观察到的LFA-1表达增加与以前的报告不同,后者没有发现诱导(1,26). 在免疫荧光分析中,通过表达最丰富的病毒蛋白MV核蛋白(N)的细胞百分比来评估所有菌株的感染。这些值如下:对于菌株MOR,为10%至50%;ZAG,50%至100%;CAM,10%至50%;Ph26,50%至100%;jm77,10%至50%;Chi1,10%;和Pa2,1到10%。
表1
LFA-1在模拟和MV感染的U937细胞上的表面表达一
感染菌株和MAb | 表达式确定于:
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24小时
| 48小时
| 72小时
| 96小时
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货币金融机构 | % (+) | 货币金融机构 | % (+) | 货币金融机构 | % (+) | 货币金融机构 | % (+) |
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无(模拟感染) |
免疫球蛋白G | 3.24 | 1.06 | 3.35 | 1.41 | 2.79 | 1.37 | 2.94 | 2.15 |
LFA-1型 | 30.89 | 98.26 | 33.49 | 98.63 | 32.92 | 98.37 | 26.29 | 92.63 |
铁道部 |
免疫球蛋白G | 4.32 | 1.44 | 4.09 | 1.93 | 4.36 | 3.27 | 4.36 | 5.18 |
LFA-1型 | 31.21 | 98.58 | 40.19 | 99.24 | 45.2 | 99.16 | 49.1 | 98.88 |
ZAG公司 |
免疫球蛋白G | 3.6 | 2.16 | 5.33 | 9.06 | 4.34 | 6.43 | 4.74 | 7.54 |
LFA-1型 | 31.69 | 97.89 | 47.16 | 98.12 | 43.99 | 97.44 | 44.72 | 93.49 |
计算机辅助制造 |
免疫球蛋白G | ND(无损检测)b条 | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | 2.08 | 0.52 | 4.85 | 8.01 |
LFA-1型 | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | 29.07 | 95.63 | 27.74 | 95.34 |
第26页 |
免疫球蛋白G | 4.86 | 2.7 | 5.57 | 6.28 | 4.76 | 6.09 | 7.99 | 20.12 |
LFA-1型 | 35.10 | 98.11 | 45.77 | 98.89 | 53.33 | 98.91 | 73.75 | 99.01 |
jm77型 |
免疫球蛋白G | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | 2.13 | 0.69 | 5.27 | 8.24 |
LFA-1型 | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | ND(无损检测) | 29.86 | 95.86 | 27.24 | 93.92 |
Chi1公司 |
免疫球蛋白G | 3.79 | 0.79 | 4.41 | 0.6 | 2.96 | 0.71 | 2.92 | 1.39 |
LFA-1型 | 30.26 | 97.6 | 31.57 | 98.71 | 31.63 | 98.27 | 26.17 | 92.75 |
第2页 |
免疫球蛋白G | 4.02 | 1.88 | 3.83 | 1.99 | 3.03 | 1.41 | 3.07 | 1.84 |
LFA-1型 | 30.06 | 98.69 | 32.05 | 98.51 | 31.83 | 97.77 | 26.16 | 91.85 |
通过FACS分析定量模拟或MV感染U937细胞在96 h p.i.的表面LFA-1表达。在模拟感染细胞面板中,显示了小鼠IgG(实线)和LFA-1(虚线)MAb结合的直方图。在所有其他面板中,显示了LFA-1单克隆抗体与MV感染细胞(实线)和模拟感染细胞(虚线)结合的直方图重叠。M1表示根据小鼠IgG-MAb结合排除用于数据分析的区域。
在FACS分析中,使用LFA-1(a)或MV H(b)作为主要抗体,比较MV感染与模拟感染U937细胞的MFI平均增加倍数。所示数据来自重复实验。未对CAM和jm77病毒株进行24小时时间点的数据分析。
MV H蛋白是病毒附着到宿主细胞受体所必需的表面糖蛋白,可能以剂量依赖的方式参与调节LFA-1的表达增加(2). 因此,通过FACS分析确定了受感染单核细胞上表面MVH的表达,MFI的平均倍数增加如图所示。b.对于诱导LFA-1的菌株,表达MV H蛋白。然而,CAM感染导致高水平、持续的MVH表达,而没有LFA-1诱导。同样,jm77和Pa2在其他菌株中以与LFA-1诱导相关的水平表达MV H,但LFA-1没有诱导。MV-H表达的增加也与LFA-1的增加不成正比。ZAG在96 h p.i.时最明显地证明了这一点,尽管其MV h表达水平比Ph26高14倍,但LFA-1诱导水平较低。
单核细胞对EC单层的粘附。如前所述分离人脐静脉内皮细胞(17)并在M199培养基(马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker)中生长,每毫升补充20%热灭活FCS(HyClone)、16 U肝素(新泽西州樱桃山Elkins-Sinn)、50μg内皮细胞有丝分裂原(马萨诸塞州斯托顿Biomedical Technologies Inc.)和PSG。EC以5×10的速度播种4细胞/孔置于涂有明胶的96-well平底板(Costar,Cambridge,Mass.)中,隔夜培养直至汇合。MV感染的U937细胞在37°C和5%CO中造粒并标记30分钟2最终浓度为5μM的荧光铬钙黄绿素AM(分子探针,俄勒冈州尤金)。标记细胞在RPMI 1640–1%FCS中清洗两次,用台盼蓝染色以检查存活率,并在2×10的条件下重新悬浮6RPMI 1640中的细胞/ml–1%FCS。在添加100μl标记的U937细胞/孔(2×10)之前,使用移液管用RPMI 1640–1%FCS轻轻清洗EC单层两次5单元格)。同时加入未标记的受感染U937细胞作为背景荧光的测量(F类b条). 允许在37°C和5%CO中粘附30分钟2.总荧光(F类t吨)使用SPECTRAF荧光计(北卡罗来纳州三角研究公园TECAN)在485 nm(激发)和530 nm(发射)波长下进行测量。通过在100μl RPMI 1640–1%FCS中洗涤三次,去除非粘附性U937细胞,剩余荧光(F类x个)已测量。粘附率计算如下[(F类x个−Fb条)/(F类t吨−Fb条)] × 100. 数据通过双向方差分析(病毒株逐个运行)进行分析,无交互作用。使用Dunnett的多重比较程序将每个菌株的平均粘附力与模拟感染细胞的粘附力进行比较(7).
通过修改先前描述的程序,进行粘附性分析(4,23,25)研究LFA-1表达的增加是否与单核细胞对内皮细胞的粘附性增强有关。尽管一些MV感染的U937细胞比模拟感染的细胞更具黏附性,但黏附增强与LFA-1表达增加无关(表). 感染LFA-1诱导株MOR和ZAG或非诱导株CAM和Chi1的单核细胞的粘附性均显著高于模拟感染细胞(0.05显著性水平)。添加阻断性抗ICAM-1单克隆抗体并没有降低MV诱导的粘附性(数据未显示)。
表2
感染性菌株 | 骨料尺寸(单元数量)b条 | LFA-1感应(折叠)b条 | MV H表达(倍数)b条 | %附着力c(c) | %EC感染d日
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有联系人 | 没有接触 |
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无(模拟感染) | ≤3 | 1 | 1 | 33.5 ± 6.8 | 0 | 0 |
铁道部 | 5–10 | 1.87 | 3.50 | 46.9 ± 7.4 | 100 | 1 |
ZAG公司 | 5–10 | 1.71 | 51.74 | 63.3 ± 7.5 | 100 | 100 |
计算机辅助制造 | ≤3 | 1.04 | 6.54 | 49.4 ± 6.9 | 100 | ≤10 |
第26页 | ≥20 | 2.81 | 3.71 | 37.6 ± 4.1 | 100 | <1 |
jm77型 | ≤3 | 1.02 | 1.16 | 37.1 ± 8.3 | ≤50 | <1 |
Chi1公司 | ≤3 | 1.01 | 1.25 | 43.4 ± 4.9 | 10 | <1 |
第2页 | ≤3 | 1.01 | 1.25 | 34.0 ± 4.1 | <1 | 0 |
MV感染后白细胞培养物中大细胞聚集体的形成(1,22,26)促进病毒传播(1)可能是通过促进细胞间的接触。LFA-1和(2)和MV H(2,22)蛋白质参与了这种效应的调节。然而,在我们的分析中,无论MV H的表达如何,只有LFA-1诱导菌株的聚集是明显的(表),即使每次观察长达7天(数据未显示)。因此,MV诱导的聚集和粘附可能涉及不同的机制,同型粘附部分由LFA-1介导,异型粘附似乎是LFA-1独立的。
单细胞病毒向内皮细胞传播。
MV感染的U937细胞在RPMI 1640生长培养基中与内皮细胞直接孵育,或使用装有3.0μm孔径过滤器(Costar)的Transwell室进行物理分离,以允许病毒而非细胞通过。在24小时覆盖后,移除U937细胞(96小时p.i.),并在PBS中清洗EC单层,并在M199生长培养基中培养。额外24小时后,在12孔显微镜载玻片上采集内皮细胞。在丙酮固定细胞上进行免疫荧光分析,并在37°C下与抗H单克隆抗体和抗N单克隆抗体83-VII-KK2孵育30分钟(三),然后使用荧光显微镜进行观察。
MV可在与感染的U937细胞共培养后成功传播给EC(表). 由于无论使用CAM、非诱导菌株还是三种LFA-1诱导菌株中的任何一种,整个EC单层都受到感染,因此传播增强与LFA-1表达增加无关。对于我们小组中的大多数菌株,细胞接触对有效的MV传播至关重要,因为大多数感染性病毒似乎与细胞相关,不能自由通过过滤器(表). 相比之下,感染了ZAG的U937细胞在释放感染性病毒方面似乎同样熟练,在没有或存在细胞接触的情况下感染EC所必需的病毒。在未与CAM感染的U937细胞直接接触的情况下,也发生了向内皮细胞的传播,但感染性降低了90%。
在本研究中,我们证明LFA-1诱导不能用作区分弱毒疫苗和非弱毒wt菌株的标记。MOR和ZAG疫苗以及Ph26 wt的诱导水平非常温和,表达量增加不到两到三倍,但与之前发表的报道密切相关(1,26). FACS生成的诱导菌株直方图中的单峰位移表明,LFA-1在整个细胞群中的表达普遍上调,而不仅仅是在感染细胞中。在对ICAM-1表达的类似研究中,它在MV感染的内皮细胞和不表达病毒蛋白的细胞上都发生了诱导作用(11). 我们还表明,各种MV菌株以非常不同的方式与单核细胞系相互作用。最值得注意的是,基于表面MV H表达量低或下降以及产生的感染性病毒最少,这三种低通量wt菌株似乎没有有效感染U937细胞。
我们的数据并未证明MV H蛋白表达水平与LFA-1诱导之间存在直接关联。通过对一组有限的诱导株和非诱导株的核苷酸序列比较,先前的证据表明MV H蛋白和LFA-1调节之间存在关系(2). 此外,H蛋白117位存在苯丙氨酸(参考文献中错误地报告为116位2)假设与诱导LFA-1表达的能力相关(2). 然而,该氨基酸不能用作LFA-1调节的预测因子,因为在此位置含有亮氨酸的菌株MOR可以诱导LFA-1,而含有苯丙氨酸的CAM、jm77、Chi1和Pa2菌株则无效。此外,Chi1和Pa2菌株与之前显示诱导LFA-1的AC705 wt菌株的差异仅为1和2个残基(1,26). 显然,与H蛋白中的单个氨基酸取代相比,LFA-1诱导涉及的更多。
在我们的分析以及早期的研究中(1,2,22,26),MV株生长在Vero细胞中,Vero细胞是分离和传播麻疹的标准细胞。最近,人们注意到,在狨猴B淋巴细胞系(B95a)中,MV诱导的融合发生得更快(14). 因此,用于病毒繁殖的细胞类型可能导致不同的淋巴向性,并影响特定病毒的LFA-1表型。然而,当CAM和Chi1病毒在B95a细胞中繁殖时,它们在U937细胞感染时未能诱导LFA-1,正如在Vero细胞中传代后观察到的那样(数据未显示)。同样,病毒分离和在某些细胞类型中传代的程序并没有导致选择具有不同向淋巴性的MV株,也没有影响人膜辅因子蛋白(CD46)的调节能力(21),一种已鉴定的MV细胞表面受体(6,16). 因此,LFA-1诱导中的株特异性差异不太可能是由于病毒在Vero细胞繁殖期间的淋巴特性发生变化所致。
我们研究了MV株之间LFA-1诱导的可检测差异是否具有生物学意义,特别是在发病机制增强方面。这些研究表明,诱导LFA-1能力的菌株特异性差异与单核细胞粘附增强或病毒向内皮细胞的传播无关。事实上,许多白细胞整合素已被证明需要激活才能与适当的配体结合,表达增加并不一定与粘附活性增加有关(5). 此外,最近研究表明,在受感染的内皮细胞上合成MV H蛋白,而不是诱导ICAM-1,可以调节单核细胞结合的增加(22). 与MV感染的U937细胞直接接触,而非LFA-1诱导,可显著增强病毒向内皮细胞的传播。在体内,当病毒载量非常低时,通过细胞间传播的病毒传播比无细胞病毒传播更有效的观察结果可能特别重要。