U3和U5的特定和独立识别自动变速箱人体免疫缺陷病毒1型整合酶在体内的定位

摘要

逆转录病毒整合(22,30,55)由病毒酶整合酶（IN）催化，是建立前病毒和随后病毒基因表达的关键步骤(7,13,20,32,38,43,46,47). IN催化的反应可以在体外无细胞检测系统中建模，其中使用纯化的IN和模拟病毒U3或U5末端的合成寡核苷酸(三,8,10,18,26,35,49,54). 随后，顺式-和反式-人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）基因组的作用区域，包括附件(自动变速箱)场地(4,10,27,31,41——43,49,54)以及IN蛋白中的保守结构域(三,18,26,31,35)已确定对集成很重要。突变分析自动变速箱通过使用体外试验确定长末端重复序列（LTR）的区域自动变速箱与IN有效交互所需的序列(31,35,49,54). 在HIV-1中，与高度保守的CA二核苷酸相邻的至少7个和多达13个bp被证明是LTR与In体外有效和特异性相互作用所必需的(31,35,49). 重要的是，保守CA二核苷酸的改变显著损害了体外in活性，即3′加工、链转移和崩解反应(8,10,31,35,49,54). 除了CA二核苷酸外，还报道了亚末端LTR序列对特定相互作用的重要性(2,三,27,31,35,49,54,56). 然而，对这些体外试验的解释是有限的，因为它们只检测in对单个病毒DNA末端的作用。在逆转录病毒感染的自然过程中，U3和U5末端都被In（协同整合）协调识别。最近，一系列新的体外试验使用模拟整合中间体的修饰寡核苷酸底物，提供了更详细的in识别模型，其中in（i）识别自动变速箱和目标DNA不对称(9)和（ii）通过活性多聚体形成将两个病毒DNA末端并列(8,39). HIV-1 IN的突变分析和突变IN的互补研究也表明，HIV-1 IN作为多聚体具有活性(17,52). 这些体外研究大大提高了我们对逆转录病毒整合分子机制的理解。然而，最近的研究(14,19,34,38,45)表明体外和体内试验结果之间存在一些差异或差异。这些差异可能反映了体内外实验条件的差异。或者，细胞的参与(21)或者可能参与体内整合的病毒辅因子也可能是不同结果的一种解释。这些论点强调需要检查自动变速箱体内突变体，因为序列特征自动变速箱对逆转录病毒整合和复制的重要性还没有得到很好的定义。另一方面，末端U5区域对于病毒RNA的包装和逆转录的启动非常重要(11,23,24,41). 最近利用体外试验进行的研究证明，HIV-1 U5区引物结合位点上游13至15 bp的富A环，由四个腺苷区（核苷酸[nt]+169至+172）组成，与tRNA反密码子环中的四个尿苷残基结合_三^赖氨酸(23,24,36). 因此自动变速箱该序列与整合以外的病毒复制步骤重叠。

在本研究中，我们通过诱变U3或U5末端来研究病毒DNA末端序列在感染性HIV-1分子克隆中的作用自动变速箱区域或两者。此外，我们还解决了自动变速箱通过检测HIV-1 IN的位点特异性自动变速箱末端序列被鼠白血病病毒（MuLV）或猫免疫缺陷病毒（FIV）相应序列替换的位点嵌合病毒。最后，我们分析了自动变速箱交换突变体，其中U3自动变速箱区域（11bp）与U5交换自动变速箱区域（11 bp）和/或U5自动变速箱区域与U3交换自动变速箱检测末端11bp在体内整合HIV-1 IN的充分性和识别模式。

感染后用逆转录酶从头合成的病毒DNA的U5或U3区分别来自前病毒DNA的3′或5′LTR。因此，要生成U5或U3自动变速箱突变体，我们分别将突变引入HIV-1克隆的5′LTR的3′端区域或3′LTR中的5′端区域。一系列的缺失或点突变被引入每一个或两者中自动变速箱通过亚基因片段的定点突变获得的位点（图。​（图1），1)然后重建HIV的突变_{荷兰luc-env公司}向量(1,38,44)，其中环境价值基因有缺陷，导致HIV-1（两栖）假型的形成尼日利亚石油公司该基因被萤火虫萤光素酶（Luc）基因取代(12)以便有效监测HIV-1的表达。简言之，用于HIV-1 LTR末端突变的DNA片段来自HIV_{荷兰luc-env公司}矢量。对于U5末端区域的突变Nco公司我-Spe公司HIV I片段_{荷兰luc-env公司}将包含5′LTR整个U5区的（nt 10615至14267和nt 1至1508）亚克隆到pGEM5Zf（+）（Promega）中，形成pGEMU5NS。为了在U5末端区域引入突变，设计了两个诱变引物来跨越Hin公司dIII型-Bss公司HII（nt 531至712）U5自动变速箱区域。用HIV诱变引物进行PCR_{荷兰luc-env公司}作为模板DNA。扩增产物用Hin公司dIII和Bss公司HII并连接到Hin公司dIII型/Bss公司HII消化的pGEMU5NS。通过整个扩增区域的DNA序列确认设计突变后Hin公司dIII型-Bss公司将包含U5末端区域每个突变的HII片段插入HIV_{荷兰luc环境}向量，替换相应的Hin公司dIII型-Bss公司矢量的HII区域。对于U3末端区域的突变Xho公司我-Ssp公司HIV I片段_{荷兰luc-env公司}将包含整个3′LTR的（nt 8207至12677）亚克隆到Xho公司我和生态pBluescript II SK（+）的RV位点，形成pSKU3。为了在U3末端区域引入突变，设计了两个诱变引物来跨越Mlu公司我-Pma公司包含3′LTR中U3的5′半的CI（nt 9876至10240）区域。用U3进行PCR自动变速箱诱变引物如上所述。扩增产物用Pma公司CI和Mlu公司我和结扎Pma公司CI公司/Mlu公司I-消化载体pSKU3。通过对整个扩增区域的DNA测序确认设计突变后Xho公司我-Nco公司将包含U3末端区域每个突变的I片段插入HIV_{荷兰luc-env公司}向量，替换相应的Xho公司我-Nco公司向量的I区域。去除HIV病毒5′LTR中的U3末端区域_{荷兰luc-env公司}用酶消化载体pGEMU5NS生态RV（nt 112）和斯图I（位于5′侧翼区域）。通过琼脂糖凝胶电泳纯化大片段，然后将生态RV汽车/斯图I消化的pGEMU5NS载体（pGEMU5-NSdelS-RV）。这个Nco公司我-Spe公司pGEMU5NSdelS-RV的I片段被重新插入HIV_{荷兰luc-env公司}通过替换相应的Xho公司我-Spe公司向量的I区域（U3 CA>TGX）。毫无疑问自动变速箱突变，我们在U3和U5都引入了突变自动变速箱同时（U3&U5CA>TG、U3&U 5DEL8、U3和U5DEL10、U3与U5MuLV、U3&U5FIV和U3vsU5）。准备每个U3和U5自动变速箱突变体Xho公司-Nco公司HIV的I片段（nt 8207至10615）_{荷兰luc-env公司}携带每个U3的向量自动变速箱3′LTR中的突变被HIV的相应区域替换_{荷兰luc-env公司}携带每个U5的向量自动变速箱突变。

在单独的窗口中打开

图1

HIV-1 U3和U5的突变自动变速箱地点。U5（A）和U3（B）的边界和核苷酸序列自动变速箱显示了站点。WT DNA序列的两条链都显示在顶部。每个细胞中高度保守的CA和TG二核苷酸自动变速箱网站有下划线。对于自动变速箱位点突变体，仅显示阳性链DNA序列。删除或更改的核苷酸分别用破折号或粗体字母表示。在MuLV或FIV中自动变速箱嵌合突变体，每个HIV-1的末端13 bp自动变速箱序列替换为MuLV或FIV相应的13bp末端。tRNA引物结合位点（pbs）的边界_三^赖氨酸以虚线下划线（A）显示。

我们之前表明，通过监测合成的病毒DNA水平和感染细胞中表达的Luc活性，HIV-1（两性）假型单轮感染系统有助于评估体内整合效率(38). 我们分别制备了一种假型病毒自动变速箱COS细胞和HIV共转染的位点突变_{荷兰luc-env公司}矢量携带每个自动变速箱突变和两亲性MuLV包络表达载体（pJD-1）。我们还制备了HIV-1 IN突变体D116G，在IN的催化位点携带氨基酸取代(38)用作集成缺陷控制病毒。所有突变体在转染COS细胞的裂解液中具有可比的p24和Luc活性，在从转染细胞获得的培养上清中具有可比较的p24水平（数据未显示）。因此，这些突变对转染的前病毒基因表达没有任何影响。

我们评估了自动变速箱在易感RD细胞感染后，在U5或U3末端或两者都有缺失或点突变的突变体形成病毒DNA（图。​（图2A）。2A） ●●●●。为此，使用引物M667和M661，PCR监测完整或接近完整病毒DNA（R/gag）的形成(58). 对于每种病毒，RD细胞（10⁶)通过接种等分（1 ml）DNA酶处理的COS细胞病毒上清液感染。每1ml等分样品中p24的含量约为50 ng。在24小时或10天时，如图左侧所示。​图2，2，获取整个细胞培养物。如前所述，通过尿素分解法从感染的RD细胞中提取总DNA(38,58). 用HIV-1 R/gag区特异引物对每个DNA样本进行定量PCR分析(38,58)在含有20 mM Tris-HCl（pH 8.4）、50 mM KCl、0.2 mM脱氧核苷三磷酸盐、1 mM MgCl₂和2 U塔克DNA聚合酶（GIBCO BRL）。对于内部控制，总DNA为4×10²至5×10⁴RD细胞被平行扩增为人类β-珠蛋白基因特异的人类DNA标准引物对(33)（未显示数据）。除U5DEL GT和U3DEL 8&GT突变株外，所有突变株在感染后24小时产生了可比水平的完整或接近完整病毒DNA（图。​（图2A）。2A） ●●●●。值得注意的是，每个U5的扩增产物（R/gag）自动变速箱缺失突变体（图。​（图1A，1A、 U5DEL10、U5DEL 8、U5DELUA10或U5DEL19）显示了一个比野生型（WT）（200 bp）流动性慢的单条带，对应于其缺失的大小（图。​（图2A，2A、 泳道2、3、5和6），表明每个自动变速箱感染后，突变确实被引入到重新合成的病毒DNA中，并且在转染和感染过程中没有产生回复体。用TT替换U5中的终端GT自动变速箱区域（图。​（图1，1，U5GT>TT）不影响病毒DNA合成（图。​（图2A，2A、 车道8）。因此，U5DEL GT和U3DEL 8&GT产生的低水平病毒DNA表明，U5和U3中末端核苷酸（T/A）的缺失自动变速箱区域可能影响tRNA对逆转录的有效启动_三^赖氨酸或选择和处理多肽通道以启动正链DNA合成。在U5末端区域（nt+169至+172），由四个腺苷束组成的富含A的环被删除（图。​（图1A，1A、 U5DEL4A），之前曾报道它对与tRNA的相互作用很重要_三^赖氨酸引物和随后的负链DNA体外合成(23,24)，不会影响我们感染系统中的病毒DNA合成（图。​（图2A，2A、 车道4）。虽然我们不能排除突变的微小效应可能在病毒复制的重复周期中积累的可能性，但我们的观察与之前的体内实验一致，该实验显示富a环在病毒复制中没有明显的功能(53). 我们还通过监测感染细胞中病毒DNA随时间变化的水平来检测病毒DNA的稳定性。IN催化位点突变体D116G表现出低稳定性，低于WT水平的0.5%（图。​（图2A，2A、 比较车道1和18）。尽管除U5DEL GT和U3DEL 8&GT外，所有突变体在感染后24小时产生同等水平的病毒DNA，但10天的水平随整合效率的不同而不同。

在单独的窗口中打开

图2

分析自动变速箱突变体。（A） 对于每种病毒，10⁶通过接种1ml等分DNA酶处理的含病毒COS细胞上清液感染RD细胞。如左图所示，24小时或10天后，采集整个细胞培养物。从感染的RD细胞中提取总DNA，并使用HIV-1 R/gag区域特异性引物对进行定量PCR分析(38,58). 对于HIV-1 DNA标准，50至100000份线性化HIV_{荷兰luc-env公司}平行放大。扩增产物在2%琼脂凝胶上分解，并通过Sybr Green染色（缅因州罗克兰市FMC Bio Product）进行可视化。利用Epi-Light UV FA1100系统和发光成像仪（Aisin Cosmos研发公司）对扩增产物进行定量分析。每种病毒制剂的等分样品在65°C下培养30分钟，用作热灭活对照品（HI）。（B） 在感染后3天，收集整个培养物，并用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次。用200μl细胞裂解液缓冲液重新悬浮细胞颗粒（Promega公司）。对每种细胞裂解液进行10微升的Luc分析。减去背景水平并归一化为1μl裂解液后测定Luc活性，对应于约10^三细胞。对每种病毒接种的Luc活性进行了两次测量，并显示了平均值。每个重复的标准误差小于平均值的10%。该实验用独立制备的病毒进行了三次。给出了一个有代表性的实验结果。用亲本（WT）载体或IN催化突变（D116G）载体制备的病毒分别作为WT或整合缺陷对照并行感染。模拟转染COS细胞（无病毒）。

所有自动变速箱在COS细胞转染后，位点突变体显示出相似水平的Luc活性，并且在感染后产生相似水平的病毒DNA，但U5DEL GT和U3DEL 8&GT除外（图。​（图2）。2). 因此，我们可以通过测量感染后的Luc活性直接估计相对整合效率。WT构造产生1.1×10⁴每微升细胞裂解液中Luc活性的光单位（U）（相当于约10^三细胞）（图。​（图2B，2B、 重量）。另一方面，IN催化位点突变体D116G仅产生200 U/μl细胞裂解物（图。​（图2B，2B、 D116G），表明D116G相对于WT水平的相对集成效率估计低于0.2%。在自动变速箱位点突变体，通过在10 nt的每个末端缺失（图。​（图1A，1A、 跨越高度保守的CA二核苷酸及其5′内区的U5DEL10和B，U3DEL10），相对整合效率降低到WT水平的5%以下（图。​（图2B，2B、 U5DEL10和U3DEL10）。当我们保持保守末端4nt（CAGT）完整并删除保守CA内部的8nt5′时（图。​（图1A，1A、 U5DEL 8；图。​图1B，1B、 U3DEL 8），效率降低至WT水平的20至50%（图。​（图2B，2B、 U5DEL 8和U3DEL 8）。U5末端区域的四腺苷束缺失（图。​（图1A，1A、 U5DEL4A）或其上游区域的10 nt（图。​（图1A，1A、 U5DELUA10）对集成效率没有显著影响（图。​（图2B，2B、 U5DEL 4A和U5DEL UA10）。这些结果表明，与IN相互作用的边界位于每个病毒DNA末端的11至12 nt范围内。每个细胞中高度保守的CA二核苷酸的改变自动变速箱现场（图。​（图1A，1A、 U5CA>TG和B，U3CA>TG）将集成效率降低到WT水平的10到30%（图。​（图2B，2B、 U5 CA>TG和U3 CA>TG.）。保守CA二核苷酸的类似改变导致体外对in活性的影响恶化(9,10,31,35,49,54). 重要的是，当我们改变U3和U5的CA二核苷酸时自动变速箱区域（图。​（图1A1A和B，U3和U5CA>TG），集成效率协同降低至WT水平的1%。因此，与之前的体外in研究一致(8,10,31,35)，我们的体内实验结果也表明了CA二核苷酸对整合的重要性。然而，如果保守CA的核苷酸替换被引入U3或U5自动变速箱如上文和我们之前的报告所示，这种影响是可以容忍的(38). 为了排除突变片段与质粒DNA上另一个LTR处的WT序列的基因重排可能在转染过程中产生回复DNA的可能性，我们产生了一个U3 CA>TG突变质粒，其另一个U3末端区域缺失(斯图我-生态RV）（U3 CA>TGX）。U3 CA>TGX突变体显示出与U3 CA>TG突变体的表型没有区别（图。​（图2，2，U3 CA>TG和U3 CA>TGX）。虽然观察到的突变耐受性的确切机制是自动变速箱体内的位点尚不清楚，当10-bp缺失时也观察到类似的耐受性效应（图。​（图2，2、U3DEL10、U5DEL 10和U3&U5DEL10）和8-bp缺失（图。​（图2，2U3DEL 8、U5DEL 8和U3&U5 DEL 8）仅被引入其中一种自动变速箱地点。由于体外整合分析在一个自动变速箱位点的关键突变的补偿自动变速箱站点可能会在两者协同集成的过程中发生自动变速箱体内的位点。因此，我们假设IN或3′裂解产物在自动变速箱网站可能会帮助其他人自动变速箱处理步骤，可能是通过降低自动变速箱序列对IN的特异性。最近的体外研究表明，IN在催化过程中促进末端碱基的翻转(48). 终端GT改为TT（图。​（图1A，1A、 U5GT>TT）未能改变病毒DNA合成（图。​（图2A，2A、 U5GT>TT）或集成效率（图。​（图2B，2B、 U5 GT>TT），表明U5的3′端的G核苷酸序列自动变速箱该区域可能不是体内有效整合的严格要求。

分析自动变速箱位点嵌合病毒。

上述分析自动变速箱位点突变表明，与IN相互作用所需的边界位于病毒DNA每个末端的11或12 nt范围内。我们接下来检查了自动变速箱HIV-1 IN的特异性。为了解决这一点，我们生成了一个自动变速箱位点嵌合HIV-1突变体，其中U3和/或U5的每个末端序列的13 bp自动变速箱区域替换为MuLV的相应区域（图。​（图1，1、U5MuLV、U3MuLV和U3&U5MuLV）(35,46)或FIV（图。​（图1，1、U5FIV、U3FIV和U3&U5FIV）(50,51,53). 替换突变对COS细胞转染后前病毒DNA的基因表达和病毒释放均无任何影响（数据未显示）。RD细胞感染后，每个自动变速箱嵌合突变体产生的病毒DNA水平相当于WT（图。​（图3A），三A） 表明每个突变对感染后的逆转录没有影响。根据Luc活性估计，U5-MuLV、U3-MuLV，U5-FIV和U3-FIV突变体的相对整合效率分别为15.6%、28.3%、74.0和86.2%。MuLV公司自动变速箱嵌合突变体的整合效率与相应的8-bp缺失突变体（U3DEL8和U5DEL8）一样低，表明保守CA二核苷酸内部的8nt可能在确定自动变速箱HIV-1 IN的特异性。相反，HIV-1的交换自动变速箱带FIV自动变速箱对HIV-1 IN体内整合的影响较小。当自动变速箱与MuLV（U3&U5MuLV）或FIV（U3和U5FIV）同时被替换，U3&U5FIV保持了约70%的WT水平的高集成效率，而U3&W5MuLVs的集成效率明显低于WT水平0.5%（图。​（图3）。三). 在这里，我们再次观察到U3或U5的突变耐受性自动变速箱MuLV中的区域自动变速箱嵌合病毒。因此，我们的结果清楚地表明自动变速箱HIV-1 IN在体内的位点特异性，与先前的体外研究一致(27,28,35). 另一方面，替换自动变速箱FIV序列自动变速箱对体内整合的影响较小。FIV U5的类似兼容性自动变速箱体外报道了HIV-1 IN的位点使用情况(50). 总之，我们发现U5的末端11-bp序列自动变速箱区域和U3的末端12-bp序列自动变速箱区域是最小值顺式与HIV-1 IN特异性相互作用所需的元素。虽然我们没有讨论单个残基的重要性，但对自动变速箱序列显示，某些关键核苷酸位于自动变速箱在距离U3区域末端的位置5、9、10和12处自动变速箱（图。​（图5，5，用星号表示）。我们的结论至少部分与（i）Katzman和Sudol之前的体外研究一致(27)这表明了U3区末端第5和第6位核苷酸的重要性自动变速箱和（ii）Reicin等人(45)这表明了三个Gs在U3末尾6到8位置的重要性。值得注意的是自动变速箱HIV-1特异性结合的IN已通过不匹配的体外UV交联研究表明自动变速箱U5诱变寡核苷酸(57).

在单独的窗口中打开

图3

分析自动变速箱嵌合突变体。将含有约50 ng p24的每种病毒的1 ml等分样品接种到10⁶RD单元。（A） 如左图所示，在感染后24小时或10天，提取总DNA，并对从头合成的病毒DNA进行定量PCR分析，如图图例所示。​图2。2（B）对于每种病毒，在感染用于A组PCR实验的相同病毒制剂后3天，采集整个培养物。如图图例所示，对细胞颗粒部分进行Luc分析。​图2。2.对每种病毒接种的Luc活性进行了两次测量，并显示了平均值。每个重复的标准误差小于平均值的10%。用亲本（WT）或IN催化突变体（D116G）载体制备的病毒分别作为WT或整合缺陷对照并行感染。该实验用独立制备的病毒进行了三次。给出了一个典型实验的结果。

在单独的窗口中打开

图5

特定自动变速箱HIV-1 IN.U3和U5的站点识别自动变速箱病毒DNA两端的区域（如开盒所示）被识别并通过IN进行整合反应。通过IN去除末端GT二核苷酸（如箭头所示）导致在两条链的3′端暴露保守二核苷酸CA-OH（以粗体字母显示）。U3（12-bp）和U5（11-bp）自动变速箱方框中显示了与IN有效交互所需的HIV-1序列。星号表示核苷酸对与HIV-1 IN的特异性相互作用很重要。每个人的独立认可自动变速箱推测性地说明了每个IN启动子通过二聚体形成的位点。

HIV-1的U3和U5区域之间几乎没有明显的核苷酸序列同源性自动变速箱，除了端子4 bp（图。​（图1）。1). 重要的是自动变速箱嵌合物中显示的可能决定HIV-1 IN底物特异性的区域自动变速箱突变实验及前期体外研究(27,56)，在两者之间不保守自动变速箱区域。因此，建议IN可以识别自动变速箱独立地。或者，IN可以识别两者自动变速箱站点作为一个单元按顺序排列。为了区分这两种可能性，我们生成了自动变速箱位点交换突变体（图。​（图1，1、U5toU3、U3toU5和U3vsU5），并检查它们对体内整合效率的影响。在U5toU3突变体中自动变速箱被U3的11 bp末端序列取代自动变速箱在两个LTR末端产生具有11 bp U3末端序列的病毒DNA的位点。在第二个突变体U3toU5中，我们替换了自动变速箱带有相应的U5自动变速箱区域，导致病毒DNA具有11 bp U5自动变速箱两端的序列。在最后一个突变体U3vsU5中，我们交换了U3和U5的11 bp末端序列自动变速箱产生带有U5病毒DNA的区域自动变速箱U3末端区域和U3的序列自动变速箱U5末端区域的序列。通过分析U3vsU5突变体，我们还解决了末端11bp作为自动变速箱，因为在末端11bp之外的U3和U5末端之间没有同源性。所有三个自动变速箱交换突变体产生了相当水平的病毒DNA（图。​（图4A）4A） 集成效率约为WT级的70-90%（图。​（图4B）。4B） ●●●●。因此，我们的结果表明，末端11 bp几乎足以与HIV-1 IN相互作用，HIV-1 IN可能识别U3和U5自动变速箱序列不是作为一个单元，而是独立的。后一结论表明HIV-1 IN二聚或多聚对两者协同整合的重要性自动变速箱体内的位点。

在单独的窗口中打开

图4

分析自动变速箱交换突变体。将每种病毒接种到10个⁶图图例中所述的RD单元。​图2。2（A）如左图所示，在感染后24小时或10天，提取总DNA，并对从头合成的病毒DNA进行定量PCR分析，如图图例所示。​图2。2（B）对于每种病毒，在感染后3天，使用与A组PCR实验所用病毒制剂相同的病毒制剂，采集整个培养物并进行Luc分析，如图图例所示。​图2。2.对每种病毒接种的Luc活性进行了两次测量，并显示了平均值。每个重复的标准误差小于平均值的10%。用亲本（WT）载体或IN催化突变（D116G）载体制备的病毒分别作为WT或整合缺陷对照并行感染。该实验用独立制备的病毒进行了三次。给出了一个典型实验的结果。

如图所示。​图5，5，本研究的主要发现如下。（i） U5和U3的末端11或12 bp自动变速箱站点是最小值顺式该元素是必需的，并且几乎足以在体内与HIV-1 IN整合或有效相互作用。（ii）高度保守的二核苷酸CA和TG可能作为自动变速箱如先前体外研究所示，所有逆转录病毒在IN-介导作用或3′加工方面的底物特征相同(10). （iii）高度保守CA内部的亚末端区域7至8 bp 3′可能决定自动变速箱HIV-1 IN的特异性。（iv）分析自动变速箱交换突变体表明HIV-1 IN可能识别每一种自动变速箱位点独立但协同作用，可能通过形成二聚体或多聚体。

HIV-1 IN体外研究表明，IN可分为三个不同的功能域，即N端、中心和C端域，这些功能域相互补充，以获得完整的酶活性(17,52). 中心核心结构域包含保守的D，D 35E基序，对IN的催化活性至关重要(5,18,29,32). 此外，体外完整的In活性需要N端和C端区域(17,52,59). 这些体外研究表明，in可能作为二聚体或多聚体形式发挥作用(17,52). 用X射线晶体学解决了HIV-1中心区域的三维结构(15). 最近，N端的结构(6)和C端子(16,37)用核磁共振波谱分析了HIV-1IN的结构域，发现每个结构域都形成一个同二聚体或四聚体。结合这些体外研究的结果，我们的结果与自动变速箱交换突变体表明在识别U3或U5的每个in启动子的二聚体或多聚体形成中起重要作用自动变速箱独立站点，实现两者的协同集成自动变速箱体内的位点。

逆转录病毒整合的一些重要方面尚待确定。例如，这些包括IN的确切特征，它决定自动变速箱特异性。IN的非特异性DNA结合能力及其特异性结合能力阻碍了对这一点的检查。最近使用HIV-1嵌合in和FIV-in的体外研究结果(50)表示IN的行列式自动变速箱特异性可能位于核心中心结构域。此外，HIV-1 in中心结构域中的赖氨酸残基位于位置136(40)或位置156和159(25)已被建议作为特定自动变速箱结合。结合这些体外研究，有必要使用体内系统进行进一步的实验，以对逆转录病毒整合进行新的了解。有趣的是，Du等人最近的研究(14)表明in的突变可以补偿猿猴免疫缺陷病毒的突变自动变速箱.

致谢

参考文献