趋化因子受体最近被证明与CD4一起作为人类免疫缺陷(HIV)的协同受体,参与病毒进入(10,26). 了解哪些生理因素调节CD4中HIV辅受体的表达+细胞对于开发旨在减少或防止病毒在体内传播的策略具有重要意义。
人早幼粒细胞白血病细胞系U937(34)它同时表达CD4和CXCR4,是CXCR4的一个众所周知的靶点,该靶点使用1型艾滋病毒(HIV-1)的(X4)T细胞系适应株(TCLA)(1,6,12,19,23,31). 我们在U937细胞克隆中描述了X4病毒复制的高效模式和低效模式(在本文中分别称为正模式和负模式)(2,13)和其他(4,18). 最近,尽管CXCR4的表达水平很高,但缺乏TCLA病毒的融合能力,这解释了U937阴性克隆(即那些显示阴性模式的克隆)的能力不足(23).
1,25-二羟基维生素D3(维生素D3),一种特性良好的骨髓单核细胞分化剂(28)之前有报道称,在慢性感染的U937细胞中增加HIV表达(21)包括受刺激的U1细胞(14). 正负U937电池(2×105/ml)被粒化HIV-1吸附拉丁美洲/印度在H9 T细胞系(Advanced Biotechnology,Inc.,Columbia,Md.)上在37°C下繁殖1小时,清洗,并在有或无维生素D3的重复培养物中接种在48周的塑料板中。对培养上清液进行镁测试2+-依赖性逆转录酶(RT)活性(13). 令人惊讶的是,维生素D3的刺激使负克隆中的HIV复制上调至与感染阳性细胞平行培养中观察到的水平相当。相反,维生素D3在U937阳性克隆中不调节病毒复制(图。).
维生素D3选择性上调U937阴性克隆的病毒复制。一个负克隆和一个正克隆感染了H9-衍生HIV-1拉丁美洲/印度在缺乏维生素D3(未刺激)[未刺激]或存在10 nM维生素D3的情况下(维生素D3)。显示了重复培养物的平均值。这些数据代表了四个独立执行的实验,包括两个额外的减克隆和一个加克隆。在阴性克隆中观察到低但可检测的病毒复制水平(RT活性峰值,感染后第17天为930 cpm/μl)。
维生素D3对不同类型细胞NF-κB活化的调节已被证实(9,37). 因此,进行了时间进程实验(5,13)用肿瘤坏死因子α(TNF-α)、佛波醇12、肉豆蔻酸-13、醋酸盐(PMA)或维生素D3刺激正负克隆。然而,与TNF-α或PMA不同,无论U937克隆是否未感染,维生素D3刺激都不会诱导NF-κB的激活(图。)或感染HIV-1(数据未显示)。
维生素D3在U937阳性和阴性细胞中不诱导NF-κB结合。用未刺激(Unst.)和刺激(TNF-α,2 ng/ml;维生素D3,10 nM(Vit.D3);PMA,10 nM)指定时间点的正负电池。在稍后的时间点(20小时)检查细胞时,维生素D3也未能诱导NF-κB活化。先前已经描述了使用的NF-κB探针以及从正负克隆中分离NF-κ)B复合物的分子(5,13). 星号表示p65的截断形式。
尽管有功能性CXCR4受体,但X4 HIV-1缺乏融合能力,这与U937阴性克隆对支持病毒复制的所谓耐药性有关(23). U937-负细胞显示CXCR4的平均荧光强度比正克隆的平均荧光强度低,尽管更稳定,而在培养4至5天后,正细胞中出现了趋化因子受体的相对下调(图。A) ●●●●。与之前的研究一致(23),CXCR4是U937中的一个功能性趋化因子受体,在Ca2+在其配体基质细胞衍生因子-1(SDF-1)刺激后,立即显示通量(图。B) ●●●●。
功能性CXCR4在U937阴性细胞上的表达。(A) 用12G5 MAb染色后不同时间点测试的U937正负克隆中组成性CXCR4表达的比较分析(明尼阿波利斯研发系统公司)。使用FACScan仪器(加州圣何塞Becton&Dickinson)进行荧光激活细胞分选仪分析。两种克隆的阳性细胞百分比均≥95%。结果(平均荧光强度[MFI])是独立测定的平均值(n个). 阳性细胞克隆显示CXCR4的组成性表达高于阴性细胞克隆(**,P(P)= 0.003; ∗,P(P)= 0.055; n.s.,不重要[学生的吨测试])。误差条显示平均值的标准误差。(B) SDF-1(1和10μg/ml)诱导Ca2+U937减去无性系的通量与浓度相关。对装有fura-2的细胞进行分析(加州圣地亚哥Calbiochem)(15)使用Perkin-Elmer(康涅狄格州诺沃克)LS-5B荧光计。
维生素D3已被证明可上调早幼粒细胞系HL-60中的CXCR4 mRNA(22). 与它对HIV复制的影响一致,在维生素D3处理的阴性克隆中观察到CXCR4 mRNA表达(未显示)和细胞表面密度的选择性上调(图。A) 但在U937+单元中没有(数据未显示)。相反,维生素D3对阴性克隆的CD4表面表达没有影响(数据未显示)。
维生素D3增强U937阴性细胞中CXCR4的表达和HIV感染。(A) 通过用抗CXCR4单克隆抗体12G5或同种匹配的对照抗体(小鼠免疫球蛋白G2a)染色,分析未经刺激(Unst)或用10 nM维生素D3(Vit.D3)刺激96 h的U937阴性克隆CXCR4的表面表达(同型续)。(B) 感染HIV-1之前,用10nM维生素D3(Vit.D3)或单独培养基(未刺激[Unst.])预刺激U937阴性细胞72小时拉丁美洲/印度在植物血凝素b细胞上生长和滴度。热循环条件为50°C 2 min,95°C 12 min,40个95°C循环15 s,65°C 1 min(27),分布在具有线性回归的曲线上(第页≥0.98)。第二波前病毒DNA积累在维生素D3刺激的细胞中明显,但在非刺激细胞中不明显,这可能是感染加速传播的结果。(C) SDF-1抑制U937阴性克隆中组成型和维生素D3增强型病毒复制。感染HIV-1的U937阴性克隆拉丁美洲/印度(在H9细胞上繁殖)用单独培养基(未刺激[unt.])、10 nM维生素D3(维生素D3)、SDF-1(1μg/ml)和维生素D3加SDF-1培养基(分别为10 nM和1μg/ml)培养。显示了三个独立实验之一的重复培养物的平均RT活性(样本间变异性<15%)。
用维生素D3分化负U937细胞72小时,然后感染DNA处理的HIV-1拉丁美洲/印度以前在植物血凝素b细胞上繁殖和滴度(感染多重性=1)。在37°C下吸附病毒1小时后,通过大量清洗去除多余的病毒。通过实时PCR定量HIV-1前病毒DNA的积累(16)使用ABI Prism 7700序列检测器(加州福斯特城Perkin-Elmer Applied Biosystems)。设置并探测以下底漆对堵住使用了:正向底漆,对于(5′-ACA TCA AGC CAT GCA AAT-3′);反向底漆,转速(5′-ATC TGG CCT GGT GCA ATA GG-3′);和探针,探针[5′(FAM)CAT CAA TGA GGA AGC TGC AGA ATG GGA标签A(TAMRA)-3′]。与未刺激细胞相比,在与维生素D3刺激细胞中的单轮HIV复制(12至24小时)相适应的时间范围内,观察到加速的动力学和更高水平的HIV前病毒DNA积累(图。B) ●●●●。
为了证明HIV-1在U937阴性克隆中的感染和传播是以CXCR4依赖的方式发生的(三,24),U937阴性克隆被HIV-1吸附拉丁美洲/印度(在H9细胞上繁殖),然后单独培养或在维生素D3、SDF-1或两者的存在下培养。与之前的融合性分析不同(23),SDF-1强烈抑制组成型和维生素D3增强的HIV在U937缺失克隆中的复制(图。C) ●●●●。
维生素D3先前已被证明对初级单核细胞或细胞系(包括U937细胞)具有正负效应(7,14,21,25,30,32). 然而,至少在U937缺失克隆中,维生素D3在不诱导TNF-α分泌(未显示)或NF-κB活化的情况下恢复了低效HIV复制。
迄今为止,CXCR4是已知的唯一一个作为TCLA HIV-1辅受体的趋化因子受体(11). 然而,尽管最近发现白细胞介素-4能增加CXCR4的表达,但对其生理调节知之甚少(17). 在我们的研究中,维生素D3选择性地提高了负克隆细胞表面CXCR4受体的密度,而不是正克隆细胞表面的密度。与阴性克隆与阳性克隆表达的CXCR4组成水平较低一致,这种效应至少在一定程度上是维生素D3刺激U937阴性克隆诱导HIV复制增强的原因。前病毒DNA合成的动力学定量分析支持了这些结论。Moriuchi等人对此感兴趣(23)研究表明,SDF-1和抗CXCR4 12G5单克隆抗体(MAb)在一个U937+克隆中对HIV-1环境介导的融合抑制作用很弱,这表明存在额外的、但尚未确定的进入辅因子(23). 我们已经证实SDF-1对钙的诱导作用最小2+plus克隆中的通量和对HIV复制的抑制作用较差(2a个). 然而,我们在这里证明SDF-1能迅速触发Ca2+在U937阴性细胞克隆中释放并强烈抑制构成性和维生素D3诱导的病毒复制,强调能够作为HIV辅受体的功能性辅受体分子在其细胞表面表达。最后,我们不能排除维生素D3能够在病毒整合和/或在细胞培养中传播方面将细胞内环境改变为更宽松状态的可能性,尽管这些影响不太可能包括U937阴性细胞中NF-κB依赖性病毒转录。然而,在这方面,病毒启动子外增强子的转录控制(35)或通过U937细胞分化后触发的Tat相关激酶活性(36)可能会起作用。
总之,我们的发现为研究CXCR4-HIV辅助受体在分化单核细胞中的使用和调节提供了一个模型。在这方面,骨髓源性CD34的感染+细胞已经在一些晚期艾滋病患者中得到证实,但在感染早期的个人中没有得到证实(33). 因为获得CXCR4共受体的使用,导致从嗜巨噬细胞株到嗜T细胞株的表型转换,发生在疾病晚期(8,20,29)可以想象,影响CXCR4在HIV靶细胞上表达水平的因素(如此处所示的维生素D3)在决定HIV扩展其细胞向性的能力方面发挥了作用,可能涉及骨髓源性祖细胞。