病毒进入是一个复杂的过程，通常涉及多种病毒和细胞因子的多个阶段(23,40). 特别是对于包膜病毒，人们普遍认为病毒首先与细胞表面受体结合，触发病毒受体复合物的构象变化(4). 随后，第二组细胞分子，称为共受体或融合因子，与病毒接触，启动病毒包膜和质膜之间的膜融合(28). 这些细胞表面分子的鉴定既费时又费力；然而，分离编码这些分子的基因对于揭示病毒进入过程的机械复杂性至关重要。对于人类免疫缺陷病毒的进入，最近的数据表明，细胞CD4不仅需要与病毒包膜蛋白相互作用，而且第二个辅助分子，如趋化因子受体-5（CCR5）在病毒诱导的融合中发挥重要作用。gp120与CD4和CCR5的相互作用对于诱导构象变化以暴露位于gp41 N末端的融合肽进行膜融合是必要的(1–三,6,7,15).
以往关于单纯疱疹病毒（HSV）的研究也表明了复杂的进入机制(4). HSV体积大得多，在病毒粒子上含有许多膜蛋白。多种病毒蛋白如gB、-C、-D、-H和-L被证明参与病毒进入(10,18–20,29). 其中一些蛋白质，如gB和gC，现在已知能与细胞上的糖胺聚糖（GAG）结合，而gD的存在允许结合病毒的进一步相互作用，结合到辅受体HVEM进行融合(8,25,38,39). 尽管融合是如何触发的尚不清楚，但这些细胞分子的鉴定为未来研究HSV融合机制提供了关键基础。
由于痘苗病毒的宿主范围很广，可以想象，细胞上普遍表达的某些细胞成分会介导病毒进入。我们之前的数据表明，重组A27L蛋白与BSC40细胞上的硫酸乙酰肝素结合。此外，用氯酸钠处理以阻断GAG侧链硫酸化的BSC40细胞对痘苗病毒感染的抵抗力更强(12). 我们将这些结果解释为A27L蛋白与GAG上硫酸盐负电荷的相互作用。因此，我们寻找A27L蛋白上的氨基酸序列，这些氨基酸带有碱性或正电荷，适合与硫酸盐相互作用(31). 原则上，富含赖氨酸和精氨酸的12个氨基酸（aa）从aa 21延伸至32（STKAAKKPEAKR）是电荷相互作用的理想选择。该区域也存在于可溶性A27L蛋白中，该蛋白含有aa 21至84，并与细胞结合（图。A）(12). 从开放阅读框翻译的A27L亲水性图预测膜蛋白为110 aa，信号肽为aa 1至20。此前，病毒上的A27L蛋白被纯化，测序数据表明成熟形式始于aa 21的丝氨酸，这表明信号肽的加工(37). 这使得上述富含精氨酸和赖氨酸的区域位于N末端的最外部区域，便于接近。此外，一些识别该区域重叠表位的单克隆抗体（MAb）能够中和痘苗病毒感染(27). 很可能这个N末端区域在病毒进入中调节A27L蛋白的功能。
（A） 从开放阅读框翻译的含有110 aa的A27L蛋白的水病图。A27L和D-A27L蛋白中表达的外域显示为方框区域，赖氨酸和精氨酸富集区域（aa 21至32）绘制为条纹方框。条纹区顶部显示了从位置21到32的单个氨基酸序列。A27L和D-A27L蛋白质显示的氨基酸数量与水疗图中氨基酸序列的编号相同。方框区域与亲水性图对齐，以证明A27L蛋白包含一个亲水性外结构域，紧邻aa 1至20的信号肽。（B） D-A27L蛋白的纯化。如前所述，D-A27L蛋白的结构类似于A27L蛋白质的结构(13). 总之，使用对应于不同A27L DNA序列的PCR引物扩增含有D-A27L蛋白外结构域的DNA片段。DNA被克隆到pET21a（+）并转化为BL21（DE3），得到的重组D-A27L蛋白在N端含有T7标签，在C端含有六组氨酸标签，以便使用镍柱进行纯化。如上所述纯化可溶性A27L蛋白（泳道1）和D-A27L蛋白（泳道2），通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（12%）凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并用考马斯亮蓝染色。（C） D-A27L蛋白在体外不与肝素柱结合。将纯化的A27L（1至5道）和D-A27L蛋白（6至10道）与肝素-脑葡萄糖珠（4、5、9和10道）或对照Sepharose珠（2、3、7和8道）在4°C下培养60分钟，并在短暂离心后收集上清液。将珠子清洗三次，并调整结合样品（第2、4、7和9道）或上清液（第3、5、8和10道）的体积，以便在12%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上加载相同比例的每个样品。纯化的A27L和D-A27L蛋白分别显示为通道1和通道6中的对照。将凝胶转移到针对A27L蛋白（1:500）的MAb上进行Western blot分析。每条通道中的两条带代表蛋白质的二聚体（顶部）和单体（底部）形式。千道尔顿。
产生了一个突变结构D-A27L，用于在细菌中表达可溶性蛋白。D-A27L编码aa 33到84的开放阅读框序列。与我们最初的A27L外结构域构建相比，D-A27L蛋白从N末端缺少aa 21至32（图。A） ●●●●。A27L和D-A27L蛋白都含有六组氨酸标签，并用镍柱纯化（图。B） ●●●●。为了测试这种缺失是否消除了A27L蛋白与GAG结合的能力，A27L和D-A27L蛋白质分别在体外用肝素CL6B珠培养，洗涤后，收集结合部分和流通部分，并用A27L特异性血清进行Western blotting分析（图。C） ●●●●。在对照组中，可溶性A27L蛋白与肝素微球结合（通道4），而在流动（通道5）中检测到的蛋白质很少。这种结合对肝素具有特异性，因为A27L蛋白并不是单独与珠结合的（通道2）。相反，D-A27L蛋白不与对照珠（泳道7）或肝素珠（泳道9）结合。所有D-A27L蛋白均在两个流通部分（通道8和10）中检测到。因此，结果表明，aa 21至32区域是A27L蛋白与肝素微球体外结合所必需的。
我们扩展了上述体外分析，以确定细胞上与硫酸乙酰肝素结合的可溶性A27L蛋白是否也由相同的N-末端结构域介导。我们通过荧光激活细胞分选分析监测D-A27L蛋白与可溶性A27L蛋白质竞争细胞结合的能力。生物素化A27L蛋白与HeLa细胞特异结合，显示细胞表面荧光染色发生显著变化（图。A） ●●●●。当添加可溶性肝素作为竞争物时，与细胞结合的A27L蛋白的量显著减少，但与硫酸软骨素或硫酸皮聚糖无明显差异（数据未显示）。当细胞与10倍过量的未标记A27L蛋白孵育以与生物素化A27L蛋白质竞争细胞结合时，检测到的荧光染色显著降低（图。B） ●●●●。当D-A27L蛋白用作冷竞争物时，未观察到荧光降低，这表明D-A27L蛋白没有与A27L蛋白质竞争细胞结合（图。C） ●●●●。D-A27L蛋白未能与肝素珠结合与该蛋白无法与细胞结合相关，这证实了A27L与细胞上硫酸乙酰肝素相互作用需要N末端结构域。这不仅限于HeLa细胞，因为其他细胞系，如BSC40和小鼠L细胞，也进行了测试，获得了类似的结果（数据未显示）。
D-A27L蛋白没有与生物素化A27L蛋白质竞争细胞结合。（A） HeLa细胞在4°C下与磷酸盐缓冲盐水单独培养30分钟（图A中的灰色线）、生物素化A27L蛋白单独培养（图A、B和C中的阴影区域）或生物素化的A27L蛋白质共同培养，其中存在10倍过量的冷A27L蛋白（图B中的灰线）或D-A27L蛋白酶（图C中的灰线上）。将细胞清洗三次，然后添加藻红蛋白结合的链霉亲和素（1:100）进行另一个30分钟的培养。清洗后，用荧光激活细胞分选仪对细胞进行分析（激发，488 nm；发射，578 nm）。
A27L蛋白是细胞内成熟病毒表面的一种包膜蛋白，其抗体可中和痘苗病毒感染(30–32,35). 如果A27L蛋白确实在细胞上介导痘苗病毒与硫酸乙酰肝素结合，则可溶性A27L蛋白质可能会干扰痘苗病毒感染。利用纯化的D-A27L蛋白，可以评估GAG结合域在病毒感染中的作用。在可溶性A27L或D-A27L蛋白存在的情况下，用痘苗病毒感染BSC40细胞，3天后测定斑块数。如图所示。A、 可溶性A27L蛋白以剂量依赖性方式阻止斑块形成，在1μg蛋白水平上抑制率为23%。10μg和100μg的抑制率分别达到61%和66%。D-A27L蛋白对病毒感染没有任何显著影响，表明GAG结合结构域对这种抑制作用至关重要。
可溶性A27L蛋白而非D-A27L蛋白质阻止了痘苗病毒在后结合步骤的进入。（A） 通过可溶性A27L蛋白减少牙菌斑。首先将BSC40细胞与不同量的可溶性A27L或D-A27L蛋白（200μl中的1、10或100μg）在4°C下孵育30分钟，然后再感染痘苗病毒（600 PFU）4°C培养30分钟。用柠檬酸缓冲液（40 mM柠檬酸、10 mM KCl、135 mM NaCl[pH3.0]）冲洗细胞1分钟，用磷酸盐缓冲盐水清洗，并用琼脂覆盖。3天后测定菌斑数。（B） A27L蛋白降低了病毒早期基因的表达。将细胞与可溶性A27L或D-A27L蛋白（100μl中0.1、1或10μg）在4℃孵育30分钟，然后以每细胞5个PFU的多重感染率感染vMJ360，再在4℃培养30分钟。细胞用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，并在感染后2小时收获。如前所述，制备裂解液用于β-半乳糖苷酶（β-gal）检测(三). 外径、光密度。（C） 与细胞结合的痘苗病毒不受A27L蛋白的影响。将BSC40细胞与可溶性蛋白（1、10或100μg）在4℃下预孵育30分钟，然后在4℃以每细胞10 PFU的多重感染率感染痘苗病毒30分钟。将细胞清洗，在含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中溶解，并加载到10%聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上，用痘苗病毒（V）抗血清进行Western blot分析。M、 来自模拟感染细胞的裂解物。
然后我们检查可溶性A27L蛋白是否在早期阻断了病毒感染。在可溶性A27L或D-A27L蛋白存在的情况下，用重组痘苗病毒vMJ360感染细胞(14). 在感染后2小时制备细胞裂解物，并测定拉奇早期病毒启动子的表达（图。B） ●●●●。用1μg可溶性A27L蛋白孵育细胞可阻断约51%的病毒感染。使用10μg A27L蛋白，病毒感染的阻断率增加到60%。结果与图中的观察结果一致。A.D-A27L蛋白在0.1-10μg范围内未抑制病毒基因表达。据推测，D-A27L蛋白不与细胞结合，在阻止病毒感染方面无效。A27L蛋白需要N末端序列才能抑制病毒感染，这表明A27L蛋白质干扰了病毒进入过程。
A27L蛋白阻断痘苗病毒感染的能力提示了两种可能的机制：它可以阻止痘苗病毒的吸附，或者它可以阻止病毒的融合或渗透。对于包膜病毒，结合和融合是两个不同的步骤，之前已经描述过干扰这两个过程的可溶性病毒蛋白(17,26,38,39). 我们进行了病毒结合分析，以量化在存在可溶性A27L蛋白的情况下与细胞结合的痘苗病毒数量。用可溶性蛋白孵育BSC40细胞并感染痘苗病毒。然后立即收集细胞，并制备裂解物，用抗痘苗病毒的抗血清进行Western blot分析（图。C） ●●●●。无论所用可溶性A27L蛋白的浓度如何，与细胞结合的病毒数量似乎没有变化。这表明，添加可溶性A27L蛋白并没有减少痘苗病毒与细胞的结合，而是阻止了病毒在融合或渗透阶段的感染。这个结果可能并不太令人惊讶，因为A27L蛋白被证明通过酸处理可以诱导痘苗病毒感染细胞的细胞融合(31,32). 此外，抗A27L蛋白的单克隆抗体C3在不影响病毒结合的情况下阻断了细胞融合(32,35). 然而，尚不清楚A27L蛋白是如何触发融合的，也没有发现参与融合的细胞表面成分。
由于A27L蛋白的N末端区域作为GAG结合域，它为理解A27L依赖性细胞融合的机制提供了线索。我们获得了重组病毒WR32-7/Ind14K，其中A27L蛋白的表达通过添加异丙基-β来调节-d日-培养基中的硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）(33,34). 细胞融合严格依赖于A27L蛋白的表达，并且在感染后18小时左右在IPTG的存在下很容易观察到细胞融合(34). 这种病毒使我们能够在不经酸处理的情况下确定融合形成，并提供了一种更方便的检测方法。将IPTG添加到培养基中时，受WR32-7/Ind14K感染的BSC40细胞在中性pH下发生细胞融合（图。C） ，而省略IPTG时未观察到融合（图。B） ●●●●。当这些感染细胞与可溶性A27L蛋白孵育时，细胞融合被显著阻断（图。D） ●●●●。D-A27L蛋白与感染细胞孵育无抑制作用，细胞融合发展到与对照感染细胞相似的程度（图。E） ●●●●。总之，去除D-A27L蛋白的GAG-binding结构域消除了其在细胞结合和细胞融合中的生物活性。这表明通过GAG相互作用的细胞结合对A27L蛋白介导细胞融合至关重要。
可溶性A27L蛋白阻断了WR32-7/Ind14K感染细胞的融合。BSC40细胞要么被模拟感染（A），要么在IPTG存在（C至E）或不存在（B）的情况下，以每细胞5 PFU的感染倍数感染重组病毒WR32-7/Ind14K。感染后，将细胞与单独培养基（A至C）或含有A27L蛋白（D）或D-A27L蛋白质（E）的培养基孵育24小时并拍照。
这一发现可能为之前的几次观察提供了解释。例如，几个识别该区域内表位的单克隆抗体可能会由于中断病毒和GAG的相互作用而中和病毒感染(13,27). 已知可使A27L功能失活的N末端序列中的突变或缺失也可能是由于无法与GAG相互作用(21,22).
A27L蛋白在痘苗病毒结合和融合中的作用是什么？很明显，A27L蛋白和GAG的相互作用可以作为病毒感染的初始阶段，因为通过GAG的电荷相互作用通常被描述为非特异性和低亲和力(4). 似乎需要细胞和结合病毒之间的其他高亲和力相互作用来提供特异性。用可溶性肝素孵育细胞可阻断病毒与细胞的结合，而可溶性A27L蛋白则没有（图。C）(12). 这表明可能有多种病毒蛋白介导病毒与GAG结合。只有当肝素同时阻断所有这些相互作用时，才能阻断病毒吸附。这可以解释可溶性A27L蛋白无法抑制病毒结合。这也可以解释A27L蛋白对病毒感染不是必需的，因为与GAG的结合可能与其他病毒膜蛋白共享，类似于HSV-1中的gB和gC(10,24,25).
有报道表明A27L蛋白在病毒和细胞融合中是必需的。据报道，抗A27L、C3的单克隆抗体可阻止痘苗病毒感染，而不影响病毒结合(32). 脱淬分析表明，细胞内成熟病毒通过膜融合进入细胞，表明MAb C3阻断了病毒和细胞膜的融合(16). 由于我们不知道单克隆抗体C3识别的表位，因此尚不清楚单克隆抗体C4如何阻止病毒融合。可溶性A27L蛋白在不影响病毒附着的情况下抑制病毒感染也与融合作用一致。我们推测，可溶性A27L蛋白与细胞上的GAG结合，产生空间位阻，并干扰病毒-GAG复合物的构象变化，否则这些复合物可能会转化为融合子中间体。在这个模型中，我们不认为A27L蛋白本身是一种融合蛋白。病毒融合蛋白如血凝素（HA2）和gp41在N端含有疏水性氨基酸，通常被称为融合肽(9,11). A27L蛋白没有类似的结构，可以作为融合肽。此外，痘苗病毒细胞融合可以由多种病毒蛋白介导。其他蛋白质，如F13L、B5R和A34R，也被证明是病毒感染细胞融合所必需的(5,41,42). 由于这些病毒蛋白中几乎没有保守的结构，它们似乎不太可能都含有参与融合过程的融合肽。相反，它可能表明这些病毒蛋白，包括A27L蛋白，以某种方式调节融合机制的活性。此外，有几种已知的病毒蛋白与A27L蛋白相互作用，如A13L、A14L和A17L蛋白，它们在融合中的作用需要在未来确定(30,36).
总之，我们的研究揭示了A27L蛋白N末端结构域在痘苗病毒对细胞GAG吸附中的重要性。这种相互作用还控制A27L蛋白触发细胞融合的能力。我们对GAG结合域的映射使我们能够开始剖析病毒进入所涉及的机械复杂性。对单个膜蛋白的研究应该使我们能够识别参与痘苗病毒进入过程的其他病毒和细胞蛋白。
