腺相关病毒（AAV）作为基因转移载体的发展受到了阻碍，因为缺乏简便有效的方法来产生重组AAV（rAAV）的纯库存(9,12). 这方面的一个重大困难是需要提供助手功能(1,2,5,6,18,19). 尽管这是通过腺病毒共同感染产生细胞而有效实现的，但这会导致伴随产生腺病毒子代，而这些子代很难被完全清除或灭活。复制型腺病毒的污染不仅不可用于基因治疗应用，而且会显著影响rAAV载体的转导效率，从而使其效用评估复杂化(三,4). 由于腺病毒的早期功能足以支持AAV复制(19)，我们研究了在后期功能中被阻断的突变体作为rAAV生产辅助物的使用。腺病毒5型（Ad5）末端前蛋白（pTP）基因中的一个缺失突变，称为Ad5数字图书馆308ΔpTP，之前描述过(16)与互补的pTP-表达细胞系一起支持这种突变体的生产性感染(10,15). 在未完成细胞中，Ad5数字图书馆308ΔpTP被证明在DNA合成和晚期功能表达方面完全有缺陷(16). 相比之下，用于为rAAV提供辅助功能的其他腺病毒突变体在复制方面表现出明显的泄漏(18). 这里，我们报告Ad5数字图书馆308ΔpTP可以有效地帮助产生rAAV库存，而不受具有复制能力的腺病毒的影响。
腺病毒助手的数量，Ad5数字图书馆309和Ad5数字图书馆308ΔpTP，在293细胞和293-pTP细胞中产生(10,15)分别是。广告5数字图书馆309在E3区域有缺失和插入，但在细胞培养中表现出与野生型Ad5相当的复制(8). 相比之下，Ad5数字图书馆308ΔpTP在缺乏互补的情况下，不能复制或指导后期区域产品的合成。即使使用敏感的核糖核酸酶保护试验，在感染该病毒的293个细胞中也无法检测到晚期转录物(16). 两种辅助物在CsCl中通过等密度离心纯化。Ad5的感染滴度数字图书馆309和Ad5数字图书馆308ΔpTP分别通过293细胞和293-pTP细胞的斑块试验进行测定。由于293-pTP细胞的斑块检测在技术上更为困难，因此Ad5的滴度数字图书馆308ΔpTP通过吸光度测量进行验证，以确定颗粒浓度。我们一直观察到两种Ad5的PFU-颗粒比率相似（≈1:100）数字图书馆309和Ad5数字图书馆308ΔpTP.
rAAV由pAAV瞬时共转染产生。CMV公司。勒克(11)和pAAV/Ad(13,14)通过电穿孔将人猿病毒40转化细胞系324K；我们之前报道了标准转染方法的这些改进的优点(11). pAAV病毒。CMV公司。LUC包含rAAV基因组，其荧光素酶报告子由巨细胞病毒即时早期启动子驱动(11). 电穿孔后立即用表型野生型Ad5感染细胞数字图书馆309或带有Ad5数字图书馆308ΔpTP2至6小时后更换培养基，并更换含有AAV的培养基和细胞提取物。CMV公司。LUC在指定时间收获(11). 通过感染新鲜受体324K细胞（在12孔板中30%至40%的汇合处）和使用Promega荧光素酶检测试剂盒和Turner Instruments光度计对感染后2天制备的细胞提取物中的荧光素素酶活性进行检测，来确定产生的rAAV制剂的转导活性。
如图所示。，广告5数字图书馆308ΔpTP虽然该病毒的感染多重性（MOI）高于Ad5，但对rAAV的产生起到了辅助作用数字图书馆需要309。因此，转导AAV的产量相似。CMV公司。LUC通过使用Ad5获得数字图书馆308ΔpTP每格100 PFU或Ad5数字图书馆309，10 PFU/电池。在这些条件下进行的几个实验中，AAV的表观产率。CMV公司。使用Ad5获得的LUC数字图书馆308ΔpTP范围为Ad5的64%至104%数字图书馆309.由于这些测量是用热处理的病毒制剂（见下文）进行的，这些数字反映了对使用Ad5获得的rAAV相对产量的轻微低估数字图书馆308ΔpTP作为助手。如果Ad5的MOI降低10至100倍分力308ΔpTP降低至10 PFU/电池（图。). Ad5所需的MOI较高数字图书馆308ΔpTP可能反映了需要在与Ad5提供的级别相当的级别上表达助手功能数字图书馆复制后309。这些数据表明Ad5数字图书馆308ΔpTP有效地为rAAV提供辅助功能，并且，当辅助功能由腺病毒感染提供时，不需要pTP表达。
用Ad5高效生产荧光素酶转化rAAV数字图书馆308ΔpTP作为助手。324K细胞悬浮并用pAAV电穿孔。CMV公司。如前所述，LUC加pAAV/Ad(11)和被稀释到含有Ad5的培养基中感染数字图书馆309或Ad5数字图书馆308ΔpTP根据估计的MOI指示，表示为每存活细胞的PFU（电穿孔细胞存活率≈50%）。3.5小时后，抽吸接种物，轻轻冲洗附着的细胞并给予新鲜培养基。4天后，收集培养上清液和冻融细胞提取物(11). 样品在56°C下培养30分钟，然后在新鲜受体324K细胞中检测转导活性(11). 纵坐标上的值是计算上清液加细胞提取物的荧光素酶转导活性（总光单位[LU]）；光度计背景0.01 LU以上的测量值范围为3至500 LU。所示数据来自一个具有代表性的实验。在反复实验中，在腺病毒接种物暴露时间和收获时间有一定变化的情况下，产生的转导活性（总LU）为（1.15±0.92）×104和（2.17±0.26）×105使用Ad5数字图书馆308ΔpTP分别为10和100 PFU/电池，以及（2.77±0.51）×105使用Ad5分力309（每种情况下三个实验的平均值±标准偏差）。
在图中所示的实验中。，在转染/感染产生细胞后4天收集rAAV。在进一步的实验中，AAV的产量相似。CMV公司。无论是在4天后还是5天后收获，都能获得LUC转化活性，尽管仅在3天后产量显著降低。Ad5感染数字图书馆308ΔpTP高MOI（100 PFU/cell）导致后期大量细胞脱落。然而，在细胞提取物与上清液培养基中发现的转导活性的比例与先前报道的用Ad5从324K细胞产生rAAV的比例相似数字图书馆309作为助手(11). （从结合的附着细胞和分离细胞的提取物中回收了大约60%的总活性[数据未显示]。）
结果如图所示。在转导受体细胞之前，将rAAV制剂的样品在56°C下加热30分钟即可获得。许多实验室常规使用类似的热处理来灭活rAAV制剂中的腺病毒。图A显示了省略该加热步骤对AAV转化活性的影响。CMV公司。使用任一帮助器生成的LUC。这一遗漏增加了Ad5的明显转导活性数字图书馆309株rAAV显著增强（50-100倍），可能是由于腺病毒共感染对rAAV转导的刺激作用，可能是通过增强第二链合成介导的(三,4). 相反，省略加热对Ad5的转导几乎没有影响（大约是两倍）数字图书馆308ΔpTP-帮助AAV。CMV公司。LUC（图。A） ，与Ad5的预期缺乏复制一致数字图书馆308ΔpTP产生细胞中的病毒。观察到的轻微影响很可能是由于rAAV本身的一部分被热灭活。
AAV中无污染腺病毒辅助活性。CMV公司。使用Ad5生成的LUC库存数字图书馆308ΔpTP作为辅助，如在56°C下孵育缺乏效果（a）和添加腺病毒Ad5对转导的强烈刺激所示数字图书馆309（B）。（A） 图中相同rAAV制剂的样品。在（+56°）或之前未在56°C下孵育的情况下检测转导活性。注意，这种处理对Ad5几乎没有影响数字图书馆308ΔpTP-帮助AAV。CMV公司。LUC，而Ad5的表观转导活性数字图书馆309有助于rAAV在省略热处理时高出≈100倍。（B） 受试者324K细胞与含有AAV的加热细胞提取物（56°C，30分钟）复合感染。CMV公司。LUC，使用Ad5生成数字图书馆308ΔpTP或Ad5数字图书馆309辅助病毒和Ad5数字图书馆在MOI中添加309。2天后测定的荧光素酶活性表示为使用最大添加量Ad5观察到的活性的百分比数字图书馆309（MOI，每个单元3个PFU）。注意Ad5转导活性的差异增强数字图书馆308ΔpTP-在添加Ad5的低MOI下帮助rAAV数字图书馆309
为了进一步研究腺病毒共感染对转导的刺激作用，用AAV转导324K细胞。CMV公司。由任一辅助腺病毒产生的LUC，以及增加的Ad5的MOI数字图书馆309，2天后检测转导荧光素酶活性。如图所示。B、 尽管Ad5数字图书馆309通过两种病毒制剂刺激转导，这种作用对Ad5的作用更强分力308ΔpTP-帮助rAAV而非广告5数字图书馆309帮助rAAV，尤其是在添加Ad5的较低MOI下数字图书馆309.我们对此结果的解释是，Ad5数字图书馆309帮助的rAAV制剂保留了较低但显著的腺病毒水平，该腺病毒能够在56°C的处理和刺激的转导下存活，因此添加的Ad5水平较低数字图书馆309显示出几乎没有额外的刺激作用。这些结果进一步支持了Ad5产生的rAAV不存在污染腺病毒分力308ΔpTP作为助手。
作为用Ad5获得rAAV产率的进一步比较数字图书馆308ΔpTP和Ad5数字图书馆309名助手，我们用荧光素酶引物对病毒DNA进行了半定量PCR。病毒样本首先用DNase I广泛处理，以降解任何污染质粒或其他未经病毒包装保护的DNA。如图所示。，无论使用哪种腺病毒辅助物产生AAV，都观察到类似的信号强度。CMV公司。LUC公司。这些结果进一步证实了相对转导活性的结论（图。)，广告5数字图书馆308ΔpTP在高MOI条件下使用的辅助剂，其rAAV的产量可与使用常规的、具有复制能力的腺病毒辅助剂获得的rAAV产量相媲美。
与Ad5获得的rAAV产量的比较数字图书馆308ΔpTP（与Ad5相比数字图书馆309）通过PCR分析包装AAV的辅助病毒。CMV公司。LUC DNA。用任一辅助物产生的含有rAAV的病毒上清液与DNase I孵育（200μg/ml，37°C，4小时；对照实验显示在这些条件下质粒DNA完全消化），并在64°C下使酶失活15分钟。如前所述，用荧光素酶引物进行30个周期的PCR(17)，在DNase处理的上清液的稀释样品上。在这些条件下，通过在94°C的初始孵育中破坏病毒粒子，包装的DNA可以作为PCR的模板。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色对产物进行分析。作为标准，含有线性化荧光素酶质粒指示量的样品平行扩增。通道1至4，质粒标准（分别为0、3、30和300 fg）；通道5，标记DNA（123-bp阶梯[GIBCO BRL]）；车道6至8，使用Ad5生成rAAV数字图书馆308ΔpTP助手（分别相当于1、10和100 nl上清液的样品）；车道9至11，使用Ad5生成rAAV数字图书馆309辅助物（分别相当于1、10和100nl上清液的样品）。
在大多数实验室中，rAAV通常是通过含有重组基因组的质粒与表达AAV Rep和Cap的第二个质粒的瞬时共转染产生的，同时伴随着产生细胞的腺病毒感染，以提供必要的辅助功能（E1A、E1B、E2A、E4和VA RNA）(9,12,19). 迄今为止，通过病毒感染有效地引入这些功能是以rAAV被子代腺病毒污染为代价的。Ad5的使用数字图书馆308ΔpTP如本文所述，作为助手可以消除此限制。最近，一种从共转染表达质粒中提供相关腺病毒功能的替代方法也被证明可以有效生产不含腺病毒的rAAV(19). 直接比较该系统与我们使用Ad5获得的rAAV产量数字图书馆308ΔpTP由于多种原因，很难进行检测，这与使用不同的检测方法以及转染系统也使用了一种新型的、复制不足的AAV辅助质粒有关(19). 后一种系统需要使用293细胞系来提供未由Ad5衍生质粒编码的E1A和E1B功能。相比之下，Ad5数字图书馆308ΔpTP可以用作其他细胞中rAAV生产的助手，如324K线，如前所述，它具有某些实际优势(11). 其他正在开发的用于提高rAAV产量的系统通过合并有条件表达的AAV辅助序列来避免转染过程(代表和帽子)变成腺病毒助手或以单纯疱疹病毒为基础的助手(2,7). 这种基于pTP-deleted腺病毒的方法可以在不产生腺病毒后代的情况下实现rAAV的高效生产。
