人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和猴免疫缺陷病毒（SIV）属于慢病毒属在家里逆转录病毒科其包膜糖蛋白由表面和跨膜亚单位组成，这些亚单位由前体多肽的蛋白水解裂解产生，并且彼此非共价结合（有关综述，请参阅参考文献8). HIV-1和SIV的表面亚基，均命名为gp120，通过与细胞表面受体CD4和趋化因子受体家族成员的几种辅助受体之一的相互作用，直接识别靶细胞并确定病毒的嗜性（综述见参考文献4,9、和30). 跨膜gp41（HIV-1）或gp38（SIV）亚单位随后促进病毒和细胞膜的融合，将病毒内容物释放到细胞质中。
HIV-1株SF2和SIV株mac239的gp120中分别存在26个和23个潜在的N-连接糖基化位点，其多肽主干分别为482和503个氨基酸残基。HIV-1中还含有几种O-连接的低聚糖(三,14,15). 因此，糖残基约占HIV-1或SIV gp120分子量的一半。与不同病毒家族的许多包膜蛋白相比，人类和非人类慢病毒如此广泛的糖基化非常罕见。例如，麻疹病毒Edmonston株的617-残基受体结合蛋白H只有五个N糖基化位点，同一病毒的550-残基融合蛋白F只有三个。
从不同来源分离的HIV-1 gp120分子被发现含有高甘露糖型、复合型和杂交型的N-连接糖(11,21——23). 这些糖链在HIV-1生命周期中的作用已经通过多种方法进行了研究，包括使用糖基化抑制剂和酶解糖基化。这些研究表明，这三种类型的N-连接聚糖在病毒合胞体的形成和感染性中可能没有同等重要的作用（参考文献综述8和10). 例如，病毒的合胞体诱导能力和感染性通过病毒离子的去乙酰化或通过甘露糖苷酶I抑制剂阻断糖链加工而增强(17). 糖链也应发挥不同的作用，这取决于局部氨基酸序列上下文及其在第三糖蛋白结构上的位置。因此，HIV-1 HXB2的每个N糖基化位点都被单独沉默。然而，没有一个位点被发现对完全传染性至关重要(20). 另一方面，使用相同的菌株，Haggerty等人(12)发现第二恒定区（C2）中的一个N聚糖对传染性至关重要，Wu等人(32)发现第二可变区（V2）中的两个聚糖协同促进前体gp160蛋白水解为具有生物活性的gp120/gp41。此外，在Willey等人的研究中(31)，NL43菌株gp120的C2中另一个N聚糖（类似于HXB2）对传染性至关重要，这种可能性似乎仍然存在。因此，可用的数据不兼容，也无法提供单个聚糖在诱导HIV-1 gp120功能构象中的作用的可靠观点。
病毒包膜糖蛋白是感染宿主抗病毒免疫反应的主要靶点。在HIV、SIV和其他包膜病毒中，一些N聚糖倾向于屏蔽潜在的表位或阻碍抗体进入表位(1,2,6,7,19,24,28)而其他可能需要诱导抗原活性构象(13,29). 然而，支持N聚糖这些不同作用的证据也是零碎的，仅限于整个糖蛋白中的几个特定聚糖。我们还远远没有看到任何一个完整的gp120分子，也没有确定表位形成或实际屏蔽潜在表位所需的聚糖，以及哪些多肽区域是屏蔽的潜在表位。我们也不知道我们的免疫系统是如何看到这些含有N聚糖的病毒尽可能地变稀的。澄清这些问题不仅对了解艾滋病毒的发病机制很重要，而且对设计基于包膜蛋白的疫苗也很重要。
我们目前研究的目的是通过一个接一个地沉默糖基化位点来精确解决慢病毒感染性中对每种N聚糖的需求，并进一步了解病毒对多种聚糖去除的耐受程度。我们使用SIV，而不是HIV-1，因为本研究的目的是通过实验评估体内N聚糖的病毒学和免疫学作用。我们的结果清楚地表明，SIVmac239的gp120中的23个N聚糖确实对感染性并不同样重要，但在病毒感染性方面属于中性、调节性或临界聚糖。此外，这些不同的位点不是随机分布的，而是聚集在gp120的特定区域，这表明N聚糖的位置特异性作用。研究还表明，SIVmac239能够同时耐受至少五种N聚糖的稀释。
SIVmac239 gp120一级氨基酸序列中23个潜在的N-连接糖基化位点中的每一个都由典型的N-糖基化基序Asn-Xaa-Thr/Ser表示，其中Xaa是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。我们试图从感染性分子克隆中拯救病毒，在这些克隆中，所有23个N糖基化位点通过将第一个残基Asn改为非经典Gln残基而被单独沉默。亲本克隆为感染性质粒pBRmac239，其中SIVmac239的前病毒序列/尼日利亚石油公司-open已克隆(18). 3830基点速度我-生态包含包膜2640个核苷酸的RI限制性片段(环境价值)从pBRmac239中切下基因并克隆到pTZ18U噬菌体中。使用突变基因噬菌体体外诱变试剂盒第2版（加州里士满Bio-Rad）引入特定核苷酸变化。表中列出了用于诱变的寡核苷酸引物通过DNA测序鉴定引入的突变。这个速度我-生态将含有引入突变的RI片段从pTZ18U中切除，并克隆回速度我-生态pBRmac239的RI位点。通过对最终结构进行测序，再次验证了正确的突变。突变引起的任何效应或表型不一定是相应N聚糖去除的结果，但可能是氨基酸替代的结果。因此，只要突变在病毒拯救和复制方面不是中性的，我们就进行另一种突变，通过将基序中的第三个残基Thr或Ser转化为Ala来沉默糖基化（表).
表1
SIVmac239 gp120中N-连接糖基化位点突变后的病毒拯救和拯救病毒的表型
| 突变（氨基酸位置） | 氨基酸变化 | 致突变寡核苷酸（5′至3′）一 | 病毒拯救和表型b条 |
|---|
| 37 | Asn到Gln | GCTTGGAGG公司C类A类A类GCGACAATTC公司 | − |
| 39 | Thr到Ala | GAGGAATGCG公司G公司中国农业技术合作委员会 | + (→) |
| 70 | Asn到Gln | GTGGCCCTT公司C类A类A类GTTACAAAAG公司 | +（→） |
| 79 | Asn到Gln | GATGCCTGG公司C类A类A类AATACAGTCAC公司 | + (→) |
| 114 | Asn到Gln | CTATGAGATGC公司C类A类A类AAAAGTGAGAC公司 | +（→） |
| 146 | Asn到Gln | GTAGACATGGTC公司C类A类A类GAGACTAGTTC | + (→) |
| 156 | Asn到Gln | GCCCAGGAT公司C类A类A类TGCACAGGCTTG公司 | + (→) |
| 171 | Asn到Gln | GCTGTAAATTC公司C类A类A类阿加加格格 | + (→) |
| 184 | Asn到Gln | GAAAAAAGAGTAC公司C类A类A类GAAACTTGG公司 | + (→) |
| 198 | Asn到Gln | GAACAAGG公司C类A类A类AACACTGGTAATG | + (→) |
| 202 | Asn到Gln | AATAACACTGGT公司C类A类A类GAAAGTAGATG公司 | + (→) |
| 212 | Asn到Gln | CATGAACCCTGT公司C类A类A类ACTTCTTATCC公司 | + (→) |
| 244 | Asn到Gln | GCTTAGATGT公司C类A类A类GACACAATAT公司 | + (→) |
| 247 | Asn到Gln | GTAATGACACA公司C类A类A类TATTCAGGCTTT公司 | + (→) |
| 278 | Asn到Gln | ggtttgggtttC类A类A类GGAACTAGAG公司 | − |
| 280 | Thr到Ala | 全球气候变化框架G公司CTAGAGCAG公司 | − |
| 284 | Asn到Gln | CTAGAGCAAA公司C类A类A类阿加塔塔特 | − |
| 286 | Thr到Ala | CAGAAAAATAGA公司G公司CTTATATTAC公司 | − |
| 295 | Asn到Gln | GGTAGGAT公司C类A类A类AGGACTATATTA公司 | − |
| 297 | Thr到Ala | GGATAATAGG公司G公司CTATATTAG公司 | − |
| 306 | Asn到Gln | AAATAGTATTAT公司C类A类A类CTAACAATGAA公司 | + (→) |
| 316 | Asn到Gln | 加加各加C类A类A类AAGACAGTTTA公司 | − |
| 318 | Thr到Ala | CAGGAAATAAG公司G公司CAGTTTACC公司 | − |
| 371 | Asn到Gln | GTATACTGGAACT公司C类A类A类AATACTGATAA公司 | +（→） |
| 377 | Asn到Gln | CTGATAAAATC公司C类A类A类TTGACGGCTC公司 | − |
| 379 | Thr到Ala | AAAATCAATTTG公司G公司CGGCTCCTG公司 | + (→) |
| 460 | Asn到Gln | CCTCACGTGT公司C类A类A类TCCACAGTGA公司 | +（↑） |
| 462 | Thr到Ala | GTGTAACTCC公司G公司CAGTGACCAG公司 | + (↑) |
| 476 | Asn到Gln | GGATTGATGGA公司C类A类A类中国民航总局 | + (→) |
| 479 | Asn到Gln | GAAACCAACT公司C类A类A类ATACCATGAG公司 | + (↑) |
| 481 | Thr到Ala | 中国民航总局G公司CCATGAGTG公司 | + (↑) |
将SW480细胞接种在6孔培养板中，1天后，在60-80%的汇合处，使用DOSPER脂质体转染试剂（德国曼海姆Boehringer Mannheim）转染3μg质粒DNA。两天后，5×105在37°C下用Polybrene（2 mg/ml）处理细胞30分钟后，将MT4细胞添加到每个孔中。共培养3天后，细胞转移至25cm2装有10 ml RPMI 1640和10%胎牛血清的烧瓶。每隔3-4天采集这些细胞的培养上清液，并检测其逆转录酶活性(16). 培养上清液储存在−80°C下，用作病毒储备。
从野生型cDNA克隆开始的实验总是被搁置一边，以便直接比较突变型和野生型。在一系列Asn到Gln的突变中，发现许多位点能够耐受突变并使病毒完全恢复感染，例如突变体247和306（表和图。A） ●●●●。这些感染性中性的位点被归为I类。突变体37不活动，但交替突变改变了N糖基化基序的第三个残基以产生突变体39，导致产生完全感染性病毒（图。B） ●●●●。站点377和379也是如此（表). 因此，这两个位点属于第一类。第二类中的位点460和479是独特的，因为第一个或第三个残基的突变导致了能够比野生型更快复制的病毒的拯救（图。C和表). 因此，这些位置的聚糖似乎具有中等传染性。278、284、295或316位点的Asn-to-Gln突变均不能产生感染性病毒（表)，如突变体284和295所示（图。D） ●●●●。通过诱变相应的第三个残基也发现了相同的结果（表). 因此，这些位点似乎对促进gp120的正确折叠或保护分子免受蛋白水解至关重要，它们被归为第三类。
N-连接糖基化位点突变体的代表性生长动力学。将野生型或N糖基化突变质粒转染SW480细胞，2天后与MT4细胞共培养，扩增回收的病毒。检测培养上清的逆转录酶活性。共耕的开始被视为第0天。在每组实验中，第0天的p27抗原滴度在样本之间具有可比性，这表明MT4细胞共培养的扩增是由几乎相同数量的病毒或非感染性等效物启动的。有关详细信息，请参阅文本。
从多肽链中去除单个N聚糖应导致分子量减少2至3 kDa。调整p27抗原量至200 ng后，5×105MT4细胞被每种病毒感染。感染后一周，用100μCi的EXPRE对细胞进行代谢标记35秒35S公司[35S] 蛋白质标签混合物（杜邦-新英格兰核电厂，特拉华州威明顿）过夜。然后对细胞进行裂解，并用SIVmac239感染恒河猴的血清对裂解产物中的包膜蛋白进行免疫沉淀(猕猴)并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析(26). 事实上，除了一个突变体247之外，所有恢复的突变体病毒在SDS-PAGE中都显示其包膜蛋白gp160和gp120的轻微移动，如突变体79、114、146、156、171、244、306、371和379所示（图。A） ●●●●。前体gp160分子作为一个相对尖锐的带迁移，因为它们处于聚糖添加的早期阶段，并且尺寸相对均匀。相反，裂解产物（gp120）的大小不均匀，因为它们经过了不同的加工。因此，与gp120相比，gp160的迁移率变化更为明显。这些结果清楚地表明，野生型gp120的每个位点都存在一个N聚糖，并且它确实被特定突变所清除。无论位点247是否发生突变，其突变不会导致其他位点的迁移率变化（图。A） ，实际使用情况尚不清楚。然而，该位点上的聚糖添加可能被附着在前一位点244上的聚糖立体阻断，因为这两个位点非常接近。
如图所示，由野生型（野生）和N糖基化突变体编码的包膜蛋白的电泳迁移率。用EXPRE对感染的MT4细胞进行代谢标记35秒35秒[35S] 蛋白标签混合过夜。然后对细胞进行裂解，并用SIVmac239感染恒河猴的血清对裂解产物中的包膜蛋白进行免疫沉淀。通过SDS–7%PAGE分析样品流动性。显示了对应于未加工包膜gp160和加工包膜表面成分gp120的蛋白质带。
结果如表所示建议不同类别的站点不是随机分布的，而是聚集在gp120的特定部分。当每个位点以线性gp120序列与已知的结构域和功能域进行映射时，这一点会更清楚地显示出来(5)（图。). 类别I中的位点主要分布在N末端的一半，而类别II和类别III中的位点分别分布在包括CD4结合域在内的C末端和包括C环在内的中间部分。
23个N-连接糖基化位点突变体的感染性总结。这些数字表明SIVmac239 gp120中典型N-连接糖基化序列的天冬酰胺残基的位点。标有“（−）”的数字代表突变消除传染性的位点，而标有“（↑）”的数字代表突变增加传染性的位点。其他未标记位点的感染性为中性，因为它们的诱变不会影响感染性。还进行了两到五个位点的多重突变。顶部（+），导致病毒生成的组合；底部（−），是致命的组合。例如，位点79、146、171、460和479（∗）的五倍突变可以产生具有足够高传染性的后代，而146、173和476（†）的三倍突变是致命的。
为了了解SIVmac239能够在多个位点上耐受聚糖的去除，我们尝试尽可能多地沉默糖基化位点。我们尝试改变典型基序中第一个残基（Asn到Gln）的所有结果在图中分别作为成功和失败的病毒拯救案例进行了说明。（分别为顶部和底部）。首先，可以同时关闭146和171两个站点。从这个双突变体开始，我们试图额外沉默中间位点156或最近的位点114或184，但没有发现病毒。因此，尽管这些位点作为单聚糖是不可或缺的，但当其他位点被沉默时，其中一些位点绝对必须被使用。换言之，该区域应保持一定程度的糖链密度，以保护分子免受蛋白质水解或驱动其正确折叠。当我们沉默了一个相对较远的站点212，或一个非常远的站点476，以及146和176时，病毒拯救也没有成功，这表明这些远程站点之间存在一些合作，或者它们在三维结构中的紧密性。另一方面，除了146和171（图。). 值得注意的是，这种五倍突变在细胞中的复制速度甚至比野生型更快（图。E） ●●●●。在SDS-PAGE中分析了一系列具有这些单到五倍突变的病毒的gp160和gp120活动性。如图所示。B、 随着突变数量的增加，这些糖蛋白分子迁移速度加快。这一发现清楚地证实了N聚糖一个接一个地被去除，最多五个。如果适当地选择了四个位置，则相对容易使四个位置保持沉默（图。).
我们对单点突变的研究表明，SIVmac239 gp120的23个N-连接糖基化位点对病毒感染性并不同样重要，该突变将典型Asn-Xaa-Thr/Ser N-连接糖基化序列的第一或第三个残基转换为非经典残基。他们要么中立，要么温和，要么挑剔。SDS-PAGE中突变的gp120分子的细微但显著的迁移率变化支持了这样的观点，即在天然病毒生命周期中，除了一个中性和调节位点外，其他所有位点都明显被糖基化。其中一个显著特征是，这三类N糖基化位点并非随机分布，而是倾向于在gp120线性序列中的特定区域聚集。病毒感染所需的所有四个关键位点都被映射到中间部分，包括C环。因此，对于gp120的适当折叠和生物功能，糖链与这些位点的共翻译连接及其加工似乎比与其他位点的连接更重要。复合型N-连接聚糖通常位于膜锚定糖蛋白的N末端(27). 事实上，在HIV-1 gp120中，中心恒定区域C2被高甘露糖和/或杂交型链富集，而包括V1和V2在内的上游区域几乎完全具有复合型链(21). 这表明C2在其N聚糖被进一步加工成为复合型之前，大部分折叠到gp120构象的内部，而N末端区域保持在外部，以便N聚糖可以被完全加工成复合型。HIV-1单克隆抗体定位研究也表明，保守区被不同程度地埋藏，而可变区暴露在表面（参考文献综述8). 含有四种必需N聚糖的SIVmac239 gp120的中心区域与HIV-1 gp120跨越C2和V3的区域对齐，后者对应于SIV C环(8). 没有强有力的证据表明SIV C环与HIV-1 V3一样暴露。此外，与HIV-1 V3相比，SIV C环中菌株之间的序列变异性似乎要小得多(5). 人们很容易推测，包括C环在内的四种N聚糖在中间部分的附着对于诱导SIVmac239 gp120的适当核心构象是至关重要的。HIV-1 gp120 C2中的N聚糖似乎对传染性很重要(12,31)，可能扮演类似的角色。
另一方面，N末端和C末端N糖基化位点似乎对SIV gp120的正确折叠和成熟不那么重要。更值得注意的是，我们的两个单点突变株460和479显示出更快的复制能力，因为没有关于HIV-1的类似病例报告。有趣的是，这两个位点位于CD4结合位点之内或附近。在基因报告融合试验中，与野生型相比，突变体460表现出更高的细胞融合活性（数据未显示）(25). 因此，N聚糖可能在一定程度上干扰gp120与CD4的相互作用和/或感染的其他早期步骤。然而，这些聚糖在天然分离物中的保存(5)这表明它们在SIV体内复制和自然界持久性中的优势。聚糖可能掩盖附近的潜在表位或立体抑制抗体进入表位，从而帮助病毒存活。从同样的观点来看，多达五个站点同时沉默是值得注意的。这种类型的多重突变体将非常有用，特别是用于描述被聚糖掩盖的潜在表位。此外，Doe等人报告说，脱糖HIV-1 gp120比完全糖基化的gp120引发更多的细胞毒性T淋巴细胞反应(7). 因此，研究我们的五倍脱糖基突变体是否能在恒河猴体内诱导更好的体液和细胞反应是一个相当有趣的问题。其更直接的用途可能是用于结构研究，因为高度糖基化被认为是糖蛋白晶体生成的主要障碍。
