重组腺病毒协议通常使用强启动子来实现重组蛋白的高水平生产（有关综述，请参阅参考文献1,5、和12). 然而，这有时会导致一个问题，因为组成型基因表达是非生理的，可能会干扰细胞中的信号系统并导致细胞毒性。因此，允许调节表达、开关和微调报告基因表达水平的基因盒在实验设计中具有价值，例如蛋白质功能的基础研究、细胞毒蛋白的表达和癌症治疗。
在这里，我们描述了两个通用腺病毒载体系统的构建，该系统允许在基因转移实验中调节报告基因的表达。与传统技术相比，腺病毒介导的基因表达系统的一个主要优点是，它们避免了建立稳定转染细胞系的需要，这是一项繁琐的任务，必须对每种类型的细胞重复使用。
我们采用了双重感染策略来控制报告基因在我们的载体系统中的表达（图。). 在Tet-ON系统中，反向四环素（Tet）阻遏蛋白与单纯疱疹病毒（HSV）VP16转录激活域（rtTA）融合(4)在组成性活性巨细胞病毒（CMV）启动子后面克隆，并插入到5型腺病毒（Ad5）中数字图书馆309 (9)载体（产生病毒AdCMVrtTA；图。). 氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因被克隆到一个Tet增强子后面，该增强子由七个串联Tet操作员DNA结合位点组成，融合到一个最小的腺病毒主要晚期启动子/三方先导结构（病毒AdTetTripCAT；图。). 通过向培养基中添加多西环素（DOX）激活CAT报告基因的转录(4).
Tet-ON和Prog系统的示意图。采用混合感染策略将激活剂和CAT报告基因导入受体细胞。然后通过添加相应的诱导剂激活报告基因表达。将Tet和Prog增强子序列克隆到最小主要晚期TATA启动子元件的上游。我们融合了一个编码转录起始位点下游主要晚期三分体先导的cDNA，作为一个5′非编码序列。三方领导被证明是一个mRNA输出信号(8)和翻译增强子(15)在晚期感染细胞中。将基因盒插入Ad5的E1区数字图书馆309 (9)导致重组腺病毒复制缺陷。
在孕酮拮抗剂诱导的基因表达系统中(13)（以下简称Prog系统），嵌合反式激活蛋白(13)由hPRB891的配体结合域融合到Gal4 DNA结合域和HSV VP16反式激活子域组成，在CMV启动子后克隆并插入Ad5数字图书馆309 (9)载体（产生病毒AdCMVProg；图。). 这种人类孕酮受体突变体不与孕酮或其他内源性激素结合，但仍能与孕酮拮抗剂RU 486结合(13). CAT报告基因克隆在Gal4增强子后面，由五个Gal4 DNA结合位点组成，融合到一个最小的主要晚期启动子/三部分先导结构（病毒AdG5TripCAT；图。). 向培养基中添加RU 486可激活CAT报告基因的转录。有关本文中使用的克隆策略和方法的更多详细信息，请访问www.bmc.uu.se/IMIM/res/GA.html。
病毒载体系统的一个重要特征是可以微调报告基因的表达。这在一些生物环境中很重要，例如对基本蛋白质功能的研究，在这些研究中，过高的蛋白质表达可能是有毒的，或导致细胞中调节通路的非生理性扰动。为了测试两个载体系统的诱导潜力，将HeLa细胞与属于每个系统的激活剂和报告病毒的每个细胞10 PFU共同感染。分别通过增加RU 486或DOX的量在感染开始时诱导报告基因表达，并在感染后16 h通过CAT酶分析测定CAT基因表达(2). 如图所示。在未诱导细胞的两个系统中均未检测到CAT活性。DOX或RU 486的添加量增加导致CAT活性相应增加，在相应诱导物的4μM处达到最大CAT水平。在每个细胞1至20 PFU的测试范围内观察到相同的剂量-反应曲线（数据未显示）。然而，正如预期的那样，CAT总活性随着感染多重性的降低而降低。总之，这些结果表明，Tet-ON和Prog系统满足第一个标准，即报告基因的表达水平可以通过改变诱导物的数量或感染的多样性来控制。在病毒生长过程中抑制报告基因表达的可能性使重组腺病毒能够表达干扰病毒复制的基因产物（数据未显示）。
Prog（A）和Tet-ON（B）系统的剂量反应。HeLa细胞与10种各自的激活病毒和报告病毒的PFU共感染。在感染开始时添加越来越多的诱导剂，在感染后16小时收集细胞。CAT活性通过荧光成像仪扫描测量和定量。误差条表示从三个独立实验中计算出的标准偏差。
为了定量报告基因的表达，HeLa细胞与激活剂和报告病毒每细胞10个PFU共感染。在感染开始时添加诱导剂，并在感染后16 h通过CAT酶联免疫吸附试验（ELISA）（Boehringer Mannheim）定量CAT蛋白的积累。如图所示。，添加相应的诱导剂导致在Prog和Tet-ON系统中CAT蛋白表达的显著诱导，其中Prog系统始终产生高得多的蛋白表达水平。两种系统中CAT表达的背景水平都很低，因此很难准确估计折叠诱导。然而，在100倍更高浓度下对未诱导提取物进行分析表明，Tet-ON的诱导倍数（约为1800倍）大于Prog系统的诱导倍数网址：www.bmc.uu.se/IMIM/res/GA.html). 这两种基因调控系统的CAT蛋白生成水平令人印象深刻。因此，与组成活性CMV早期启动子（AdCMVCAT）转录控制下表达CAT的重组腺病毒相比，Prog和Tet-On系统产生的CAT蛋白的比率分别为140和50（图。). 为了确定Prog和Tet-ON系统是否可以用于高水平的蛋白质生产，我们定量了293细胞中CAT的表达，这支持重组病毒的复制。感染这两个系统后，每10个系统中大约累积1.5μg CAT蛋白6感染后24小时的细胞（数据未显示）。由于293个细胞可以在旋转培养基中生长，这意味着每升细胞中大约有1毫克CAT蛋白。因此，这些载体系统可用于大规模重组蛋白生产似乎是现实的。这种替代方法很有吸引力，因为针对不同细胞类型的蛋白质修饰有望正确发生。
严格控制报告基因表达。HeLa细胞与10种各自的激活病毒和报告病毒的PFU共感染。在感染开始时添加诱导剂（4μM），并在感染后16 h制备细胞提取物。使用CAT ELISA试剂盒（Boehringer Mannheim）定量CAT蛋白表达。显示了从七个独立实验计算出的CAT蛋白表达的平均值。
我们的矢量系统的一个重要特点是可以在广泛的细胞类型中发挥作用。理论上，我们实验方法的主要局限性在于受体细胞是否表达腺病毒受体和共受体，从而允许病毒摄取。为了测试病毒载体的宿主范围，我们感染了Cos-7（猴病毒40转化的非洲绿猴肾细胞）、NIH 3T3（小鼠成纤维细胞）和1523细胞（人类包皮成纤维细胞。如图所示。在所有细胞中，我们观察到高诱导率，背景与未感染提取物相同。Tet-ON系统在所有测试的细胞类型中都能重复工作。相反，Prog系统在除NIH 3T3细胞外的所有细胞类型中有效诱导CAT表达。由于Tet-ON系统在此细胞类型中起作用，因此Prog系统的失败不是由于病毒摄取，更可能是由于RU 486无法激活此细胞类型中的孕酮受体所致。
Tet-ON和Prog系统在几种电池类型中的工作效率相似。HeLa细胞、Cos-7细胞、NIH 3T3细胞和1523细胞与属于各自系统的每细胞10个激活剂和报告病毒共同感染。在感染开始时添加诱导剂（4μM），并在感染后16 h测量CAT活性。为了进行比较，显示了感染AdCMVCAT的20个PFU诱导的CAT表达。
为了确定细胞系中观察到的高水平CAT蛋白表达诱导是否也在体内模型系统中再现，我们向BALB/c小鼠肌肉注射AdCMVrtTA和AdTetTripCAT混合物。图中总结了两个独立实验的结果。。在注射后的不同时间，分析来自相同动物的注射肌肉以及肺和肝样本的CAT表达。只有肌肉活检发现CAT阳性，表明病毒没有从注射部位传播（数据未显示）。虽然肌肉活检中检测到的CAT蛋白的数量在不同动物之间有所不同（图。)，DOX处理持续给予CAT表达的高水平诱导。观察到的变异性可能主要由两个因素造成：（i）注射小容量和（ii）切除等量肌肉组织的实验困难。然而，图中总结了结果。证明腺病毒Tet-ON载体系统也可以在动物模型系统中有效控制报告基因表达。
体内CAT的诱导表达。用Tet-ON系统的指定PFU肌肉注射小鼠。用CAT-ELISA分析肌肉提取物中CAT蛋白的表达。结果显示为每微克总裂解蛋白中CAT蛋白的毫微克数。以从多种动物中提取的提取物得出的平均值为基础的横线显示，使用的动物数量显示在顶部的括号内。未注射或接受DOX的对照动物仅显示无CAT蛋白表达（数据未显示）。
在我们的工作中，我们意识到其他研究小组也采用了类似的实验策略来构建腺病毒载体以诱导基因表达（例如，参见参考文献6,7,10,11、和14). 这些报告大多基于表达Tet-OFF系统的重组腺病毒(三). 与我们的Tet-ON或Prog系统的结果相反，该系统不允许快速诱导报告基因表达，因为需要清除或消耗四环素以激活基因。这在动力学参数起作用的研究中可能至关重要。值得指出的是，我们的Prog和Tet-ON系统可以很好地相互结合使用，允许在实验装置中独立控制两种不同蛋白质的表达（数据未显示）。
