呼肠孤病毒蛋白μ2由M1基因编码，是一种RNA结合蛋白

摘要

基因分析表明，呼肠孤病毒M1、L1和L2基因是小鼠急性心肌炎的决定因素(19,20). 这三个基因编码核心蛋白，在病毒核心的每个顶点形成一个结构单元(7,9,14). L2编码的λ2蛋白是鸟苷转移酶(5,13)L1编码的λ3蛋白具有RNA聚合酶活性(8,23). 虽然基因分析已确定M1基因是呼肠孤病毒RNA合成的决定因素(6,18,28)作为病毒核心中核苷三磷酸酶（NTPase）活性的决定因素(15)目前还没有关于M1编码蛋白μ2功能的直接生化研究。

蛋白μ2的736氨基酸序列在呼肠孤病毒1型和3型之间很好地保守(27,30). 在对氨基酸序列进行检查后，我们注意到几个区域含有异常高数量的精氨酸和赖氨酸残基。这些基本区域经常与RNA结合活性相关(三,4,24); 因此，我们克隆并表达了M1基因，并检测了其结合合成RNA类似物和单链RNA（ssRNA）的能力。

使用高效逆转录-PCR（Vent聚合酶；Promega，Madison，Wis.）插入M1基因的副本（来自呼肠孤病毒8B株[21])pBluescript II（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫尼），并使用T7 RNA聚合酶合成体外转录物。M1转录物和对照荧光素酶mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译[³⁵S] 用抗μ2抗血清、聚（U）-琼脂糖或聚（I-C）-琼脂糖沉淀蛋氨酸标记的蛋白质，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行解析（图。​（图1）。1). M1转录物的体外翻译产生了83-kDa蛋白，与μ2的预期一样（图。​（图1），1)，这是由抗μ2抗血清而非对照抗血清免疫沉淀的（图。​（图1A）。1A） ●●●●。低分子量产物通常在M1翻译中获得(17,31,32). 翻译的荧光素酶mRNA产生预期的61-kDa蛋白（图。​（图1），1)它不是由抗μ2抗血清或对照抗血清沉淀的（图。​（图1A）。1A） ●●●●。μ2和荧光素酶结合控制Sepharose CL4B不显著（每个结合4%[图。1B] ）。然而，μ2结合了poly（U）-Sepharose和poly（I-C）-Sepharose（相对于Sepharose CL4B结合分别增加了七倍和三倍），而荧光素酶没有（没有明显增加）。因此，μ2结合ssRNA和双链RNA（dsRNA）类似物。

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图1

μ2结合聚（U）-葡聚糖和聚（I-C）-葡糖。（A） 免疫沉淀。T7-生成的M1转录物和对照荧光素酶mRNA（Promega）在含有[³⁵S] Met，并且用蛋白A-Sepharose CL4B（Ptein A-Seph）珠（Pharmacia）预筛选产物，所述蛋白A-Sepharose CL4B（Ptein A-Seph）珠在TNET缓冲液（50mM Tris[pH 8.0]、100mM NaCl、5mM EDTA、1%Triton X-100）中洗涤。抗血清型3脱灵（T3D）μ2-Trp-E融合蛋白超免疫兔抗血清的制备(32)与T1L-（或8B）-μ2交叉反应，与洗涤蛋白A-Sepharose CL4B珠培养，然后在TNET缓冲液中重新悬浮。然后用复合珠培养预清液。在放射免疫沉淀分析缓冲液（50 mM Tris[pH8.0]，100 mM NaCl，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸盐，0.1%SDS）中广泛洗涤后，结合蛋白在Laemmli样品缓冲液中通过煮沸洗脱(11). 洗脱蛋白和总翻译蛋白在10%莱姆利SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离(11)，在5%三氯乙酸中固定，干燥，暴露于薄膜中。Luc，萤光素酶；抗体。（B） RNA结合测定。在RNA结合缓冲液（70 mM NaCl，10 mM Tris[PH7.4]，5 mM MnCl₂，1 mM二硫苏糖醇），然后在同一缓冲液中重新悬浮。翻译的蛋白质在Sepharose CL4B中预先分离，用指示的珠培养，并在RNA结合缓冲液中洗涤。使用与面板A相同的凝胶。

接下来，研究了二价阳离子对μ2与聚（U）-琼脂糖和聚（I-C）-琼脂糖结合的影响（图。​（图2）。2). 在5 mM Mn中²⁺μ2与poly（U）和poly（I-C）-Sepharose均显著结合，而荧光素酶没有结合，也没有结合对照Sepharose CL4B。然而，在5 mM Mg中²⁺，μ2与聚（U）-琼脂糖的结合减少，与聚（I-C）-琼脂糖的结合被消除，在没有二价阳离子的情况下也出现了类似的结果。因此，μ2与RNA类似物的结合在锰中是最佳的²⁺在6.8至8.0的pH值范围内观察到类似结果（未显示数据）。μ2结合RNA在锰中更好的观察²⁺比Mg²⁺与以下证据一致，即纯化呼肠孤病毒蛋白λ3在Mn中的体外聚（C）依赖性聚（G）聚合酶活性较高²⁺比Mg²⁺(23)μ2和λ3可能在病毒核心形成复合物(9)用于病毒RNA合成。

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图2

二价阳离子对μ2与聚（U）-葡聚糖和聚（I-C）-葡糖结合的影响。如图所示，清洗Sepharose CL4B（Seph4B）、poly（U）-Sepharose和poly（I-C）-Sepharose。​图11RNA结合分析，5 mM Mn除外²⁺用5 mM Mg替代²⁺或指示无二价阳离子。翻译产品（如图。​图1）1)用Sepharose CL4B预先洗涤，然后用指示的珠培养，如图所示。​图11RNA结合分析，但所有培养物和洗涤物均含有指示的二价阳离子。通过SDS-PAGE对与指示珠结合的总翻译产物和三份样品（μ2）或单个样品（荧光素酶[lucif]）进行解析，并使用Packard即时成像仪进行扫描。使用制造商的软件选择适当分子量的条带进行定量，并计算蛋白质结合的百分比相对于总翻译的μ2或萤光素酶（平均值±标准差）。

迄今为止，还没有证据表明呼肠孤病毒RNA结合蛋白具有序列特异性。为了研究这一点，从重组杆状病毒中表达μ2和对照GUS蛋白如下。尼毛原体用含有呼肠孤病毒M1基因或对照GUS基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞，并用SDS-PAGE解析细胞裂解产物（图。​（图3A）。三A） ●●●●。考马斯蓝染色显示GUS（泳道2和3中的重复）和μ2（泳道4和5中的重复）在预期分子量下具有独特的条带。在蛋白质印迹中，抗μ2抗血清仅与感染含有M1的杆状病毒的细胞中产生的83kDa蛋白结合（图。​（图3B，三B、 车道3和4）。

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图3

蛋白质μ2由重组杆状病毒表达。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.）将8B M1基因亚克隆到重组杆状病毒中。对照组表达GUS的重组杆状病毒由制造商提供。T.ni公司用在Sf9昆虫细胞中传代的病毒株感染昆虫细胞，在感染（POSTINF）后48小时（B）或72小时（A和B）收集细胞培养物，用补充有1mM苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在放射免疫沉淀分析缓冲液中溶解。通过在10%莱姆利SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来解析裂解液上清液。（A） 考马斯蓝染色，重复样本。MW，分子量（千道尔顿）标记。（B） Western Blot分析。对于Western blot分析，使用半干印迹系统将蛋白质转移到Immobilon-P膜（Millipore，Bedford，Mass.）。ECL（增强化学发光）系统（Amersham Life Sciences，Arlington Heights，Ill.）根据制造商的协议使用超免疫兔抗血清进行检测，如图所示。​图11免疫沉淀。

μ2与特定RNA序列的结合研究如下。杆状病毒表达的μ2和GUS与抗μ2抗血清和蛋白A-Sepharose孵育。然后在200 mM NaCl中孵育抗体复合蛋白，无需进一步添加ssDNA（M13mp18；美国生化公司，俄亥俄州克利夫兰），或指定数量的未标记（竞争对手）T7生成的ssRNA转录物：呼肠孤病毒阳性或阴性链S4(18)、阳性品牌M1或对照猫β-肌球蛋白。然后用生成的T7培养三硅酸盐样品³²如图所示，P标记的ssRNA转录物。结合RNA被洗脱，通过SDS-PAGE解析，定量，并在没有竞争对手的情况下表示为结合百分比（图。​（图4）。4). 蛋白质μ2与呼肠孤病毒ssRNA结合，虽然同源ssRNA以剂量依赖的方式抑制了结合，但异源ssRNA也抑制了结合（图。​（图4）4)（M1实验³²P-RNA）。此外，当添加过量的同源ssRNA、异源ssRNA或异源ssDNA时，μ2结合的肌球蛋白ssRNA以及与呼肠孤病毒和肌球蛋白ssRNA的结合被抑制高达90%（图。​（图4）。4). 因此，虽然μ2与单链核酸结合，但数据没有提供序列特异性结合的证据。与其他呼肠孤病毒蛋白复合物中的μ2可能识别特定的呼肠孤毒序列进行结合，或具有真实末端的ssRNA需要进行序列特异性结合（真实的呼肠病毒转录物不能以足够高的特异性活性合成以供测试）。没有检测dsRNA结合的序列特异性（同样，RNA不能被放射性标记为足够高的特异性活性进行测试）。

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图4

杆状病毒表达的μ2结合核酸，并且结合不是序列特异性的。重组杆状病毒感染后的裂解上清液T.ni公司细胞与兔抗μ2抗血清孵育，然后与蛋白A-Sepharose CL4B孵育。用放射免疫沉淀分析缓冲液大量洗涤后，将Sepharose蛋白A免疫复合物μ2或对照GUS蛋白重悬于高盐RNA结合缓冲液（200mM NaCl、30mM Tris[pH 7.4]、5mM MnCl₂，0.5mM二硫苏糖醇），并在没有进一步添加的情况下，与未标记的（竞争对手[comp.]）ssDNA（M13mp18；U.S.Biochemical Corp.）或与指示量的未标记的（竞争对手）T7产生的ssRNA转录物孵育：呼肠孤病毒阳性（pos）-或阴性（neg）-链S4(18)、阳性品牌M1或对照猫β-肌球蛋白。然后用生成的T7培养三硅酸盐样品³²P-标记的ssRNA转录物如所示（根据预测的比活性推断，每个反应1 ng），然后用高盐RNA结合缓冲液广泛洗涤。用1 M NaCl–30 mM Tris（pH 7.4）和5 mM MnCl洗脱结合RNA₂，并在1%琼脂糖凝胶上电泳。凝胶经酸固定、干燥，并用Packard即时成像仪扫描。制造商的软件用于量化适当分子量的带。百分比³²P-RNA结合是相对于³²P-RNA在没有竞争性未标记核酸的情况下结合（三份样品，平均值±平均值标准误差）。

观察到μ2在200 mM NaCl下结合ssRNA（图。​（图4），4)当离子强度降低时（数据未显示），没有任何益处，表明μ2与ssRNA结合的相对稳定性。与μ2一样，一些植物病毒运动蛋白在100至200 mM NaCl浓度范围内与ssRNAs结合(2,22). 相比之下，蓝舌病毒蛋白NS2与蓝舌病毒ssRNA的结合在100到200 mM NaCl之间严重减少(25). 同样，流感病毒的NP蛋白虽然对病毒的转录和复制至关重要，但与ssRNA的结合是非特异性的，当NaCl浓度大于200 mM时，这种结合会被破坏(26).

蛋白μ2现在是11种呼肠孤病毒蛋白中第6种具有RNA-结合活性的蛋白。其他五种呼肠孤病毒蛋白（∏2、∏3、λ1、∏NS和μNS）结合ssRNA、dsRNA或两者；然而，没有研究提供序列特异性结合的证据（参考文献综述14). 当μ2结合ssRNA时，这种结合被ssDNA竞争（图。​（图4）。4). 呼肠孤病毒和轮状病毒的复制（参考文献综述10和16)发生在细胞核外（尽管由于未知原因在细胞核中发现呼肠孤病毒蛋白3[29])没有进化选择压力来区分RNA和DNA。事实上，呼肠孤病毒蛋白λ1除了结合dsRNA外还结合dsDNA(12)轮状病毒蛋白VP2除RNA外还结合dsDNA(1). 大多数呼肠孤病毒和轮状病毒RNA-binding研究没有将DNA作为对照，因此尚不清楚DNA结合是否是呼肠孤毒和轮状毒RNA-bining蛋白的共同特性。

致谢

参考文献