所有的逆转录病毒都需要包装两个基因组RNA才能感染。直接正确包被的病毒序列称为psi（Ψ）元件，位于基因组RNA的5′端，从引物结合位点下游开始，延伸至5′端堵住病毒RNA编码区(1,4,16,23). 电子显微镜显示，提取的各种来源的逆转录病毒基因组RNA以平行方向靠近其5′端连接，形成二聚体(5,15,18); 二聚区映射在Ψ元素内。在适当的体外条件下，Ψ元件中形成一系列保守干环的序列能够形成二聚体。根据确切的突变情况，在病毒背景下删除或修改这些序列会对包衣或感染性产生影响。因此，无论是在非片段化病毒基因组长度RNA的选择性包被中还是在感染后立即发生的复制的早期步骤中，二聚化都被认为是必需的。
在Moloney小鼠白血病病毒（MoMuLV）中，体外分析表明，在适当的盐和温度条件下，在没有病毒编码蛋白的情况下可以发生二聚化(11,19,22). 动力学研究表明，二聚反应是一个多步骤过程，涉及Ψ结构域中结构元素之间的一系列分子间关联。添加MoMuLV核衣壳蛋白10（NCp10），该蛋白来源于堵住体内前体刺激二聚体的体外形成(7). 迄今为止，NCp10对二聚体形成的刺激仅限于亚基因组RNA，尚未观察到全长病毒基因组RNA的体外二聚体。基于体外观察，人们认为基因组病毒RNA在体内形成稳定的二聚体需要病毒编码堵住蛋白质。
为了研究二聚化反应的体内机制，我们设计了一种核酶策略，该策略利用了Ψ-系链核酶和靶点的病毒离子共定位(21). 我们希望确定Ψ元件是否允许核酶靶向在受感染细胞的细胞质中独立于包装物的共定位，如果是这样，是否需要病毒蛋白来完成这一过程。因此，实验设计依赖于核酶编码RNA和靶RNA之间异二聚体的形成。许多因素可能会使同型二聚体的形成偏向于异二聚体，包括Ψ元素的性质、转录水平和转录物的共表达。为了解决这个问题，我们设计了来自MoMuLV载体pLNL-6的靶向和核酶逆转录病毒载体(1)（图。A） 利用抗生素抗性标记监测转染效率。所有结构在编码区域中都存在缺陷波尔,环境价值，以及堵住基因，但保留二聚化和包装所需的已知序列（Ψ区）（图。A） ●●●●。每一个都包含MoMuLV长末端重复序列（LTR），它只直接转录一个RNA，起始于5′LTR，终止于3′LTR（图。A） ●●●●。为了清楚起见，pLNL-6被称为pΨneo。从pLNL-6派生的另一对构造具有新被替换的基因湿度基因，维持MoMuLVΨ序列，并具有功能性抗-新核酶（pΨhygRbz）或被双点突变（pψhyg*Rbz。B和C以及图。)紧跟在湿度计编码区域。
本研究中使用的逆转录病毒载体的线性图谱。基于MoMuLV的逆转录病毒载体pLNL-6（pΨneo）由华盛顿州西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的A.Dusty Miller善意提供(1)，并作为本研究中所有结构的基本向量。靶质粒pΨneo（A）和pΔΨneo-（D）含有新霉素磷酸转移酶(新)基因，允许选择带有G418的转染细胞。逆转录病毒载体表达核酶（pΨhygRbz）（B）或突变核酶（pΨhyg*Rbz新潮霉素磷酸转移酶基因(湿度计)-Rbz或湿度计-*Rbz构造。具体来说，1.1-kb巴姆HI片段包含湿度计该基因在pBluescript中的功能性或突变核酶基因上游亚克隆。这个湿度计-核酶片段插入Bcl公司我和Hin公司pLNL-6的dIII位点（B和C）。这在功能上破坏了Bcl公司我和巴姆LTR-潮霉素-LTR（LHL）载体中的HI位点。
防喷器的配对-新以LNL-6为靶点的核酶。核酶裂解位点新在pLNL-6序列中，转录物位于核苷酸2391和2392之间，约为转录起点下游的1800个核苷酸。由于pΨhygRbz载体中的核酶克隆位点被限制在湿度计编码区域新选择靶位点使其与信使帽位点的相对距离与核酶相同，以提高核酶对臂与二聚RNA中靶序列相互作用的概率。核酶具有不对称的碱基配对，在茎I中有6 bp，在茎III中有32 bp。长茎III有助于核酶和靶结合，而一旦发生裂解，短茎I有助于快速产物分解，并可能加速裂解RNA的最终降解(16). 为了控制核酶对反义活性，我们产生了一种突变的、非活性的抗-新并将其插入pΨhyg*Rbz中取代功能性核酶（图。C） ●●●●。
最初，我们希望确定核酶靶向是否会产生易于识别的表型。将核酶和靶向逆转录病毒载体转染和/或共转染到小鼠逆转录病毒PA317（ATCC）包装细胞系中，以利用体外增强病毒RNA二聚体的组成性病毒蛋白(8,9). PA317细胞系是NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞的衍生物，携带截短的小鼠逆转录病毒DNA（缺少Ψ元件、3′LTR和部分5′LTR）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）基因（均位于pBR322中）。为了确保包装表型的维持，用HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷）重新选择PA317细胞。将PA317细胞维持在补充有10%胎牛血清的Dulbecco修饰的最低必需培养基（DMEM）-高糖（Irvine Scientific）中。PA317细胞（105细胞）在转染前24小时被置于60-mm组织培养皿（Falcon）中，转染前5-6小时更换培养基。根据制造商关于Cell Phect（Pharmacia Biochem）的协议，通过使用以下质粒组合转染细胞：（i）pΨneo单独，（ii）pψneo加pΨhygRbz，和（iii）pΨ的neo加上pψhyg*Rbz（Rbz与目标载体的比率为2:1；总质粒DNA为9μg）。16小时后对细胞进行甘油休克。24小时后，在含有500μg G418（Mediatech）/ml和50μg潮霉素/ml的培养基中，在胰蛋白酶化、稀释和替换后开始选择。继续选择，直到出现完全隔离的菌落（3-5周）。三次转染的结果如图所示。在功能性核酶存在的情况下，稳定转染的G418-抗性菌落数量减少了约100倍，在残缺核酶存在下，相对于单独转染pΨneo后产生的菌落，稳定转导的G418抗性菌落数减少了2倍。这些结果与特定的核酶效应相一致。
核糖酶介导对培养的PA317细胞中G418-耐药转染体的抑制。柱显示了G418加潮霉素筛选后从三个单独实验中获得的转化菌落的平均数量；误差条表示数据范围。
为了验证G418抗性克隆的减少是核酶介导的新我们使用相同的结构进行了一项实验，但分别对G418和潮霉素耐药性进行了评分（图。). 为了检测共定位，将一个核酶和一个靶结构体共转染到上述所有四种组合的靶细胞中（ΔΨ结构体见下文）。转染后，将细胞等分，其中一半进行G418筛选，另一半进行潮霉素B（50μg/ml；Sigma）筛选。由于只有核酶和突变核酶结构携带湿度计基因，潮霉素抗性菌落的数量有助于使转染效率正常化。在所有情况下，无论转染中使用的载体组合如何，潮霉素抗性克隆的数量都是相似的（图。). 监测的G418-耐药菌落数量新目的载体的基因表达。正如在第一组实验中观察到的那样，功能性核酶严重抑制G418抗性菌落的形成，而突变核酶几乎没有作用。因此，二聚化的非特异性效应，如对翻译的干扰，不能完全导致G418耐药集落形成的减少；否则，与pΔΨneo-pΨhygRbz组合相比，pΨneo-pΨhycRbz中出现的潮霉素抗性菌落要少得多。同样，突变核酶转染中G418抗性菌落的适度减少也支持这一观点。
Ψ介导的核酶和靶RNA在PA317包装细胞中的共定位。每列显示在所指示的选择条件下获得的重复转染的平均菌落数；错误栏显示数据范围。
为了研究Ψ区在核酶靶向和功效中的作用，通过切割独特的Spe公司我和Bcl公司我在向量中定位，填充末端，并将末端连接在一起。我们将删除Ψ的构造称为pΔΨneo（图。D） ●●●●。
为了检测共定位，将一个核酶和一个靶结构以所有四种组合与单转染对照共同转染到PA317细胞中。该分析的前提是，如果体内Ψ依赖性共定位发生在细胞内，与与ΔΨ靶基因共转染相比，核酶载体与含Ψ靶蛋白共转染时形成的G418-抗性克隆更少，由于核酶活性通过与靶点的Ψ依赖性共定位而增强。对G418-和G418-以及潮霉素抗性菌落的数量进行评分（图。). 与pΨhyg*Rbz相比，当pΨneo靶点与pψhygRbz共转染时，获得的G418抗性克隆数量再次显著减少。最重要的是，在从目标载体（pΔΨneo-pΨhygRbz）中去除Ψ元素后，G418抗性菌落的急剧减少消失了。从靶标中去除Ψ序列不会影响获得的G418抗性稳定克隆的数量，表明Ψ序列本身的存在或缺失不会影响新基因表达（图。). 因此，菌落的形成不能归因于病毒传播或重叠感染。此外，无论共转染的靶点是什么，pΨhyg*RBZ和pψhygRBZ产生的潮霉素抗性菌落数量的变化始终小于两倍。单独选择潮霉素也是如此（图。)或使用潮霉素和G418选择（图。；比较pΨneo-pΨhyg*Rbz、pΔΨneo-pψhyg*Rbz和pΔψneo-pΨhycRbz）。我们从这些结果中得出结论，逆转录病毒RNA的Ψ-定向结合发生在病毒包被之前的细胞内。
Ψ介导的PA317包装细胞共定位核酶活性测定。在阴性对照组（无质粒）中，所有细胞在1周内死亡。每列显示在指定的选择条件下获得的重复转染的平均菌落数；错误栏显示数据范围。
体外逆转录病毒RNA的二聚体可以独立于核衣壳蛋白发生(14). 为了评估核衣壳蛋白在二聚化中的作用，通过核酶介导的灭活新在体内转录时，我们使用人293非包装细胞系重复了转染试验。该方案与PA317细胞使用的方案相同，只是细胞转染后6 h受到甘油休克。从这些转染实验中获得的结果表明，在没有病毒核衣壳蛋白的情况下，细胞内二聚化和随后的核酶靶向共定位可以发生，尽管效率低于它们的存在（图。A） ●●●●。293细胞转染的数据证实，Ψ元素的存在对该过程至关重要（图。B） ●●●●。
Ψ介导的RNA在293个非包装细胞中的共定位。每列显示在指定的选择条件下获得的重复转染的平均菌落数；错误栏显示数据范围。（A） 核糖酶特异性抑制靶基因表达；（B） Ψ依赖性抑制靶基因表达。
Sullenger和Cech(21)表达核酶的逆转录病毒载体RNA与Ψ链的共定位lacZ公司目标。他们的结果表明，将这两个RNAs共包装到病毒粒子中会导致lacZ公司转导90%，明显是核酶破坏靶RNA的功能。他们无法检测到核酶介导的细胞质中LacZ活性的降低，只有在病毒粒子包装和转导靶细胞后才能看到核酶的作用。他们的实验方法与我们的不同之处在于，他们的靶RNA是从稳定转化的细胞系中表达的，并且核酶编码病毒载体被转导到这些细胞中。相反，我们将两个DNA共同转染到相同的细胞中，从而使RNAs协调表达，并增加了来自两个载体的Ψ元素相互作用的可能性。此外，我们已经证明，pLNL6（pΨneo）和含有其他核酶的衍生物生成的转录物中有90%以上是未切割的，因此包含整个Ψ结构域，这优化了这些实验中的共定位机会(24).
逆转录病毒的Ψ元件因其固有的二聚化能力而需要用于生产功能性病毒。结合化学探测数据、相关病毒的序列分析和计算机折叠，预测了MoMuLV结构域的复杂二级结构(2,22)包含10个干环结构。基于预测的结构和进一步的体外数据，Girard等人(11,12)提出了导致二聚反应的Ψ畴间连续系列分子间相互作用的模型。首先，环1和环4以及环2和环5中互补序列之间的瞬时分子间配对促进了基因组RNA单体的弱结合。这种关联被认为会带来关键的C278-到G303干环并置，并在干环打开的位置诱导构象重排，通过内部自动补偿性序列5′-U促进环-环退火288AGCUA公司293-3′并形成更稳定的二聚体。对NCp10存在下Ψ介导的二聚体形成的动力学分析表明，该蛋白不会改变二聚过程中的步骤，而是通过破坏临界C的稳定性来降低退火步骤的能量屏障278-到G303干环(11,12).
在本研究中，我们观察到包装和非包装细胞系中Ψ介导的关联（通过Ψ依赖性核酶活性测定）。自堵住-包括NCp10在内的衍生蛋白在非包装品系中不存在，观察到的核酶活性反映了堵住-独立的Ψ相互作用。因此，我们的结果与上述模型中提出的二聚化第一步在体内存在的弱相互作用相一致。一种可能是这种相互作用发生在细胞核内，可能是暂时的，在细胞核到细胞质的转运之前促进核酶的分裂。第二种可能性（两者并非相互排斥）是，核酶-靶向结合发生在细胞质中，其方式既可以翻译抗性蛋白，也可以切割核酶。当然，Ψ结合本身似乎并不抑制翻译（因为潮霉素抗性不受任何结构物的影响，并且突变核酶对G418抗性的抑制作用很弱）。这与弱相互作用的存在是一致的，因为很难想象翻译可以通过完全稳定的二聚体结构有效进行。在病毒复制周期的后期，病毒基因组序列从翻译到包装的转变可能反映了从松散二聚体形成到紧密二聚体的转变(堵住-依赖）二聚体。
本文的结果表明，Ψ介导的核酶靶异二聚体可以非常有效地形成，并且这种异二聚可以独立于包装发生。所以，我们的Ψ-核酶系统可以作为检测体内二聚体和后续包装反应的关键成分和步骤的模型。由于所有已知的逆转录病毒都有二聚体结构域，这些分析可以在包括慢病毒在内的其他逆转录病毒上进行，并且可以用于开发抑制性反式-与正常二聚体竞争的作用序列。这些研究也可能被证明是研究其他细胞内RNA二聚体以及RNA-RNA退火反应的有用范例(三,10,17,20).
