DNA病毒的溶血性感染以时间调控的基因表达级联为特征，最终导致感染性病毒的释放。在特定检查站监测病毒生命周期的进展；从噬菌体到哺乳动物病毒，这些检查站的基本结构惊人地相似(33). 在EB病毒（EBV）的情况下，进入感染的裂解阶段是在ZEBRA和Rta的早期基因表达水平上调节的(4,10,31,45). 这些产物的转录在翻译抑制剂的存在下进行(2,44). 早期基因的表达受早期直接因素的影响(24)这两组病毒共同刺激病毒基因组的复制(2,7,8,44). 在这个检查点之后，结构蛋白被合成(5,21,32,35,43)在感染后期聚集成成熟病毒。病毒粒子包裹新复制的病毒基因组，然后释放出来引发新一轮感染。
虽然病毒基因组的裂解复制是感染性病毒产生的关键检查点，但这一事件释放晚期产物表达的机制尚未在任何病毒系统中阐明。然而，现有信息表明这两个过程之间存在复杂的关系。例如，在EBV感染中，必须为受感染细胞扩增病毒基因组，以支持后期产物的表达(24); 然而，转录模板本身不需要复制(36). EBV DNA复制作用于反式，可能引发一系列事件，最终导致特定的晚期启动子序列。通过使用EBV感染的人类B细胞的报告试验作为模型系统，我们已经确定了顺式将此调控途径作为了解复制和晚期基因表达之间联系的第一步。
我们之前已经在EBV感染的人类B细胞中证明，克隆的不同时间类别的病毒启动子保留了直接表达报告基因的病毒阶段特异性的能力(36). BcLF1晚期启动子BcLF1-氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达具有复制依赖性活性：报告基因的表达在病毒DNA聚合酶抑制剂磷酸化乙酸的作用下显著降低(32,43)（图。). 相反，与载体对照pCAT Basic相比，病毒基因组的扩增不会改变早期病毒启动子BMRF1 CAT的报告基因表达水平（图。). 这些克隆的启动子在感染细胞中对病毒基因表达的忠实再现为我们提供了一个实验上易于处理的模型来研究EBV晚期基因表达的调控。我们在BcLF1和BMRF1序列之间结合了缺失突变和杂交启动子构建（图。)阐明顺式本文报道了晚期基因表达调节剂。
EBV感染细胞系HH514-16中裂解启动子及其相应核心片段的活性。启动子片段的活性表示为HH514-16细胞中相对于BcLF1 CAT活性的平均CAT活性(30)如前所述，与ZEBRA联合转染(36). CAT活性标准化为共转染pGL2启动子质粒表达的荧光素酶活性(36). 数据表示至少两次单独转染的平均值，误差条表示平均值的标准误差。白条表示启动子片段在早期裂解周期（PAA[膦酸]/ZEBRA）期间的活性，而在晚期裂解周期（ZEBRA）期间的启动子活性显示为灰色。每个启动子片段的晚期活性与早期活性的比率（晚期指数）如下图所示。
启动子片段示意图。勾选条代表来自BcLF1晚期启动子的序列，而条纹条对应于来自BMRF1早期启动子的顺序。图表上方显示了相对于转录起始位点的编号，图的下部显示了核心启动子的扩展视图。
BMRF1和BcLF1启动子的缺失分析表明，它们不同的表达模式反映在不同的结构组织中。RNA聚合酶II转录的启动子由多个顺式-位于核心启动子和增强子两个区域的活性成分（有关综述，请参阅参考文献49). 核心启动子由两种基本DNA元素的存在或缺失来定义：TATA盒和启动子(41). 这些元素被认为协同作用，正确定位基础转录机制，以准确启动转录。转录增强剂被认为可以从远处增加这些位点的占有率，从而刺激基因表达（综述见参考文献49).
BMRF1早期启动子表现出经典的启动子结构(49)与基础核心元素（图。，比较BMRF1 CAT和BMRF1核心）(13,14,22,46). 相反，BcLF1晚期启动子代表了一个新的启动子类别，其中的调控完全通过具有独特TATA盒的核心启动子进行，与上游或下游序列无关。晚期BcLF1核心启动子外部序列的渐进性删除（即TATA盒上游和相对于转录起始位点+6的下游）对该系统中报告基因表达的复制依赖性或幅度没有影响（图。). 事实上，来自跨越BcLF1晚期启动子的−30到+6的36-bp启动子的表达，即BcLF 1核心（图。)，表现出比全长启动子更大的复制依赖性（图。，将BcLF1 CAT与BcLFI核心进行比较）。BcLF1启动子的一个固有特性是通过核心区域直接表达晚期的强时间表达，因为早期启动子的类似区域BMRF1核心不支持这种模式（图。，将BcLF1堆芯与BMRF1堆芯进行比较）。此外，早期核心启动子和晚期核心启动子之间的这种功能差异表明，DNA复制通过序列依赖机制刺激基因表达，而不是通过引起基础转录机制的全球作用变化。
利用晚期和早期启动子核心序列之间的功能差异来表征顺式-进一步，我们构建了一系列杂交早期和晚期核心启动子（表和图。，底部），并分析了它们在EBV感染的人类B细胞中直接表达CAT的复制依赖性表达的能力。核心启动子在−9处相对于转录起始位点的两半定位了复制依赖性顺式-活性位点位于晚期核心启动子的5′端，介于−30和−10之间，这表明启动子元素对于晚期基因表达既不必要也不充分（图。和，比较cM和Mc）。将BMRF1早期基因TATA盒替换为cM（图。，底部）消除了该启动子的复制依赖性活性（图。，比较cM和McM）。反过来，将BcLF1晚期基因TATA盒导入Mc（图。，底部）增加了该启动子的复制依赖性，尽管水平有所降低（图。，将Mc与cMc进行比较）。BcLF1启动子−25和−10之间的序列恢复了该杂交启动子的全水平活性（图。，比较cMcII和cMcIII与cMc），但该区域在存在早期基因TATA盒的情况下没有改变表达（图。，将BMRF1核心与McM、McMII和McMIII进行比较）。
表1
| 构造 | 序列一 |
|---|
| 厘米最小值 | AACTGCAG公司纹身CCGGTGGCAGCTCCT GGCAGT公司C类ATTCATAGAGC公司 |
| Mmin（米） | AACTGCAG公司CATAAAT公司TCTCCTGCCTGCCTCTCTCTGCTCTGGT公司A类CGTTGTCTAGAC公司 |
| 麦克 | AACTGCAG公司CATAAAT公司TCTCCTGCCTGCCTCTCCCCTGGCAGT公司C类ATTCATAGAGC公司 |
| cMc公司 | AACTGCA公司GTATTAA公司TC TCCTGCCTGCCCCTGGCAGT公司C类ATTCATGAGC公司 |
| cMcII公司 | AACTGCAG公司TATTAAA公司TCTCCTGGCAGCTCCTGGCAGT公司C类ATTCATGAGC公司 |
| cMcIII型 | AACTGCAG公司TATTAAA公司CCGGGTGCCTGCCCCTGGCAGTC类ATTCATGAGC公司 |
| 厘米 | AACTGCAG公司TATTAAA公司CCGGTGGCAGCTCTGCTCTGGTA类CGTTCTCTAGAGC公司 |
| 麦克 | AACTGCAG公司CATAAAT公司CCGGTGGCAGCTCTGCTCTGGTA类CGTTGTCTAGAGC公司 |
| McMII公司 | AACTGCAG公司CATAAAT公司CCGGGTGCCTGCCTCTGCTCTGGTA类CGTTGCTAGAGC公司 |
| McMIII公司 | AACTGCAG公司CATAAA公司TTCTCCTGGCAGCTTCTCTGGT公司A类CGTTGTCTAGAC公司 |
| cmin（T→A） | AACTGCAG公司TATAAAA公司CCGGGGCAGCTCCTGGCAGT公司C类ATTCATAGAGC公司 |
| McFull II型b条 | AACTGCAGGGATCCAGGAGCGTT公司 |
| GAGGCGCAGGAGATTTATAATTCT公司 |
| TCTCCTGCCTGCCTCTGCTCTCTGGTATTCGGATAAC公司 |
| GCTCTAGAGAATGACTGCCAGGAGCTGCCACCGGTTATACAGAAA |
EBV感染细胞系HH514-16中杂交核心启动子片段的活性。图的图例中描述了阴影。数据表示至少两次单独转染的平均值。PAA，膦基乙酸。
尽管早期和晚期启动子TATA序列之间存在功能差异，但两者都能在体外与纯化的TATA结合蛋白（TBP）结合（数据未显示）。令人惊讶的是，具有晚期活性的核心启动子在早期或晚期与病毒感染细胞的核提取物孵育时产生了相同的电泳迁移率变化模式（数据未显示）。因此，EBV感染中的晚期基因表达是通过基础转录元件TATA盒介导的，而没有明显募集额外的DNA结合因子，这是其他病毒系统中提出的机制(27).
早期BMRF1 TATA盒序列（CATAAAT）与晚期BcLF1 TATA盒子序列（TATAAA）的比较(1)牵涉到三个潜在的监管职位。已知EBV晚期启动子的18个TATA盒序列中，共有13个（72%）在第四位含有T，而在任何潜伏或早期EBV TATA盒中均未观察到这种变异(1). 通过比较，卡波西肉瘤相关疱疹病毒（一种相关的γ-疱疹病毒）中EBV晚期基因的几个同源物的启动子在TATA盒的第四位含有一个T(34)，真核生物数据库中30%的启动子中也存在这种变异(三). 将该T突变为A，恢复一致的TATA盒序列(20,29,48)对于晚期的BcLF1核心启动子，取消了复制依赖性活性（图。，将BcLF1堆芯与BcLF堆芯进行比较[T→A]）。虽然该启动子的活性极低，但其表达量可重复地高于载体控制和TATA盒（TGTTAA）第二位置的A-to-G突变所获得的表达量，该突变破坏TBP结合（48，数据未显示）。这些数据强烈暗示了替代TATA盒序列（TATAAA）在EBV感染的人类B细胞中病毒基因表达的晚期时间调控中的作用。
对这些观察结果的一个明显解释是，在裂解病毒DNA复制之前，通过独特的TATA盒对晚期启动子活性进行积极抑制。为了解决这种可能性，我们构建了一个连接BMRF1早期增强子区域的杂交启动子(13,14,22,46)到BcLF1晚期核心启动子（Mc Full II，图。). 作为早期启动子的特征，该启动子在病毒基因组裂解复制前后将报告基因表达导向到几乎相同的水平（图。). 这些活性的比率几乎与野生型BMRF1早期启动子的比率相同（图。，比较BMRF1 CAT和Mc Full II）。因此，晚期TATA盒序列能够支持上游增强子元件的表达，实现其作为基础转录元件的良好记录作用(49). 然而，在缺乏上游增强子的情况下，晚期TATA盒序列在时间调节中发挥作用，指导复制依赖性基因的表达（图。). 这些观察结果与正常情况下BcLF1核心启动子的活性一致：病毒基因组中BcLF 1核心启动程序的5′区域在转移到异源核心启动子时没有赋予活性，并且移除该区域不会改变其自身启动子的表达（图。).
BcLF1核心启动子与BMRF1增强子融合的效果。参见图。获取构造的描述。图的图例中描述了阴影。数据表示至少两次单独转染的平均值。PAA，膦基乙酸。
TATA盒被经典地视为基因表达时间调控中的静态元件。虽然大多数启动子的活性都绝对需要这个元素，但表达模式通常由核心启动子以外的特定调控因子决定(19,28). 然而，最近，一般转录因子，如替代TBP或TBP相关因子，已直接与时间或细胞类型特异性表达有关(6,12,37)尽管这些因子作用于特定启动子的机制尚未阐明。其他研究暗示了增强子TATA序列串扰的重要性(25,39,40,47,48)但在这些情况下，主要的调控始终是启动子特异性增强子而不是基础元件。在这里，我们描述了一个系统，在这个系统中，一个交替的TATA序列本身指导时间表达，而时间表达被附近的顺式-活动序列。
我们的发现表明EBV基因组中至少存在两种不同的启动子结构。BMRF1早期启动子通过核心启动子外的序列指导表达（图。) (13,14,22,46). 相反，BcLF1晚期启动子的时间表达仅依赖于变异TATA元件及其与核心启动子内侧翼序列的相互作用（图。). 虽然早期增强子和晚期核心启动子都是自主调控单位，但它们的结合形成了一个异源系统（图。)导致观察到早期增强子占主导地位，而不是混合表达模式。这种复杂的相互作用表明，EBV基因组扩增前后活跃的调控机制是独特的，并强调了研究基础表达和增强子对观察到的表达模式的贡献的重要性。
将这些结果与已完成的有关单纯疱疹病毒（HSV）晚期基因表达的大量工作进行比较，可以发现EBV具有显著的相似性和独特的适应性。例如，EBV和HSV（γ2)依赖于裂解性DNA复制，但要求顺式用于HSV(18,26,38,48)和中反式用于EBV(36). A类顺式HSV和EBV中晚期基因表达的调节器发生在核心启动子附近(9,11,15,16,18,23). 在HSV和EBV中，早期最小启动子不能在功能上替代晚期最小启动子（图。) (15)但晚期最小启动子可以支持早期增强子的复制无关表达（图。) (15). 虽然这两种病毒都以晚期核心启动子附近的调控元件为靶点，但具体靶点是独特的。HSV晚期基因表达需要转录起始位点附近的特定序列(9,11,15,16,18,23)但与EBV相比，HSV中早期和晚期基因的TATA盒是可互换的(17,42). 的标识顺式HSV和EBV中晚期基因表达的调节器是最终理解与裂解DNA复制的复杂联系的重要初始步骤，但要完全理解需要鉴定反式与这些元素相互作用的基础或启动子特异性因子。本文的工作为详细了解EBV晚期基因表达调控的机制奠定了基础。
