柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种重要的人类病原体，属于小RNA病毒。该病毒与其他肠道病毒一起参与了至少50%的急性心肌炎病例和大约25%的扩张型心肌病病例(2,8). 尽管积累了大量的分子数据，并且观察到常用的疫苗接种程序适用于小鼠模型(4)到目前为止，还没有针对柯萨奇病毒诱导的心脏病的病毒特异性预防或治疗程序。DNA或重组痘苗病毒（rec.VV）免疫为建立新的预防CVB3致命感染的程序提供了机会。在本研究中，我们表明DNA疫苗可以保护小鼠免受CVB3诱导的疾病，并且与DNA或rec免疫的比较表明，诱导保护的效率取决于（i）使用的疫苗类型和（ii）表达的CVB3蛋白。
VP1是CVB3的主要衣壳蛋白，该蛋白中有几个B细胞和T细胞表位(6). 因此，从亲本载体pCMV-β（加利福尼亚州帕洛阿尔托市Clontech）中去除报告基因β-半乳糖苷酶后，通过PCR从CVB3 cDNA中扩增VP1（851 bp）的特异编码序列(11)克隆到质粒pCMV中，命名为pCMV/VP1。为了分析额外免疫原表位可能增加体内免疫反应的可能性，我们构建了质粒pCMV/VP4-2、pCMV/VPN-1和pCMV/VP4-1，编码CVB3所有衣壳蛋白的重叠序列（图。A） ：VP4和VP2（995 bp），VP3和VP1（1556 bp），以及VP4到VP1（2561 bp）。通过瞬时转染HeLa细胞证实了这些质粒在体外的表达。在RNA分离、DNA酶消化和逆转录酶反应后，所有质粒的转录活性均通过PCR得到确认（图。B、 转录）。此外，通过蛋白质印迹证实了pCMV/VP1转染的HeLa细胞中VP1的翻译（图。B、 翻译）。蛋白VP4到VP1、VP3和VP1，以及VP4和VP2在正常病毒感染过程中被加工成单个蛋白，并且不被多克隆抗血清识别；因此，我们无法确认这些质粒的蛋白表达。
组织培养中质粒编码RNA的表达。（A） 亲本载体的β-半乳糖苷酶基因被CVB3衣壳蛋白VP1（851 bp）、VP3和VP1（1565 bp）、VPN4和VP2（995 bp）以及VP4到VP1（2561 bp）的特异序列所取代。（B） 通过瞬时转染HeLa细胞，然后进行RNA分离、DNA酶处理、cDNA合成和使用原始引物对进行PCR，分析质粒pCMV/VP1、pCMV/VPN3-1、pCMV/VP4-2和pCMV/VP4-1的转录活性。在pCMV转染的培养物中未检测到PCR产物，表明PCR条件的特异性。此外，通过Western blot分析分析pCMV/VP1转染HeLa细胞的蛋白提取物中是否存在VP1。
在体外分析DNA疫苗的表达后，BALB/c小鼠分别在每个股四头肌肌肉内（i.m.）接种两次100μg质粒DNA，间隔4周。一组小鼠未经治疗。免疫前获得的所有血清CVB3抗体均为阴性（数据未显示）。每次注射后四周，通过Western blotting和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析血清中是否存在CVB3特异性抗体（图。和表). 首次质粒接种四周后，Western blot分析未检测到病毒特异性抗体（图。A） ●●●●。然而，第二次免疫后4周，pCMV/VP1-（第2至6道）和pCMV/VP4-2（第12至16道）免疫小鼠血清中存在的抗体能够将病毒特异性蛋白与CVB3衣壳蛋白VP1或VP2（第1道）的分子量结合（图。B） ●●●●。使用该方法，在用pCMV/VP3-1（泳道7至11）或pCMV/VP4-1（泳道17至21）处理的小鼠的血清中检测不到或仅检测到极少数病毒特异性抗体。此外，还使用纯化的CVB3作为靶抗原，通过ELISA评估抗CVB3免疫球蛋白M（IgM）或IgG特异性抗体的水平。pCMV注射小鼠作为阴性对照。与对照小鼠的抗体浓度相比，所有免疫小鼠的血清中均未检测到IgM滴度的增加（表). 这一结果可能反映了所采用的相对较晚的时间点，此时IgM反应可能已经转化为IgG抗体的产生。然而，此前已有研究表明，通过使用巨细胞病毒启动子系统表达流感病毒血凝素糖蛋白，i.m.给药质粒DNA只在小鼠中诱导低到检测不到的IgM滴度的ELISA活性(5). 相反，在第二次DNA接种后，可检测到IgG抗体水平，特别是在接种pCMV/VP1和pCMV/VP4-2构建物的小鼠血清中。该结果证实了通过Western blot分析获得的数据，表明出现了适度的增加（表). 与急性病毒感染期间诱导的抗体滴度相比，我们的DNA疫苗在第二次免疫后提高的IgG特异性抗体水平较低，但在分别接种流感病毒或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒DNA疫苗的小鼠血清中也发现了低水平的IgG特异性抗体或总抗体(5,15,16). 这些结果可能是因为以下事实：（i）DNA疫苗编码的蛋白质可能无法有效处理，（ii）使用DNA疫苗时，病毒蛋白的表达通常是非细胞病变的，并且病毒蛋白不会从转染细胞中释放出来，或（iii）CVB3是一种细胞质病毒，细胞核中CVB3特异性RNA序列的表达使其暴露于异常的转录和转录后途径，这可能是转染靶细胞中蛋白质浓度低的原因。
检测DNA疫苗诱导的CVB3特异性抗体水平。BALB/c小鼠每隔28天一次静脉注射质粒DNA两次。每次注射4周后，获取血清并通过Western blot分析检测是否存在CVB3特异性抗体。（A） 首次免疫后，未检测到病毒特异性抗体。（B） 第二次免疫后，pCMV/VP1（泳道2-6）和pCMV/VP4-2（泳道12-16）免疫小鼠血清中存在的抗体能够结合与CVB3的衣壳蛋白VP1或VP2具有相同分子量的病毒特异性蛋白（泳道1，作为阳性对照）。在pCMV/VP3-1（第7至11道）和pCMV/VP4-1（第17至21道）治疗小鼠的样本中，仅存在少量或无病毒特异性抗体。血清稀释度为1:25。结果代表了三个不同的实验。
表1
ELISA检测DNA疫苗诱导的CVB3特异性抗体水平一
| 质粒DNA | 1:25（OD）稀释490)
| 稀释1:50（OD490)
|
|---|
| 免疫1 | 免疫接种2 | 免疫1 | 免疫接种2 |
|---|
| IgM特异性抗体 |
| pCMV病毒 | 0.25 ± 0.04 | 0.30 ± 0.06 | 0.18 ± 0.01 | 0.24 ± 0.04 |
| pCMV/VP1型 | 0.29 ± 0.08 | 0.26 ± 0.04 | 0.24±0.06 | 0.21 ± 0.04 |
| pCMV/VP3-1型 | 0.22 ± 0.03 | 0.32 ± 0.08 | 0.20 ± 0.04 | 0.26 ± 0.05 |
| pCMV/VP4-2型 | 0.22 ± 0.06 | 0.36 ± 0.07 | 0.18 ± 0.06 | 0.29 ± 0.05 |
| pCMV/VP4-1型 | 0.19 ± 0.04 | 0.39 ± 0.13 | 0.16 ± 0.02 | 0.31 ± 0.09 |
| IgG特异性抗体 |
| pCMV病毒 | 0.17 ± 0.02 | 0.17 ± 0.04b条 | 0.15 ± 0.02 | 0.15±0.03 |
| pCMV/VP1型 | 0.19 ± 0.03 | 0.30 ± 0.08 | 0.15 ± 0.01 | 0.21 ± 0.05 |
| pCMV/VP3-1型 | 0.16 ± 0.01 | 0.22 ± 0.04 | 0.14 ± 0.01 | 0.18 ± 0.03 |
| pCMV/VP4-2型 | 0.17 ± 0.02 | 0.33 ± 0.13 | 0.14 ± 0.01 | 0.25 ± 0.07 |
| pCMV/VP4-1型 | 0.15 ± 0.01 | 0.27 ± 0.07 | 0.13 ± 0.01 | 0.21 ± 0.03 |
第二次疫苗接种四周后，用CVB3（Nancy）的正常致死剂量进行腹腔（i.p.）攻击，CVB3是一种从J.F.Woodruff获得并由S.a.Huber分离的CVB3原始库存的心脏致病菌株（命名为H3）。如前所述，病毒被繁殖和纯化(7). 激发后，对存活动物的数量进行监测，直至感染后28天（p.i.）。在此时间点之后，未发现死亡率过高。如图所示。，我们研究中最有效的疫苗是pCMV/VP1构建物，对72.2%的小鼠（18只中的13只）具有保护作用。i.m.接种质粒pCMV/VP4-1、pCMV/VP3-1和pCMV/VP4-2的效果较差，诱导的不完全保护率介于30.8%（pCMV/VP4-2的13个中有4个）、23.1%（pCMV/VP4-1的13个中有3个）和14.3%（pCMV-VP3-1的14个中有2个）之间。由于VP1在pCMV/VP3-1和pCMV/VP4-1中表达为融合蛋白，因此对该分子的免疫反应可能无法识别天然VP1分子。类似的论点可能适用于pCMV/VP4-2构建体的失败，因为之前的工作(1)表明VP2含有重要的表位。VP2、VP3和VP4作为单一蛋白的表达应该澄清这个问题。然而，低水平的抗CVB3特异性抗体不太可能解释给药pCMV/VP1构建物所诱导的良好保护作用。除抗体外，其他免疫反应可能在pCMV/VP1诱导的保护中发挥作用。因此，目前正在研究接种疫苗小鼠的细胞免疫反应。
对DNA疫苗诱导的通常致命的CVB3攻击的保护。用编码CVB3 VP1、VP4和VP2、VP3和VP1或通过VP1编码VP4的质粒DNA两次注射免疫BALB/c小鼠；注射两次控制质粒pCMV；或单独使用PBS。第二次接种4周后，用5 LD攻击小鼠50CVB3 i.p.存活动物的百分比显示了28天的时间。结果总结了三个独立实验的数据，每组至少使用三到四只小鼠。
为了分析第二次免疫程序，使用rec.VV，将VP1的PCR-衍生的亚基因组CVB3片段克隆到斯图我-Spe公司转移质粒pSC的I位点11(三). 在与野生型病毒同源重组后，使用标准方法分离rec.VV VV-VP1(12,14). 通过Western blotting分析VP1的蛋白表达（图。). 当用针对CVB3 VP1蛋白的小鼠抗血清进行探测时，CVB3和VV-VP1感染的HeLa细胞提取物（1和3道）中很容易检测到CVB3的VP1特异性蛋白带。表达载体衍生β-半乳糖苷酶（VVSC）的亲代VV感染的细胞裂解液中未检测到病毒特异性条带11)仅限（2号车道）。
来自rec.VV的柯萨奇病毒蛋白VP1的表达。蛋白质VP1的Western blot检测。电泳后，含有30μg CVB3感染（1区）、VVSC蛋白的样品11-感染的HeLa细胞（第2道）和VV-VP1感染的HeLa细胞（第3道）在硝化纤维素膜上被印迹。使用一种初级抗体（稀释1:2500）检测VP1蛋白。使用预处理蛋白标记作为尺寸标准（车道M）。
BALB/c小鼠腹腔接种107VV-VP1的PFU。接种疫苗4周后，用纯化的CVB3作为靶抗原，通过ELISA分析血清中是否存在抗CVB3抗体。VVSC（VVSC）11-感染和未感染小鼠作为阴性对照。仅在接种VV-VP1的小鼠血清中存在少量可检测的IgG特异性抗体浓度，类似于其他一些使用rec.VV表达外源蛋白的组的发现(9,10). 出血后，用5 50%致死剂量（LD）攻击小鼠50)对CVB3和存活动物的数量进行了为期28天的监测。在此时间点之后，未发现任何额外的死亡率。如表所示与pCMV/VP1诱导的保护作用相比，接种VV-VP1对BALB/c小鼠无效。使用VV-VP1，只有5.6%（1/18）的小鼠在致命的CVB3攻击中存活。然而，VV-VP1-v疫苗接种小鼠的死亡时间有所延迟，其死亡时间为21天，而所有对照组的小鼠在7天后死亡。相反，在VV-VP1免疫研究中使用C57BL/6小鼠，我们能够诱导高达50%的保护（数据未显示）。与DNA疫苗的VP1表达相比，rec.VV表达的VP1在BALB/c小鼠中诱导保护性免疫应答方面无效，这一问题仍然存在。对此结果的一个可能解释是，一些小鼠菌株，如VV-VP1研究中的BALB/c小鼠，在将rec.VV用于免疫研究时可能是无应答的，Schirmbeck等人(13). 他们发现，DNA疫苗接种能够诱导对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫反应，而当rec.VV被用作表达载体时，这些小鼠是无反应的。
表2
pCMV/VP1或VV-VP1诱导的对正常致死CVB3攻击的保护效率
| Exptl组一接种疫苗 | 接种疫苗后的IgG抗体水平b条（ELISA、OD490) | %CVB3挑战后在指定日期p.i的存活率。c（c）
|
|---|
| 7 | 28 |
|---|
| pCMV病毒 | 0.17 ± 0.04 | 0 | 0 |
| pCMV/VP1型 | 0.30 ± 0.08 | 72.2 | 72.2 |
| VVSC公司11 | 0.14 ± 0.02 | 0 | 0 |
| VV-VP1型 | 0.21 ± 0.02 | 28.6 | 5.6 |
| 未接种疫苗 | 0.12 ± 0.02 | 0 | 0 |
此外，用苏木精-伊红或天狼星红对小鼠心脏组织45天的石蜡切片进行染色，并在显微镜下分析持续的炎症或纤维化。感染1 LD的未免疫存活BALB/c小鼠的心脏组织50CVB3的组织病理学改变可检测到。纤维组织的存在证明了这一点（图。E和F），表明在感染期间早期的组织破坏。使用质粒或rec.VV-疫苗接种小鼠的心脏组织，我们在存活动物的心肌中未检测到任何疾病，这表明CVB3不能在受保护动物中引起组织破坏、炎症或纤维化（图。A到D）。进一步的实验将集中于激发后接种小鼠心脏组织中病毒载量的特征，以及两种免疫程序在引起保护方面的差异特征。
CVB3激发后pCMV/VP1-和VV-VP1-v接种小鼠心肌组织的组织学。接种pCMV/VP1（A和B）和VV-VP1（C和D）疫苗和非免疫（E和F）BALB/C小鼠心脏组织石蜡切片，用5 LD激发45天后50免疫小鼠的CVB3和1 LD50用苏木精-伊红（A、C和E）或天狼星红（B、D和F）对未免疫小鼠的CVB3进行染色；结缔组织被染成红色。在免疫小鼠中未检测到浸润免疫细胞或异常高水平的结缔组织，表明正在发生心肌炎或纤维化。相反，来自非免疫小鼠的心脏样品中存在纤维组织，表明以前的病毒感染组织被破坏（E和F，箭头）。放大倍数，×125。
