爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）已被证明在地方性Burkitt淋巴瘤中起到致病作用(35)和鼻咽癌(20)EBV基因组已在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤中得到鉴定(10——12,27,32,33). 虽然EBV相关胃癌（EBVaGC）的比例在6%到16%之间(9,14,28,31)据报道，EBVaGC已在全球范围内出现。EBV与EBVaGC的发生密切相关(9). EBV编码的小RNA几乎存在于所有粘膜内期癌细胞中，EBVaGC中的EBV通过Southern blot杂交分析与EBV DNA独特末端重复序列相邻的探针是单克隆的。此外，EBVaGC具有独特的形态学、遗传学和表型特征。EBVaGC常伴有淋巴细胞密集浸润(27). EBVaGC的遗传途径与EBV阴性胃癌的遗传途径有很大不同[EBV（−）GC](8). CD44是一种作为粘附分子的细胞表面糖蛋白，其变体形式在EBVaGC中特异性表达(7).
体外细胞培养和保留原肿瘤特征的肿瘤细胞体内移植是探索特定肿瘤的细胞生物学和分子生物学不可或缺的工具。在鼻咽癌中，肿瘤移植到裸鼠（15、17、18）中已用于此目的(4)，因为尚未建立在细胞核中携带EBV基因组的稳定细胞系。在胃癌中，尽管最近的一份报告显示人类胃癌细胞成功感染了EBV(34)，该模型可能无法反映EBVaGC的自然条件。因此，为了建立研究这种独特类型胃腺癌的模型系统，我们将EBVaGC组织植入严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内，而不是建立细胞系。
EBVaGC移植到SCID小鼠体内。为了在手术前识别EBVaGC病例，从1994年至1995年，通过EBV-编码小RNA的原位杂交（ISH）对东京都会Komagome医院获得的胃癌活检标本进行了检查，如前所述。在用EBVaGC治疗患者的胃切除后，从肿瘤中无菌获取新鲜组织。所有患者术前均未接受化疗。手术前始终获得知情同意。
将几块肿瘤组织冷冻在干冰-己烷中，并储存在−80°C下，直到用于DNA和RNA分析。然后用含有消毒剂的无菌生理盐水溶液清洗肿瘤组织，将其切成约5 mm的碎片三，并将其皮下接种到3只5至10周龄SCID小鼠的背部（日本东京Clea Japan）。在三个植入试验中的一个试验中，植入SCID小鼠的EBVaGC组织在12周内生长成皮下肿瘤。否则，植入被认为是不成功的，因为植入后3个月内未观察到肿瘤形成。SCID肿瘤被指定为KT，排在患者之后。在SCID小鼠体内成功生长KT肿瘤12代。在第一代中，KT肿瘤细胞的大小在8.2天内增加了一倍。
组织病理学。KT的原始EBVaGC是一个9.0×7.5厘米的癌，位于一名58岁日本女性的胃体前壁。这是一个溃疡性病变，由一个隆起的壁清楚地分隔开来，癌细胞浸润到浆膜下。组织学上，肿瘤是一种低分化腺癌，有坚固的巢，并伴有间质中的淋巴浸润（图。a） ●●●●。在肿瘤的一小部分中，巢穴由癌细胞组成，细胞质中有显著的粘液，淋巴浸润很小。SCID小鼠（第2代、第4代和第10代）的肿瘤组织学反映了原始肿瘤的组织学，但有一些显著差异。首先，产生粘蛋白细胞的区域增加到占肿瘤的一半。第二，具有实巢的低分化腺癌区域是原发肿瘤的主要部分，不伴有淋巴浸润（图。b） ●●●●。
人EBV-相关胃癌（EBVaGC）移植到SCID小鼠的形态学评估。（a） 最初的EBVaGC是一种低分化腺癌，有实巢和淋巴浸润。（b） SCID小鼠中的移植瘤，即KT肿瘤，缺乏淋巴浸润，并且一半的肿瘤由产生粘液的细胞组成，这是原始肿瘤的次要成分。与原发肿瘤一样，KT肿瘤在细胞质（c）中显示细胞角蛋白免疫反应性，但当细胞角蛋白抗体被小鼠免疫球蛋白（d）取代时，没有阳性染色。KT肿瘤也在EBER1 ISH（e）的细胞核中显示阳性信号，但当反义寡聚探针替换为感测探针（f）时没有信号。放大倍率，×80。
证实SCID肿瘤来源于人类上皮恶性肿瘤。
除组织学和粘蛋白生成外，免疫组化显示肿瘤具有上皮性；几乎所有KT肿瘤的肿瘤细胞都被抗细胞角蛋白单克隆抗体阳性染色（图。c） ●●●●。
为了进一步证实肿瘤来源于人体组织铝序列被用作Southern blot分析的探针(18,29). 使用十二烷基硫酸钠从原始和SCID肿瘤（第2、4和10代）中提取高分子量DNA。5微克DNA被切割巴姆HI并在0.5%琼脂糖凝胶上电泳，DNA片段转移到尼龙膜上（Nytran；Schleicher&Schuell，Keene，N.H.）。在65°C下杂交48小时，以32P标记DNA探针，然后在2×SSC（1×SSC为0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）-0.1%十二烷基硫酸钠中在室温下清洗两次。通过放射自显影术观察带型。探针，铝（东京都市医学科学研究所M.Miyaki赠送的礼物），标有[32P] dCTP采用随机引物标记方法（Prime-a-Gene标记系统；Promega，Madison，Wis.），并通过Nuctrap推柱（Stratagene，La Jolla，Calif.）纯化。因此，通过Southern blot分析发现，从原始肿瘤和KT肿瘤中制备的DNA含有大量人类重复序列铝序列，而来自小鼠组织的DNA没有（图。a） ●●●●。这一结果证实了KT肿瘤来源于人体组织。
SCID小鼠人EBVaGC的Southern杂交分析。（a） 何时巴姆对HI消化的DNA进行Southern blot杂交分析，原始和移植的（KT）肿瘤均显示人类的重复带铝顺序。（b） 与生态RII和Xho公司在原始EBVaGC和KT肿瘤中观察到EBV DNA的I片段，一条大小相同的单一条带。车道1，原始EBVaGC；车道2；KT肿瘤；第三道，老鼠肾。
用Southern blot分析评价EBV在肿瘤组织中的克隆性巴姆用探针探测HI消化的DNA生态RII或Xho公司I片段分别代表EBV基因组左端或右端的独特序列（图。b） ●●●●。在原始肿瘤和KT肿瘤中均显示相同大小的EBV末端重复序列的单个片段。此外，原始肿瘤和KT肿瘤中的片段与左侧和右侧探针相同，表明EBV在两种肿瘤中都以附加体形式存在。因此，这些事实表明，在相同条件下，KT肿瘤与原始肿瘤保留相同的EBV，即单克隆和上位形式，并且KT肿瘤中的EBV不包含复制期EBV的线性形式。
BZLF1基因表达缺失。由于早期BZLF1蛋白通过早期EBV基因的反式激活破坏病毒潜伏时间，因此通过评估BZLF1蛋白的表达来评估EBV潜伏时间的严格性。
如前所述，采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取法从原始肿瘤和KT肿瘤（第10代）中提取总RNA(6). 生成cDNA，1μl寡核苷酸（dT）12–18将（500μg/ml）和12μl无菌蒸馏水添加到2μg总RNA中，然后将混合物在70°C下加热10分钟，并在冰上快速冷冻。将试剂添加到混合物中，得到最终浓度为50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、75 mM氯化钾、3 mM氯化镁、10 mM二硫苏糖醇和0.5 mM每个脱氧核苷三磷酸盐，并在42°C下培养混合物2分钟。添加200 U SUPERSCRIPT II（Gibco BRL，Gaithersburg，Md.）后，将混合物在42°C下培养50分钟，然后在70°C下加热15分钟以停止反应。表中给出了用于检测EBV转录物的引物和探针的序列和基因组坐标的详细信息用5′-CCTTCTGGGCATGGAGTCCT-3′正义引物、5′-GGAGCAATGATCTCTTC-3′反义引物和探针（CTGTGTGCACAGGTCTTGCGGTT）对β-actin mRNA进行35次扩增，以检查RNA制备的质量(5). PCR混合物由1.25 U Ampli组成塔克Gold（Perkin-Elmer，Foster City，Calif.）、20 mM Tris-HCl（pH 8.4）、50 mM氯化钾、1.5 mM氯化镁、0.01%明胶、200μM脱氧核苷三磷酸、0.5μM引物和合成cDNA，总体积为50μl。在95°C下加热9分钟后，使用480型热循环器（Perkin-Elmer）进行40次放大循环；热循环曲线为94°C下1 min，55°C下2 min，72°C下3 min，在72°C额外加热10 min。然后在3%琼脂糖凝胶中分离5微升每种PCR产物，用溴化乙锭染色，并在紫外线透射器下拍照。然后将产品进行Southern印迹转移到硝化纤维素膜上（Protran；Schleicher&Schuell，Dassel，德国）。过滤器与32P端标记探针。病毒转录物的放射自显影暴露时间为4至24小时，β-actin mRNA的暴露时间为3小时。
表1
用于RT-PCR和Southern杂交的引物和探针序列
| 成绩单 | 产品规模（bp） | 底漆的顺序（5′-3′）和类型 |
|---|
| 欧洲银行业协会1一 | 273 | GATGAGTGTTGGGAGAGCTGATTCTGCA公司（感官） |
| | TCCTCGTCCATGGTTATCAC公司（反义） |
| | AGACCTGGGAGATTCAC公司（探头） |
| 欧洲银行业协会2一 | 339 | GCTGCTACGCATTAGAGACC公司（感官） |
| | TCCTGGTAGGATGATCGAGG公司（反义） |
| | CAGCACTGGCGTGTGACGTGGTAAAGTT公司（探头） |
| Qp已启动一 | 339 | AGGCGCGGGAGAGCGCGCTACCGGA公司（感觉） |
| | TCCTCGTCCATGGTTATCAC公司（反义） |
| | 无意识的（探头） |
| Cp已启动一 | 297 | CACTACAAGACCTACGCCTCTCCCATC公司（感官） |
| | TCTCCCTAGGCCCTGAAGGTGACCGCTT公司（反义） |
| | GCGACCGGTGCTTCTTAGGAGCTGTCCGA公司（探头） |
| Wp已启动一 | 235 | TCAGAGCGCGAGTCACAAAT公司（感官） |
| | TCTCCCTAGGCCCTGAAGGTGACCGCTT公司（反义） |
| | GCGACCGGTGCTTCTTAGGAGCTGTCCGA公司（探头） |
| LMP1系列一 | 490 | TCCTCCTCTTGGCGCTACTG公司（感官） |
| | TCATCACTGTTGTCGTTGTCC公司（反义） |
| | GAAAGCACAATTCCAAAGGAACAATCTG公司（探头） |
| LMP2A公司b条 | 280 | ATACTCATCTCAACACATA公司（感官） |
| | CATGTTAGGCAATATTGCAAA公司（反义） |
| | ATCCAGTATGCCTCTGTA（探头） |
| LMP2B型b条 | 325 | CAGTGTATACTGCACAAAGA公司（感官） |
| | CATGTTAGGCAATATTGCAAA公司（反义） |
| | ATCCAGTATGCCTGCCTGTA（探头） |
| BZLF1型一 | 453 | 猫（感官） |
| | GCGCAGCCTGTCATTTTCAGATG公司（反义） |
| | GCACGACGCACACGAAACACACAGCCA GCCA（探头） |
逆转录（RT）-PCR分析显示，原始肿瘤和KT肿瘤没有BZLF1 mRNA表达的证据（图。a） ●●●●。通过检测EBV产生细胞系B95-8细胞中BZLF1 mRNA的表达，证实了该分析的敏感性。因此，EBV潜伏期的调节相对严格，即使是在移植到SCID小鼠体内的肿瘤中。
SCID小鼠EBVaGC中BZLF1基因和EBV潜伏期基因mRNA的RT-PCR分析。用RT-PCR扩增EBV的BZLF1基因（a）和EBNA1、EBNA2、LMP1、LMP2A和LMP2B基因（b）的转录物，电泳并用溴化乙锭染色进行可视化（上面板），然后将每个印迹与特定的内部探针杂交（下面板）。（a） 原始EBVaGC（FR122）和KT肿瘤（FR216）均未显示BZLF1转录物，而产生EBV的细胞系B95-8则显示。（b） 在EBV潜伏期基因中，原始EBVaGC（FR122）和KT肿瘤（FR216）均显示EBNA1转录物，但不显示EBNA2、LMP1、LMP2A或LMP2B转录物。所检测的EBV潜伏期基因的所有转录物均出现在含EBV的淋巴瘤细胞系（Raji）中，而在EBV阴性的淋巴瘤细胞株（Ramos）或小鼠组织（FR218，肝脏；FR219，肾脏）中未发现任何转录物。β-肌动蛋白mRNA很容易从所有受试组织中扩增出来。（c） SCID小鼠人类EBVaGC中EBNA1 mRNA的启动子使用。EBV DNA的三个启动子Cp、Wp和Qp对EBNA1的表达是互斥的。如图所示，通过RT-PCR扩增每个启动子对和相应的外显子。原始EBVaGC（FR122）和KT肿瘤（FR216）均显示Qp驱动的EBNA mRNA，但不显示Cp或Wp驱动的转录。后两种EBNA1转录物在含EBV的淋巴瘤细胞系（Raji）中得到证实。EBV（Ramos）阴性淋巴瘤细胞系或小鼠组织中均未扩增出任何转录物。
EBV相关恶性肿瘤根据潜伏基因的表达进行分类(2,三). 在Burkitt淋巴瘤中观察到潜伏期I，其特征为EBER（+）、EBNA1（+），EBNA2（−）和LMP1（−。潜伏期III在淋巴母细胞系、免疫缺陷患者的机会性淋巴瘤和脓胸相关淋巴瘤中观察到，这些淋巴瘤是EBER（+）、EBNA1（+），EBNA2（+）和LMP1（+）。NPC具有潜伏期II的特征，EBER（+）、EBNA1（+），EBNA2（−）和LMP1（+）介于潜伏期I和III之间。
通过EBER1 ISH，我们确认原始肿瘤中近100%的肿瘤细胞显示EBER1阳性信号。KT肿瘤的肿瘤细胞（第二代、第四代和第十代）也显示EBER1阳性信号（图。e） 尽管染色强度相对较弱。
RT-PCR分析（图。b） 显示EBNA1 mRNA的存在(巴姆HI U和K外显子）。另一方面，这两种肿瘤都不表达可检测的EBNA2、LMP1或LMP2 mRNA。来自含有EBV的淋巴瘤细胞系Raji的RNA制剂对所有潜伏基因都产生了强烈的信号，而Ramos（一种对EBV呈阴性的伯基特淋巴瘤细胞系）和小鼠组织只显示出β-肌动蛋白的mRNA。
EBNA1的促进剂使用。EBNA mRNA的表达取决于三种相互排斥的EBNA启动子的活性：巴姆HI C、W和Q（分别为Cp、Wp和Qp）(17,21,23,24). Cp和Wp各自启动大的初级转录物，这些转录物不同地拼接到所有六个EBNA mRNA中，正如在EBV永生化B淋巴细胞母细胞系中观察到的那样。潜伏期I或II中的第三个EBNA启动子，通过绕过其他EBNA基因的编码区，启动EBNA1 mRNA的选择性表达，曾被报道为巴姆HI-F启动子（Fp）(23,26)但现在被称为Qp(13,17,24,25).
如图所示。c、 潜伏期的EBNA1 mRNA由Cp、Wp或Qp的特定外显子和常见外显子组成，例如巴姆HI-U和-K。通过RT-PCR分析，在这两种肿瘤中均清楚地检测到Qp-驱动的EBNA mRNA，而Cp-或Wp-驱动EBNA mRNA根本未检测到。另一方面，RT-PCR在Raji中显示了Cp和Wp驱动的EBNA1外显子，但在Ramos或小鼠组织的任何转录物中均未显示。这些结果表明，原始肿瘤和KT肿瘤是EBV潜伏期I。这与以前的研究一致(30)并证明潜伏期基因表达模式在KT肿瘤中得到了如实反映。
KT肿瘤作为EBVaGC模型。核内携带EBV基因组的鼻咽癌稳定细胞系尚未建立(15)表明体外环境将EBV基因组从上皮细胞中排除。由于EBVaGC也是一种上皮性恶性肿瘤，我们首次尝试在裸鼠体内建立EBVaGC的可移植肿瘤。然而，几次失败的尝试导致我们采用SCID小鼠作为人类EBVaGC的宿主。虽然裸鼠移植失败的原因尚不清楚，但EBVaGC的植入可能取决于肿瘤和肿瘤内浸润淋巴细胞之间的微妙平衡。
有趣的是，KT肿瘤中产生粘蛋白的癌的比例大于原始肿瘤，其中实体型低分化腺癌伴有淋巴细胞密集浸润。由于原发肿瘤中粘蛋白的产生与淋巴细胞浸润呈负相关，淋巴细胞可能会阻止癌细胞的完全分化。或者，癌细胞本身可能产生某些细胞因子，诱导淋巴细胞迁移。KT肿瘤使研究人员能够研究癌细胞的细胞因子表达，因为在该系统中细胞因子的测定中，浸润淋巴细胞的作用可以忽略。
EBVaGC被认为是由单个EBV感染的上皮细胞发育而来(9)但EBV在EBVaGC开发和维护中的确切作用尚未明确。以前，我们证明EBVaGC和EBV（−）GC可能有不同的遗传途径：5q和/或17p缺失和微卫星不稳定性在EBVaGC中极为罕见(8). Burkitt淋巴瘤也是一种潜伏期I型EBV相关恶性肿瘤(22)，c的易位-myc公司免疫球蛋白基因是淋巴瘤发生的主要原因(1,16,19). 我们现在可以在KT肿瘤的EBVaGC中研究这种机制。此外，我们相信KT肿瘤将成为EBVaGC基因治疗或免疫治疗相关的各种研究的有用体内模型。
