马铃薯X病毒三重基因块的体内翻译需要两个亚基因组mRNA

摘要

马铃薯X病毒（PVX）的三基因块（TGB）编码病毒运输所需的三种蛋白质（25-千道尔顿[25K]、12K和8K蛋白质）(5)是一个遗传模块，在波特克斯病毒,角病毒,呋喃病毒，以及卡拉病毒属(18,21,28). TGB蛋白的一些特性已被鉴定，但尚不清楚所有这些活性如何促进病毒运动。例如，与病毒运动蛋白的预测特性一致，PVX的25K蛋白影响胞间连丝门控(2)狐尾花叶病毒同源25K蛋白具有ATP酶和RNA结合活性(29). 然而，与影响胞间连丝门控的一些病毒运动蛋白不同，PVX的25K蛋白积聚在层压板内含物中，尚未定位于胞间连(11). 用体外翻译系统研究了PVX的12K和8K蛋白，可能是膜相关蛋白(27).

体内研究表明，大麦条纹花叶病毒和甜菜坏死黄脉糠秕病毒的整个TGB的表达需要两个单独的亚基因组RNA（sgRNAs）(16,31). 在这两种情况下，第一开放阅读框（ORF）的表达来自功能性单顺反子mRNA，而两个下游ORF的表达来自双顺反子(7,32). 对于PVX，体外翻译研究的结果(12,26)使用合成的RNA表明，翻译整个TGB需要两个2.1和1.4 kb的3′共末端sgRNA（sgRNA1和sgRNA2），而表达病毒外壳蛋白（CP；图。​图1A）。1A） ●●●●。

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图1

（A） PVX基因组的图示。打开的方框表示五种病毒ORF，阴影方框表示引入的标记基因（在本研究中为GUS或GFP）。每个ORF编码的蛋白质包括RNA-依赖性RNA聚合酶（RdRp）、TGB蛋白（25K、12K和8K）和CP。TGB和CP基因的sgRNAs标记为sgRNA1、-2和-3。sgRNA-M由重复的sgRNA启动子合成，是标记蛋白的mRNA。来自受感染烟草原生质体的RNA的Northern印迹显示了每个预测的基因组和sgRNAs。（B） PVX基因组3′区的图示。GUS（WT）和三种突变衍生物Δ25K、Δ12K和8K^+6个Δ25K和Δ12K病毒的TGB ORF中的黑框分别表示357和11 nt的缺失。8K系列⁺⁶突变体插入6nt。

然而，在PVX的一些研究中(9,10,20)以及相关的马铃薯病毒、狐尾花叶病毒、白三叶花叶病病毒和三叶黄花叶病毒(三,6,14)在受感染的植物中仅观察到与sgRNA1和sgRNA3相对应的两种RNA物种。这些数据表明PVX sgRNA2要么积累到很低的水平，要么不需要完全翻译TGB。

在这里，我们描述了PVX-TGB翻译策略的体内分析。我们生产了携带TGB转基因结构的植物，这些结构与可能的单顺反子、双顺反子和三顺反子mRNA相对应。这项研究的结果证实了体外研究的结果，表明25K ORF是从功能性单顺反子mRNA翻译而来的，12K和8K蛋白是来自功能性双顺反子的mRNA。此外，我们提供证据证明8K ORF通过12K ORF的漏核糖体扫描而翻译。

为了确定PVX TGB的表达策略，我们制备了表达单顺反子、双顺反子和三顺反子mRNA的转基因烟草，模拟可能存在于受感染植物中的TGB mRNA。制备了6个含有PVX序列的二元质粒，用于农杆菌属-介导的烟草叶盘转化，如表所示​表1。1为了产生这些结构，通过PCR扩增整个TGB和TGB片段，并将其插入质粒SLJ4D4中35S启动子和八肽合成酶终止子之间(19). 含有启动子、PVX ORF（s）和终止子的片段通过酶切从SLJ4D4质粒中回收生态RI和Hin公司dIII和被连接到生态RI公司-Hin公司如前所述的dIII-线性二元质粒SLJ7292(1).

表1

突变PVX的细胞间运动。转基因烟草上的GUS病毒

转基因构建一		测试线路数量b条	转基因株系数量c（c）互补突变体：
			Δ25K	Δ12K	8公里+6
TGB100型	在单独的窗口中打开	22	16	—d日	—
TGB200型		9	—	三	—
TGB300型		11	—	—	7
TGB400型		21	21	0e（电子）	0
TGB500型		5	5	0	—
TGB600型		6	—	4	三

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^一暗盒表示启动子和终止子区域。25K、12K和8K是PVX的TGB ORF的名称。 

^b条每株系10到20株植物通过接种每种病毒进行测试。 

^c（c）在5dpi下，通过GUS分析测定补充突变病毒细胞间运动的株系数量。野生型PVX。在所有测试行中，GUS从一个细胞移动到另一个细胞。 

^d日-，未经特定病毒测试的行。 

^{e（电子）}没有产生积极结果的行。 

使用抗25K和抗8K血清通过Western blotting分析TGB100、TGB300、TGB400和TGB500转基因的表达（数据未显示）。还通过用选择的T1转基因植物进行Western或Northern印迹来分析转基因的表达（数据未显示）。由于我们没有合适的抗血清，因此未通过Western blotting分析TGB200和TGB600株系中12K蛋白的积累。

在这些研究中使用了两种版本的PVX，它们都来自PVX。GUS和PVX。GFP质粒。这些质粒包含PVX的cDNA，其β-葡萄糖醛酸酶（GUS）或绿色荧光蛋白（GFP）基因插入到重复的sgRNA3启动子附近(4,9). 三个PVX。通过PCR诱变制备GUS衍生物(17)最初用于评估病毒运动缺陷的转基因补充（图。​（图1B）。1B） ●●●●。如前所述，Δ25K突变包含一个延伸至基因组核苷酸（nt）4587至4945之间的缺失突变(2)Δ12K突变包含一个移码突变，该突变是由基因组nt5240至5250和8K之间的11 nt缺失引起的⁺⁶在PVX基因组中，突变体在nt5542之后插入了6nt（CGCGTA）。转基因烟草接种了感染性转录物（8K的⁺⁶突变体）或带有Δ25K和Δ12K的病毒。从表达Δ25K和Δ12 K病毒基因组的转基因烟草中获得的病毒(1)在本研究中，它们被用作约1000株植物的接种源，比通过转录cDNA克隆生产的植物更经济。

接种Δ25K、Δ12K和8K的T1转基因植物和非转基因植物的叶片⁺⁶如前所述，在接种后5天（dpi）分离并进行GUS组织化学分析(13). 在非转基因植物PVX上使用5 dpi。GUS病灶直径为10至15个细胞（图。​（图2）。2). 然而，这三种变异病毒在细胞间运动方面存在缺陷（图。​（图2），2)在接种的叶片中，GUS活性仅限于最初感染的细胞。

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图2

用PVX对5dpi烟叶的GUS组织化学分析结果。GUS、Δ25K、Δ12K和8K⁺⁶变异病毒。接种PVX的叶片扩大了感染病灶。GUS是用1倍物镜和徕卡MZ12显微镜拍摄的。用20倍物镜和Zeiss Axiophot显微镜拍摄了接种突变病毒的叶片上单个感染细胞的GUS活性。

细胞间运动缺陷在反式当将突变病毒接种到表达单个野生型TGB ORF的植物上时（表​（表1）。1). 因此，在表达25K基因的TGB100株系上，Δ25K突变体具有互补性（22株系中有16株呈阳性）；在表达12K基因的TGB200株系中，Δ12K突变体具有互补性（9株系中有3株呈阳性）；在表达8K基因的TGB300株系中，8K互补^+6个突变株（11个品系中的7个被检测为阳性；表​表1）。1). 这些数据证实了25K蛋白是PVX细胞间运动所必需的(2,25)并直接证明12K和8K蛋白也是病毒从最初感染的细胞中移出所必需的。

接种到携带双顺反子或三顺反子转基因植物的TGB突变体也具有互补性。然而，在这些株系上，除了一个例外，只有当PVX突变对应于转基因中5′-最大ORF时才发生互补（表​（表1）。1). 因此，Δ25K突变体在TGB400（21个品系中有21个检测呈阳性）和TGB500品系（5个品系中有5个检测呈阳性）上得到了补充。25K ORF是这两个转基因中5′最大的ORF。Δ12K突变体在TGB600株系上得到补充（六株系中有四株被检测为阳性），其中5′-最大ORF编码12K蛋白，但在12K ORF为内部的TGB400或TGB500株系上没有。内部ORF互补的一个例外是8K⁺⁶突变株接种到TGB600株系。在这些株系中，8K ORF在转基因RNA中以内部ORF的形式表达。因此，TGB600株系中的双顺反子12K/8K mRNA中表达了12K和8K蛋白，但TGB400和TGB500株系中编码整个TGB的三顺反子mRNA中没有表达。因此，这些互补数据与之前的体外研究一致(26)表明2.1-kb的sgRNA1是25K蛋白的功能单顺反子，12K和8K蛋白编码在sgRNA2中。

补充数据（表​（表1）1)表明TGB600 mRNA作为双顺反子mRNA用于表达12K和8K蛋白。如果PVX感染细胞中存在相应的双顺反子病毒mRNA，我们预测接种PVX的12K ORF中的某些类型的突变将作用于顺式以防止8K ORF转换。阻止8K蛋白表达的12K突变类型取决于8K ORF从双顺反子mRNA转化的机制。GFP突变体（图。​（图3）三)通过PCR突变制备12K ORF中包含突变(17). 12FS突变体具有与Δ12K相同的缺失突变。在12I突变体中，AUG翻译起始密码子被异亮氨酸的蛋氨酸密码子替换为AUA密码子。12STOP突变体包含序列C UAG UGA UAA，其中C替换PVX中的U，并在nt 5167后插入UGA UA基序。该基序在12K ORF起始密码子下游20 nt引入了两个终止密码子。突变体12KOZ包含序列GGGGACCAUGAUGGCAG公司GG插入相同位置。该序列包含科扎克共识序列中的三个翻译起始密码子(23,30). 12D突变体在nt5170到5423之间缺少整个12K ORF的编码序列，只留下前20 nt完整，与25K ORF重叠，最后70 nt完整，其中67 nt与8K ORF重合。12ID突变体包含翻译起始密码子替换为异亮氨酸密码子和12K ORF中20 nt的缺失。

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图3

PVX的图示。GFP和六种突变衍生物。如阴影框所示，12FS突变干扰了12K ORF的一个区域的表达。将甲硫氨酸起始密码子转化为异亮氨酸密码子的突变指示在突变体12I和12ID的12K ORF上方。12STOP和12KOZ突变体中的核苷酸序列插入也指示在12K ORF上方。突变体12D和12ID中的缺失由12K ORF中的缺口指示。

12FS、12I、12ID和12STOP的突变（图。​（图3）三)如果8K ORF是通过核糖体移码或12K ORF终止密码子的读取来翻译的，那么这两种方法都会阻止8K ORF的翻译。核糖体要么不会启动12K ORF的翻译，要么会在达到8K ORF之前脱离。12D突变体将通过去除任何可能起到核糖体内部进入位点作用的序列来阻止核糖体翻译8K ORF的内部进入。最后，12KOZ突变将通过泄漏核糖体扫描阻止8K ORF的翻译，因为该突变在12K ORF开始时引入了几个起始密码子。所有这三个起始密码子都处于良好的翻译环境中(22,30)这样可以防止核糖体扫描泄露。

每个12K突变都被引入PVX。GFP背景，以便在7天的紫外线照射下直接监测细胞间的运动（图。​（图4）。4). 在非转基因植物上，每个12K突变病毒仅限于最初感染的细胞，GFP表达证明了这一点。然而，除12KOZ外，所有12K突变病毒在表达12K蛋白的TGB200植物上从一个细胞移动到另一个细胞。12KOZ的表型可能是由于突变对8K ORF表达的影响，因为表达12K和8K蛋白的TGB600植物补充了细胞间运动缺陷。因此，我们得出结论，PVX中8K蛋白的表达是通过12K ORF的漏核糖体扫描实现的。

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图4

扩大PVX感染病灶的时间进程分析，使用GFP作为视觉标记物来计算感染病灶中感染表皮细胞的数量。在3、5和7dpi下测量了非转基因（○）、TGB200（•）和TGB600（δ）烟草接种叶片上10个感染病灶的平均直径。两个面板中的虚线表示野生型PVX的细胞间运动。GFP，而实线表示每个面板中命名的突变病毒的细胞间运动。

漏核糖体扫描在一些阳性标记RNA病毒和逆转录病毒的下游起始密码子翻译中起作用(15,24)并要求第一个ORF的翻译起始密码子处于次优序列上下文中(22). 从mRNA的5′端开始有效翻译需要在起始密码子的位置−3处嘌呤和起始密码子+4处鸟嘌呤(8,15). 相反，次优上下文在起始密码子的位置−3处有嘧啶，位置+4不包含鸟嘌呤。PVX 12K ORF的翻译起始密码子处于翻译起始的不利环境中，嘧啶（胞嘧啶）位于位置−3，尿苷位于位置+4。甜菜坏死黄脉糠秕病毒和大麦条纹花叶病毒TGB中第二个ORF的起始密码子也处于次优环境，表明这些病毒与PVX一样，使用泄漏扫描作为第三个TGB ORF翻译的控制机制(7,32).

霍德病毒、糠秕病毒和马铃薯X病毒家族TGB内基因的保守线性排列以及类似的TGB表达策略表明，TGB蛋白的表达机制具有功能意义。保存TGB最明显的功能性原因与TGB蛋白生产的化学计量比有关。例如，通过偶联来自同一RNA的12K和8K蛋白的表达，可以确保它们以产生最有效功能的相对量产生。甜菜坏死黄脉糠秕病毒中TGB突变的互补性表明TGB蛋白功能依赖于相对水平：只有当13K和15K TGB蛋白表达于同一双顺反子mRNA时，缺陷细胞间运动才发生互补(7). PVX中的情况并不完全相同，因为如本文所述，细胞到细胞的运动由来自单顺反子转基因的任何TGB蛋白的表达补充。然而，在我们的TGB转基因株系中，接种的病毒中没有长距离运动缺陷的补充（数据未显示）。PVX进入或离开血管系统可能需要TGB蛋白的精确化学计量。

致谢

参考文献