逆转录病毒是已知的唯一一类有“化石”记录的病毒。所有哺乳动物和鸟类，可能还有大多数其他脊椎动物在进化史上的某个时候都受到了逆转录病毒的感染，因为与已知逆转录病毒密切相关的内源性元素已被发现是所有物种DNA中丰富的生殖系元素(2,7). 研究得最好的内源性前病毒是小鼠体内的前病毒，据估计，高达0.5%的小鼠基因组由这些元素组成。在近交系实验室小鼠中，至少已鉴定出八种不同的内源性元素。具有近亲的外源性病毒包括与乳腺癌病毒相关的B型前病毒和与小鼠白血病病毒（MLV）相关的C型前病毒(2,7).
在已知的内源性前病毒中，内源性C型相关MLV是一个庞大且特征明确的群体。根据潜在的宿主细胞范围，它们被分为两大类，共向病毒和非共向病毒，这一特性由病毒编码的表面（SU）蛋白决定环境价值基因。嗜生态病毒只能感染小鼠细胞，在普通实验室小鼠株中只存在一到五个拷贝(22,26,35). 非嗜生态病毒可分为三类，即异向性病毒、多向性病毒和改性多向病毒，在近交系小鼠基因组中各存在约20个拷贝(15,26,43). 内源性非共同性MLV前病毒有助于理解宿主-逆转录病毒的相互作用，因为它们在小鼠基因组中丰富且高度多态(7). 我们以前的研究表明，每一种非共性前病毒在环境价值和长末端重复（LTR）区域，使其区别于所有其他组(8,42). 最有用的是，多态性允许我们开发一组寡核苷酸探针，明确检测小鼠基因组中非共异性群的所有成员(11,43). 通过使用这些群体特异性探针，我们可以证明前病毒的几个方面，包括它们在普通实验室菌株中的染色体位置(三,13–15,44).
对非共异性病毒的研究也有助于理解小鼠体内致癌病毒的生成。几种非共向性前病毒的后代可以与外源性或其他内源性MLV重组，在某些实验室小鼠株中产生致癌变体，如水貂细胞病灶形成病毒（MCF）(6,16,33,36,41,46). 一种内源性嗜外病毒(Bxv-1型)是MCF病毒的主要LTR供体(17). 基因交换也发生在环境价值编码SU的基因。这种交换通常涉及到多方替换环境价值序列转化为生态病毒背景。
野生家鼠中也发现了内源性非共热带前病毒。以前的研究表明环境价值前病毒序列广泛分布于亚属中穆斯尤其是小家鼠普通近交实验室菌株的祖先物种(4,21,22,26,47,50). 这些发现表明，这些生殖系序列是在不同的野生小鼠中独立获得的，并且在很大程度上在小M物种(26). 因此，对野生小鼠体内内源性非共热带前病毒的详细分析将使我们能够评估MLV与小鼠宿主在进化历史中的关联。
在本研究中，我们研究了野生小鼠体内的内源性非共向MLV，包括四个主要亚种小M(卡斯塔纽斯M.M.castaneus,小肌M.M,molossinus支原体、和家蝇M.M.domesticus)以及四种常见的实验室菌株。我们可以用这两种方法证明三组非共热带前病毒在野生小鼠中的详细分布环境价值-和LTR特异性寡核苷酸探针。此外，我们还检测了小鼠中非共食性前病毒重组形式的存在及其意义。在本文中，我们报道了非共热带MLV前病毒的广泛多态性，以及MLV和野生小鼠之间可能的进化关系。
材料和方法
小鼠DNA。
除了四个常见的近交实验室菌株（AKR/J、HRS/J、C3H/HeJ和C57BL/6J）外小M本研究中使用了。所用的近交野生家鼠菌株为CAST/Ei(M.M.锥体)，捷克共和国第二/第二委员会(小肌M.M)、MOLC/Rk、MOLF/Ei和MOLG/Dn(molossinus支原体)、WSB/Ei和ZALENDE/Ei(家蝇M.M.domesticus). WSB菌株是从CLA菌株中分离出来的，CLA菌株是从马里兰州农场捕获的野生小鼠中产生的。家蝇M.M.domesticusZALENDE原产于欧洲（瑞士），以前被归类为鼠痘支原体病毒这些菌株的DNA样本来自缅因州巴尔港杰克逊实验室的小鼠DNA资源。
干凝胶杂交和寡核苷酸探针。
在干燥的琼脂糖凝胶中进行杂交（未染色），如前所述(45). 简单地说，用适当的限制性内切酶消化的基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳。用溴化乙锭（EtBr）染色后，凝胶中的DNA变性。干燥后，将凝胶与5′-32P标记寡核苷酸探针（0.5×106cpm/ml）。然后清洗干燥的凝胶，短暂风干，并在−70°C下用增感屏将其暴露于X射线胶片中1至5天。每个非共同性前病毒特异性寡核苷酸探针的序列环境价值和LTR区域(环境价值：JS-4、JS-5和JS-6/10；LTR：Pltr、Mltr和Xltr）和杂交温度在其他地方描述(11,43). 重组前病毒特异性寡核苷酸探针的序列和杂交温度分别为5′-TTG AAC TCT GGC CAA GGG TGA C-3′和58°C（KT-45）。如有要求，可提供详细协议。
合成寡核苷酸引物和PCR分析。
为了通过PCR检测小鼠基因组中非共异性MLV的重组形式，我们使用了六个扩增引物。扩增引物的位置如图所示。A.引物的核苷酸序列如下：XS-1，5′-ACG GTC TCT ATG GTA CCT GG-3′；XA-3，5′-ACT TTT CCA GAA ACT GTT GC-3′；PS-1，5′-CTA标签TCC CTG AGA CTG CC-3′；PA-2，5′-CAC TGA CGT CTG AGA GCC AT-3′；mPS-1.1，5′-GCA GCA TCT ATA CAA CCT AG-3′；和mPA-2，5′-TCT ATC GGG GCT TCT GTG TC-3′。
野生小鼠中非共食性前病毒的分布。（A） 群体特异性PCR引物和探针的位置。显示了内源性非共热带前病毒的结构。的大致位置堵住,波尔、和环境价值还指出了LTR的基因和相对大小。多向病毒和改良多向病毒LTR中的黑盒与190-bp插入序列相对应(24). 箭头显示保守Pvu公司II站点位于环境价值非共性前病毒基因组中的基因。（B至D）无分块分析私人股本II消化的小鼠DNA用异嗜性寡核苷酸探针（JS-6/10，环境价值；Xltr，LTR）（B），多向寡核苷酸探针（JS-5，环境价值；Pltr，LTR）（C）和改良的多向寡核苷酸探针（JS-4，环境价值；Mltr，LTR）（D）。车道：a和l，AKR/J；b和m，HRS/J；c和n，C3H/HeJ；d和o，C57BL/6J（实验室）；e和p，CAST/Ei(M.M.锥体)（cas.）；f和q，捷克语II/Ei(小肌M.M)（亩）；g和r，MOLC/Rk(molossinus支原体); h和s，MOLF/Ei(molossinus支原体); i和t，MOLG/Dn(molossinus支原体)（摩尔）；j和u，WSB/Ei(家蝇M.M.domesticus); k和v，ZALENDE/Ei(家蝇M.M.domesticus)（域名）。侧面显示了与野生家鼠片段相结合的已知前病毒位点。方框带表示两个不同探针之间的碰撞碎片。还显示了分子标记的大致位置。检测到大小相同的带环境价值车道a和车道l中的点表示LTR探头。
PCR总体积为50μl，包含0.5μg基因组DNA，正反义引物各50 pmol，2.5 U水热Thermus aquaticusDNA聚合酶(Taq公司聚合酶；康涅狄格州诺沃克市佩金-埃尔默·塞特斯）。用于扩增的反应混合物分别在94、60和72°C下培养1、2和2分钟。在可编程循环反应器（ERICOMP，San Diego，CA）中重复该循环30次。扩增后，在0.8%琼脂糖凝胶中分析产物，用EtBr染色，并通过UV荧光观察。为了在印迹前使DNA变性，凝胶在0.5 M NaOH–1.5 M NaCl中浸泡10分钟，用H洗涤两次2O、 并在1.0 M Tris-HCl（pH 8.0）–1.5 M NaCl中中和10分钟。DNA转移到尼龙膜上。DNA交联后，通过Southern blot杂交和32如前所述的P标记寡核苷酸(13).
克隆和测序分析。
PCR检测到的内源性前病毒被克隆到pUC或pCR2.1（Invitrogen Co.，Purchase，N.Y.）载体中。用双链双脱氧链终止法测定DNA序列(40)使用Sequenase 2.0版试剂盒（美国生物化学公司，俄亥俄州克利夫兰）。测序后，使用Needleman和Wunsch算法对序列数据进行比对(34)在遗传学计算机组程序的PILEUP程序中实现(9).
结果
野生小鼠中非共性前病毒的株系分布。
在以前的研究中，异向和多向的分布环境价值使用以下方法检测野生小鼠中的序列环境价值-反应探针(4,25,26). 这些研究表明，异向性和多向性环境价值在不同的野生家鼠亚种中独立获得序列。然而，这些研究中使用的多向探针是非特异性的，并且与太多片段发生反应，无法明确识别单个前病毒(38). 此外，很明显，并非所有的MLV前病毒都可以用来自环境价值地区(12,29). 因此，为了充分了解非共沸MLV在野生小鼠中的分布，我们首先将适当消化的野生小鼠DNA杂交到这两种病毒环境价值-和已知对每一组非共异性前病毒高度特异的LTR-特异性寡核苷酸探针。探针的位置如图所示。A.它们的确切序列在别处描述(11,43). 基因组DNA被消化Pvu公司II并与特定探针杂交。限制性内切酶Pvu公司选择II是为了匹配早期的proviral绘图工作(11,13–15).私人股本II比其他酶更受欢迎，因为存在保守的Pvu公司已知前病毒5′部分的II位点，以及环境价值（图。A） ，导致前病毒-宿主连接片段大小范围广泛。
如图所示。，野生家鼠物种含有许多与群体特异性探针反应的前病毒，但不同物种的前病毒数量和近交系的前病毒数差异很大。正如我们之前报告的那样(11)，在近交实验室菌株中检测到的大多数前病毒环境价值探针（通道a到d）也用特定的LTR探针（通道l到o）检测，尽管后者杂交到的碎片总数约为5′和3′连接碎片的两倍，与检测结果一致。例如，AKR/J小鼠DNA中的这种片段用a和l道中的点表示（图。).
野生小鼠品系与特定探针的杂交模式截然不同。尽管几乎所有菌株都至少有一种前病毒与每种探针反应，但这些前病毒的数量通常差别很大。此外，在许多情况下，在近交实验室菌株中识别相同前病毒的探针检测到片段之间很少或没有相关性。通过使用异向性环境价值（JS-6/10）探针，在来自小肌M.M和molossinus支原体亚种（图。B、 通道f至i），而每个通道中仅显示出微弱的带家蝇M.M.domesticusDNA（通道j和k）。在实验室菌株和M.M.锥体DNA（车道a至e）。这些结果与异向分布一致环境价值先前研究中观察到的序列(26). 相反，使用异向LTR（Xltr）探针，在家蝇M.M.domesticus（车道u和v）。用多方探针观察到类似的模式（图。C） ●●●●。尽管多向LTR（Pltr）探针在M.M.锥体DNA（lane p），多聚体未检测到特定片段环境价值（JS-5）探头（车道e）。此外，尽管在肌肉M和小骨M.M亚种（车道q到t），只有少数多向环境价值-在DNA中发现了活性片段（通道f至i）。通过使用修改的多方环境价值（JS-4）探针，在四个实验室菌株和家蝇M.M.domesticus（图。D、 车道a至D、j和k）。相比之下，在M.M.锥体,小肌M.M、和小骨M.MDNA（车道e至i）。此外，改进的多方LTR（Mltr）探针在M.M.锥体和小肌M.MDNA与与JS-4探针杂交的片段（通道e和q）没有任何相关性。
我们将这些菌株中每一组前病毒的数量制成表格（表). 三个内源性非共沸基团在小M亚种。异源序列主要分布在小肌M.M和molossinus支原体亚种，而多变和改良的多变片段主要发现于家蝇M.M.domesticus亚种。在实验室小鼠品系中，与环境价值和LTR探针相关性良好，LTR特异性探针检测到的片段数量大约是LTR探针的两倍。然而，在野生老鼠中环境价值-和LTR反应片段不一定相关。缺乏相关性可能是由于前病毒中的序列多态性、内部缺失或不同组之间的重组所致。与重组相一致的是一些异向性的混合环境价值-反应碎片M.M.锥体多向LTR探针检测到DNA片段（图。B、 车道e；图。C、 车道p）。此外，在C57BL/6J菌株中用多方LTR探针检测到一个片段（图。C、 lane o，box）与一块与异形体反应的碎片混合环境价值探头，JS-6/10（图。B、 车道d，方框）。对这些碎片进行了鉴定和命名图5和圣诞节42在我们之前的研究中，被解释为可能是异向性和多向性原病毒之间的重组(11,13).
表1
| 应变 | 亚种 | 反应碎片数量一
|
|---|
异向性的
| 多元的
| 改性多方
| A类Xeno/Poly（KT-45） |
|---|
| 环境价值 | 长期风险率 | 环境价值 | 长期风险率 | 环境价值 | 长期风险率 |
|---|
| AKR/J公司 | | 11 | 25 | 17 | 38 | 11 | 24 | 0 |
| 人力资源部/日本 | | 8 | 19 | 21 | 46 | 9 | 23 | 0 |
| C3H/HeJ（高度） | | 8 | 16 | 15 | 34 | 7 | 17 | 0 |
| C57BL/6J型 | | 18 | 36 | 22 | 46 | 10 | 26 | 1 |
| 铸件/Ei | M.M.锥体 | 26 | 35 | 0 | 30 | 1 | 5 | 15 |
| 捷克共和国第二/第二委员会 | 小肌M.M | >60 | >100 | 5 | 23 | 4 | 1 | 0 |
| MOLC/Rk公司 | molossinus支原体 | >60 | >100 | 2 | 14 | 2 | 6 | 4 |
| MOLF/Ei公司 | molossinus支原体 | >60 | >100 | 2 | 14 | 1 | 三 | 5 |
| 模具/Dn | molossinus支原体 | >60 | >100 | 2 | 14 | 2 | 5 | 4 |
| WSB/工程师 | 家蝇M.M | 1 | 9 | 11 | 39 | 15 | 35 | 0 |
| 扎伦德/Ei | 家蝇M.M.domesticus | 1 | 11 | 8 | 23 | 23 | >50 | 0 |
野生家鼠DNA中非共热带前病毒重组形式的检测。
非共性片段的分布表明野生小鼠中不同组非共性病毒之间存在组内多态性或重组前病毒。为了研究这种遗传变异，我们通过PCR直接在野生小鼠中寻找非共热带MLV的重组形式。设计有义和反义引物分别在SU的高变富含脯氨酸（HPR）区和LTR的U3区进行引物扩增（图。A） ●●●●。因为每个标准的非共同性群在这些区域都有一组多态性，并且在序列中有严格的联系(8,43)，这些组的成员只能通过相应的引物对进行扩增。与标准前病毒相比，重组前病毒只有在用“不匹配”对扩增时才能产生产物。在本文的其余部分，为了命名的方便，我们将这种前病毒称为“重组”。然而，应该记住，我们无法区分它们或最初在近交系中定义的前病毒是亲本还是重组形式。
首先，我们研究了引物的特异性。如图所示。A、 在我们的扩增条件下，每个匹配的引物对只能扩增相应组的一个前病毒。此外，使用任何不匹配的正、反义引物组合都无法检测到任何前病毒（图。B） ●●●●。
内源性非共同性前病毒的群体特异性PCR引物和PCR的特异性。（A） 引物对的特异性。用每对匹配的引物对PCR进行Southern blot分析。每种共沸（MX14）和非共沸（异沸，MX22；多变，MX27；改性多变，MX33）(42)PCR模板采用前病毒克隆。每个PCR的引物对如左图所示。（B） PCR的特异性。凝胶的EtBr染色如图所示。在两个不同的非共热带前病毒克隆和每个引物组合存在的情况下进行PCR。模板：通道1至4，MX22+MX27；车道5至8，MX22+MX33；通道9至12，MX27+MX33。引物对：通道1和5，XS-1/XA-3；泳道2和9，PS-1/PA-2；泳道6和10，mPS-1.1/mPA-2；3号车道，XS-1/PA-2；车道4，PS-1/XA-3；7号车道，XS-1/mPA-2；车道8，mPS-1.1/XA-3；11号车道，PS-1/mPA-2；12号车道，mPS-1.1/PA-2。
使用PCR寻找重组体的一个担忧是，反应本身可能产生重组DNA分子。当一个模板的不完整产物与另一个模板杂交并成为扩增引物时，就会产生这种重组。在MLV序列的扩增过程中可以形成这样的人工模板-聚合物对，因为环境价值不同类型非共热带病毒的U3区高度保守。为了检测这种伪影，我们在存在两种不同的前病毒的情况下使用每对引物进行PCR。图B显示了这个实验的结果。只有当反应混合物中存在匹配的引物对时，才能观察到扩增产物。尽管不同前病毒之间的序列高度一致，但我们没有发现任何由PCR介导的重组产生的产物。这些结果证实，在这里使用的条件下，寡核苷酸引物显示出所需的序列特异性，并且PCR本身没有生成重组产物。
我们首先使用引物对在小鼠DNA中寻找典型的非共同性内源性MLV。如图所示。A、 并非所有野生动物DNA都产生了预期的片段。异源引物对（XS-1/XA-3）可以扩增四个实验室菌株DNA中的片段，M.M.锥体,小肌M.M、和molossinus支原体（车道a至i），但在家蝇M.M.domesticusDNA（车道j和k）。此外，在来自M.M.锥体使用多向引物对（PS-1/PA-2）（车道e），而改性多向引子对（mPS-1.1/mPA-2）在M.M.锥体和小肌M.M分别为DNA（车道e和车道f）。这些结果与图中的开槽分析所得结果一致。，其中环境价值-和LTR反应片段没有显示出多向序列和修饰多向序列的任何相关性，表明它们存在于不同的前病毒中。此外，只有一种异向性环境价值-反应性片段与LTR探针没有反应，在家蝇M.MDNA。这些结果也证实了这些引物的特异性。
基因组DNA中内源性前病毒的检测。用PCR检测各组非共同性前病毒（A）和重组非共异性前病毒（B）。PCR产物通过Southern blot杂交和32P标记的寡核苷酸探针（见材料和方法）。用于PCR的引物对显示在左侧（A）或底部（B）。车道：a，AKR/J；b、 小时/日；c、 C3H/HeJ；d、 C57BL/6J；e、 铸件/Ei(M.M.锥体); f、 捷克共和国第二/第二委员会(小肌M.M); g、 MOLC/Rk公司(molossinus支原体); h、 MOLF/Ei公司(molossinus支原体); i、 模具/Dn(molossinus支原体); j、 WSB/Ei(家蝇M.M.domesticus); k、 扎伦德/Ei(家蝇M.M.domesticus).
接下来，我们使用正反义引物的组合来测试小鼠DNA中是否存在非共性前病毒的重组形式。例如，使用异向义（XS-1）和多向反义（PA-2）引物的组合来寻找SU中具有异向型HPR区域和LTR中具有多向型U3区域的重组前病毒，如图所示。B、 除多向型外，所有引物组合中至少有一个DNA中检测到可能的重组形式环境价值/异源型改性多向（mPoly）LTR前病毒环境价值在一个实验室菌株（C57BL/6J）和所有野生家鼠亚种中检测到和多向LTR序列（Xeno/Poly）家蝇M.M.domesticus（XS-1/PA-2；车道d至i）。该结果与之前在C57BL/6J和卡斯塔纽斯M.M.castaneus脱氧核糖核酸(11,13)（图。). 在两个实验室菌株（HRS/J和C3H/HeJ）中检测到可能的Xeno/mPoly重组体，小肌M.M、和一个家蝇M.M.domesticus应变（ZALENDE/Ei）（XS-1/mPA-2；车道b、c、f和k）。从与I类MCF病毒相似的Poly/Xeno重组前病毒的DNA中扩增出两个不同大小的片段小肌M.M和一个家蝇M.M.domesticus应变（WSB/Ei）（PS-1/XA-3；车道f和j）。有趣的是，在WSB/Ei菌株中检测到的每个片段都略大于小肌M.M此外，具有改性多向型的重组前病毒环境价值在来自的DNA中检测到序列（mPoly/Xeno和mPoly/Poly）小肌M.M和a家蝇M.M.domesticus应变（ZALENDE/Ei），分别为（mPS-1.1/XA-3，车道f；mPS-1-1/PA-2，车道k）。
的顺序环境价值重组前病毒的区域。
为了分析PCR分析中检测到的可能重组内源性MLV的遗传性质，我们检测了每个PCR产物中的至少五个克隆。序列分析显示，扩增片段为非共沸性MLV相关前病毒，在HPR和U3区域的部分区域包含与两个不同组相似的序列。
图以图解形式显示了环境价值测序前病毒的区域。这个环境价值这里检测到的前病毒序列彼此密切相关，因为我们测序的区域（SU和跨膜[TM]区域的3′半）在非共热带病毒中高度保守，HPR区域除外。然而，至少两个不同组的特征序列出现在环境价值重组前病毒的区域。
的示意图环境价值重组前病毒的结构。将重组前病毒的核苷酸序列与每个非共性前病毒的核酸序列进行比较。NZB序列(37)和CWM(32)用于标准异种病毒和MX27和MX33(42)分别用于多向病毒和改良多向病毒。符号：（|）与一致性非嗜同性原病毒序列的核苷酸差异；（○|）重组原病毒中一致非嗜同性原病毒序列的独特核苷酸差异；（☻）独特的限制性内切酶位点：Ec，生态RII；Av公司，平均II类；千磅，千磅我；Sa、，囊我；St中，史蒂我；博士，德拉我；伊芙，生态RV；理科，Sca公司我；Bm公司，英国标准协会我；（五） 删除。阴影区域表示每个前病毒中可能的重组区域。指示KT-45杂交探针的位置。米在A型Xeno/Poly重组病毒中，表示来自molossinus支原体。Poly/Xeno重组前病毒中的缺失区域用括号表示。SU和TM区域的边界也显示在顶部。箭头表示PCR引物。
重组前病毒的独特结构特征环境价值区域如下。首先，Xeno/Poly重组体可细分为两种不同类型。来自C57BL/6J的前病毒，M.M.锥体、和小骨M.M彼此非常相似，被称为A型。这些与来自小肌M.M（图。). A型Xeno/Poly重组前病毒含有高达TM区3′半的异源序列，而B型前病毒除了在TM区3’四分之一外几乎与异源前病毒相同。因此，似乎至少发生了两次不同的交叉事件来产生这种类型的重组病毒。此外，来自molossinus支原体在SU区域末端附近包含一个2 bp的缺失，导致移码和在SU和TM区域边界的上游引入一个终止密码子。值得注意的是，A型Xeno/Poly重组前病毒中有两种独特的核苷酸变化。在SU区域的末端附近，a囊在所有非共异性前病毒组中保守的I识别位点在A型重组前病毒中缺失，核苷酸的改变引入了额外的史蒂I位点位于缺失基因下游5 bp的区域囊I现场（图。). 这些独特的核苷酸变化使我们能够将这些A型Xeno/Poly重组前病毒与其他病毒区分开来；详细分析如下。
Xeno/mPoly重组前病毒可分为三种类型（图。). 尽管环境价值A型（来自C3H/HeJ和HRS/J菌株）和B型（来自家蝇M.M.domesticus重组前病毒彼此非常相似，A型前病毒的U3区与B型前病毒不同（见下文）。相反，环境价值C型重组前病毒的序列小肌M.M与A型和B型重组子不同（图。).
有趣的是，A型和B型前病毒在其序列的前200-bp区域都含有多向序列（图。)尽管异向感引物启动了它们的扩增。这种反应性不可能是由于异向性引物与多向性序列的非特异性杂交造成的，因为在这种情况下，引物对XS-1/PA-2将在我们检测的所有小鼠DNA中检测到产物，除了M.M.锥体此外，在观察到Xeno/mPoly重组前病毒的DNA中也会检测到Poly/mPoly的重组前病毒。然而，我们无法通过PCR分析检测到任何此类前病毒（图。B、 XS-1/PA-2和PS-1/mPA-2），表明环境价值在小鼠DNA中确实存在HPR区具有异向和多向病毒特征的序列。或者，在引物结合位点的下游可能存在异向性和多向性前病毒之间的交叉。
在两个不同亚种的野生小鼠中检测到的Poly/Xeno重组前病毒具有相似的结构特征（图。). 尽管使用了引物进行扩增，但这些前病毒在所有序列部分与改良的多向前病毒的关系最为密切环境价值基因。它们与MCF病毒相似，因为它们包绕着多向病毒环境价值和异向LTR序列。然而，在MCF病毒中，TM区的一些部分被嗜生态序列占据(18,23,39,46,49). 因此，聚/Xeno重组原病毒不能与MCF病毒相关。通过PCR分析在每种小鼠中检测到的小片段（图。B、 PS-1/XA-3）代表相同类型的重组前病毒，缺乏大部分环境价值区域（图中的括号。).
重组前病毒中不同组之间可能的交叉区域如图所示。它们位于不同组的不同位置，大小从4 bp到77 bp不等。
重组前病毒中可能的重组区域。（A） A型Xeno/Poly、C型Xeno/mPoly和mPoly/Xeno重组前病毒的可能重组位点序列。（B和C）B型Xeno/mPoly（B）和mPoly/Poly（C）重组前病毒的重组位点。非生态性前病毒序列显示在顶部和底部。仅显示了与至少一种非共热带前病毒不同的碱基。推导出的复合位点用箭头表示，并与图中所示的区域相对应。序列数据来源：异向性，NZB(37); 多变，MX27(42); 改性多方，MX33(42).
重组前病毒的U3区域。
还对PCR-扩增的重组前病毒的U3区进行了序列分析。在图中。，将其序列与近交系小鼠的非共性前病毒序列进行了比较。来自近交系小鼠的每一种典型的非共性前病毒都具有独特的结构，使其区别于其他病毒。例如，多向性和改良型多向性前病毒包含区域1（1和1*）的14-bp重复，而区域2在多向性原病毒序列中不存在。此外，在多向和改良多向前病毒中，在区域4（核心增强子区域）的下游有一个独特的190-bp插入（图。)(24,42).
重组前病毒的U3序列。将重组前病毒的核苷酸序列与异种病毒（NZB）的类似区域进行比较(37)，多变（MX27）(42)和改性多方（MX33）(42)前病毒。NZB异种病毒的序列被用作标准序列。点表示核苷酸身份。虚线表示核苷酸的缺失。存在于前病毒中的直接重复序列和独特序列被装箱；这些区域被指定为1、1、2、3、3、4和4。潜在增强子序列区域也由阴影条指示。箭头显示了190-bp插入的位置。序列3′端的星号表示插入190-bp的前病毒。引物序列下划线。保守的Pst（磅/平方英尺）我的网站也显示出来了。
几种重组前病毒的U3序列显示出相对于标准非共热带前病毒的额外变异。尽管B型Xeno/Poly重组前病毒具有多变的U3序列，但区域1*和1与改良的多变前病毒完全相同。相反，A型Xeno/mPoly重组前病毒的U3序列与改良的多向前病毒的序列非常相似，尽管区域1*与多向前毒相同。此外，A型Xeno/mPoly重组原病毒具有独特的4-bp插入，产生了直接重复序列（3*和3）和可能的新的GCN4增强子结合序列（CAGTCA）（图。)(20). B型Xeno/mPoly重组前病毒的U3区包含另一个独特的特征。尽管修改了多向序列，但这种前病毒缺乏区域1*，这是异种前病毒的特征。此外，这种重组前病毒在核心增强子区域有23-bp的缺失，导致区域2的缺失（图。).
Poly/Xeno重组前病毒的序列与异种前病毒的几乎相同。然而，这些重组前病毒含有一个修饰的多向区1（图。). 此外，来自家蝇M.M.domesticus该菌株在核心增强子序列区域含有一个39-bp重复序列（区域4*）。这种重复序列可能是导致PCR产物长度差异的原因小肌M.M和家蝇M.M.domesticusDNA（图。B、 PS-1/XA-3）。
mPoly/Xeno重组前病毒的U3序列在异源序列的基础上包含一个14-bp的直接重复序列（区域1*和1）。此外，在核心增强子区域也发现了38-bp直接重复序列（区域4*）（图。)MCF病毒在小鼠体内复制时，该区域内经常出现重复(46). PCR分析还证实，mPoly/Xeno重组前病毒与嗜异型前病毒一样，没有190-bp的插入（图。).
A型Xeno/Poly重组前病毒的分布。
非切割和PCR分析表明，A型Xeno/Poly重组前病毒广泛分布于M.M.锥体和莫洛西M.M为了验证这种可能性并更详细地确定这种类型的重组前病毒的分布，我们通过使用SU区中的独特核苷酸序列设计了一种特异性探针KT-45（图。)导致两个或三个核苷酸与其他非共性前病毒不同（图。A） ●●●●。最初，对Pvu公司Ⅱ型糖尿病小鼠DNA。如图所示。B、 在近交系小鼠C57BL/6J株和M.M.锥体和molossinus支原体亚种。这种分布与小鼠中存在的A型Xeno/Poly重组前病毒一致，表明KT-45特异性检测到A型Xeno/Poly重组前病毒。此外，在卡斯塔纽斯M.M.castaneusDNA（图。B、 车道e；表)，这些片段与Pltr探针在DNA中检测到的几乎一半的条带相对应（图。C、 车道p；表). Pltr和KT-45探针检测到的碎片数量的比较M.M.锥体DNA表明，多向LTR探针检测到的所有或几乎所有片段M.M.锥体DNA属于这种前病毒。相比之下，该探针在来自molossinus支原体应变（比较图。B、 车道g和h以及图。C、 车道g至i和表)表明约三分之一的前病毒含有多向LTRmolossinus支原体DNA为A型Xeno/Poly重组前病毒。另外三分之一可能是多向前病毒，因为有两种多向病毒环境价值-在每一种中都发现了反应带小骨M.MDNA（图。C、 车道r至t；表). 其余的KT-45反应带可能与不同的环境价值序列或可能代表单个LTR。
A型Xeno/Poly重组前病毒的分布。（A） 用于A型Xeno/Poly重组前病毒的特异性寡核苷酸探针。将A型Xeno/Poly重组前病毒的核苷酸序列与异嗜性（NZB）的类似区域进行比较(37)，多变（MX27）(42)，和改性多变型（MX33）(42)前病毒。特定探针KT-45的序列带有下划线。唯一的限制识别站点已装箱。（B） A型Xeno/Poly重组前病毒的检测。使用Pvu公司II-，生态RI-，或巴姆HI消化基因组DNA。车道：a，AKR/J；b、 HRS/J；c、 C3H/HeJ；d、 C57BL/6J；e、 铸件/Ei(M.M.锥体); f、 捷克共和国第二/第二委员会(小肌M.M); g、 MOLC/Rk公司(molossinus支原体); h、 MOLF/Ei公司(molossinus支原体); i、 模具/Dn(molossinus支原体); j、 WSB/Ei(家蝇M.M.domesticus); k、 扎伦德/Ei(家蝇M.M). 分子标记的大致位置如右图所示。箭头表示不同亚种小鼠之间的结合带。
除一株外，所有近交系均不含与KT-45探针反应的前病毒（图。B、 车道a至d）。例外是在C57BL/6J菌株中发现了一个片段，该片段似乎与在M.M.锥体和一个molossinus支原体DNA（图。B、 车道d、e和g，箭头）。在生态RI-和巴姆HI消化DNA（图。B、 车道d、e和g，箭头）证实了这三个菌株之间的前病毒共享。如上所述，该片段与圣诞节42(11,13)（图。B和C，盒式带）。在我们之前的研究中，我们报告称圣诞节42位于11号染色体上，与一个改良的多向前病毒基因座紧密相连，Mpmv4型(15). 如图所示。D、 的Mpmv4型C57BL/6J菌株和molossinus支原体应变（MOLC/Rk）。然而，Mpmv4型在中找不到M.M.锥体DNA（图。D） ●●●●。
接下来，我们研究了A型Xeno/Poly重组前病毒的SU序列，以预测重组前病毒潜在的受体用途。MLV的宿主范围由SU 5′部分HPR区上游的两个可变区（VRA和VRB）指定(1). 包含这些区域的A型Xeno/Poly重组原病毒克隆从M.M.锥体DNA使用环境价值与所有非共异性前病毒群杂交的敏感引物和PA-2反义引物。序列分析表明，该区域的核苷酸和推导的氨基酸序列与外源性病毒的核苷酸和氨基酸序列几乎相同（数据未显示），这意味着A型Xeno/Poly重组前病毒应具有外源性受体结合能力。这一观察结果也与从这些小鼠中分离出的被归类为异嗜性感染病毒的事实相一致(27).
讨论
野生小鼠中非共食性前病毒的分布。
内源性非共同性MLV前病毒是稳定的遗传因子，在小鼠中具有多态性。前病毒最近在穆斯生殖系，但肯定比生态型MLV更古老，在小鼠中既没有广泛分布也没有大量扩增(2,7). 因此，非共热带MLV前病毒应该有助于更好地理解逆转录病毒及其宿主在进化历史中的联系。我们在这里描述了小鼠中非嗜同性MLV前病毒的多态性分析。这种分析是了解病毒宿主协会的关键步骤。
本研究在近交系小鼠（AKR/J、HRS/J、C3H/HeJ和C57BL/6J）和四个主要亚种中观察到非共栖性MLV前病毒的扩展多态性小M.二者的杂交分析环境价值-以及针对每个非共异性群的LTR特异性寡核苷酸探针，使我们能够确定前病毒的详细分布。这一分析表明，尽管非共热带前病毒序列在野生家鼠亚种中广泛分布，但每个组都显示出不同的分布。异源序列主要发现于小肌M.M和molossinus支原体而多变和改性多变碎片主要发现于家蝇M.M.domesticus结合之前的观察穆斯,M.斯普雷图斯，只有多方环境价值-相似序列(4,26；我们尚未公布的数据），这些观察结果表明，每一种非共热带前病毒可能在亚种形成期间选择性地整合到特定亚种中。或者，不同类型的病毒可能只感染某些亚种。事实上，众所周知，野生家鼠物种在对不同寄主范围的MLV群的敏感性方面表现出比近交系更大的变异性(25,27,31).
我们还检查了环境价值前病毒的LTR序列。尽管这些序列在异向性、多向性和改良多向性前病毒中的连锁在普通实验室菌株中相对严格（图。)(11,42,43)在一些野生老鼠身上有例外情况。例如环境价值异种前病毒的LTR序列在家蝇M.M.domesticus（图。B） ●●●●。此外，在一些亚洲野生小鼠中，多向序列和改良的多向序列似乎都没有联系（图。C和D）。这些观察结果可以用前病毒的遗传特征来解释，例如内部缺失、组内多态性或与其他组序列的重组。尽管前病毒显示出环境价值在一些近交系实验室菌株中发现了序列(12,29,30)大量的前病毒在环境价值野生家鼠亚种中的LTR序列表明，非共热带MLV前病毒在野生小鼠中表现出广泛的遗传变异，这在实验室菌株中没有发现。
野生小鼠中非共热带前病毒的重组形式。
通过在单个PCR试验中混合和匹配特异性引物，我们可以在小鼠基因组中检测到几种形式的前病毒，这些前病毒的反应就像是相对于近交实验小鼠中发现的标准前病毒进行重组一样（图。B） ●●●●。通过与实验室菌株中的前病毒进行比较，我们将这些非标准前病毒称为重组前病毒，尽管无法仅通过序列分析判断哪些类型是前体，哪些类型是重组前体。序列分析环境价值和LTR区域显示，每个重组前病毒都具有典型的非共热带前病毒所没有的独特结构特征（图。和). 在一些重组前病毒中，不同组之间可能的交叉区域发现于环境价值基因，其中一个在三种不同类型的重组原病毒中（图。)意味着共同的起源。有趣的是，我们在这里发现的可能的重组区域，就在HPR区域的下游和TM区域的中间，与MCF病毒中观察到的重组位点相对应(5,10,17–19,23,46). 这些区域可能包含小鼠中不同病毒之间重组的“热点”，或者可能通过产生具有复制能力的病毒来选择。
除了重组差异外，相对于标准的非共性前病毒，在重组中还观察到了一些不同的序列选择。在U3区，多向和改良多向前病毒对区域1有完全的14-bp重复，改良多向原病毒的序列包含一些额外的核苷酸变化。相反，异嗜性前病毒的U3区没有这种重复，并且在其他两种类型中也没有190-bp的插入（图。). 然而，重组前病毒并不遵循这些规则。例如，在基于改良的多方U3结构的前病毒中，A型Xeno/mPoly重组前病毒包含多方型区域1，而B型Xeno/mPoly前病毒缺少区域1（图。). mPoly/Xeno重组前病毒包含异种U3结构中的重复区域1。此外，Poly/Xeno重组前病毒的区域1是修饰的多向型。这一观察可能对MLV之间的进化关系有有用的启示。考虑到这种可能性，我们正在进一步分析其他非共热带前病毒的多态性穆斯物种，包括M.斯普雷图斯和霍图兰努斯（M.hortulanus）（未发布的数据）。
不同亚种小鼠的前病毒之间广泛的基因变异，包括重组和突变，以及插入位点的多态性，表明这些前病毒不是在生殖系中的静态插入。相反，它们的进化必然涉及到病毒分离插入到生殖系时的广泛复制期。事实上，重组和突变事件与在一些近交系小鼠中产生重组MCF病毒时所看到的事件相似(10,18,19,23,28,46).
在A型Xeno/Poly重组前病毒中观察到这些前病毒的另一个有趣的方面。在一个实验室菌株和两个亚种中发现了一种这种类型的重组前病毒小M（图。)表明这些小鼠之间存在共同的遗传。SU区独特的核苷酸变化使我们能够生成一个特定探针，以充分表征小鼠基因组中的重组前病毒（图。). 我们发现这种类型的原病毒只存在于卡斯塔纽斯M.M.castaneus和molossinus支原体亚种和多向LTR探针检测到的所有或几乎所有前病毒M.M.锥体DNA为A型Xeno/Poly重组前病毒（图。C） ●●●●。有趣的是，已经证明M.M.锥体在体外显示出对多方病毒感染的抵抗力，很可能是因为多方受体基因突变(31). 与此观察一致，没有多方环境价值-包含序列且只有一个修正多方环境价值-亚种的DNA样本中存在包含序列（图。C和D）。可能含有异嗜性病毒的重组多嗜性病毒环境价值序列是通过其在M.M.锥体事实上，对重组体SU区的序列分析表明，它编码异种寄主范围。据信，与近交系实验室小鼠不同，亚洲野生小鼠可以通过基因感染异种MLV(27).
现在很明显，近交系实验室小鼠系是由少量野生小鼠杂交产生的，包括molossinus支原体和家蝇M.M.domesticus(47,50). 事实上，已经证明近交系的Y染色体来源于molossinus支原体或家蝇M.M.domesticus(48). 另一方面molossinus支原体亚种是已知的天然杂交种M.M.锥体和小肌M.M在东亚(47,50). 考虑到对molossinus支原体和近交系小鼠，这可能是真的M.M.锥体是这些小鼠中A型Xeno/Poly重组前病毒的来源。重组前病毒的分布表明molossinus支原体从M.M.锥体因为尽管测试的样本数量相对较少莫洛西M.M亚种包含多个前病毒基因，其中至少有三个代表与M.M.锥体此外，很明显，前病毒，圣诞节42，在C57BL/6J菌株中molossinus支原体因为C57BL/6J株的基因座与M.M.锥体和一个molossinus支原体应变，但只有molossinus支原体共享一个改良的多变原病毒基因座(Mpmv4型)与C57BL/6J株中的重组前病毒相关（图。D） ●●●●。
本研究中检测到的前病毒应为逆转录病毒及其鼠宿主的进化研究提供有价值的遗传标记。
