《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8281–8288.
急性淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒感染后的长期CD4 Th1和Th2记忆
,1 ,2 ,1 ,1和1,*
杰森·惠特迈尔
埃默里疫苗中心和微生物与免疫学系，埃默里大学医学院，亚特兰大，佐治亚州30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
玛丽·S·阿萨诺
埃默里疫苗中心和微生物与免疫学系，埃默里大学医学院，亚特兰大，佐治亚州30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
卡亚·穆拉利·克里希纳
埃默里疫苗中心和微生物与免疫学系，埃默里大学医学院，亚特兰大，佐治亚州30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
M.苏雷什
埃默里疫苗中心和微生物与免疫学系，埃默里大学医学院，亚特兰大，佐治亚州30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
拉菲·艾哈迈德
埃默里大学医学院埃默里疫苗中心和微生物学与免疫学系，佐治亚州亚特兰大30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
埃默里疫苗中心和微生物与免疫学系，埃默里大学医学院，亚特兰大，佐治亚州30322，1加州大学洛杉矶分校医学院微生物与免疫学系，加利福尼亚州洛杉矶900242
*通讯作者。通讯地址：佐治亚州亚特兰大市克利夫顿路1510号G211罗林斯研究大楼埃默里大学医学院埃默里疫苗中心，邮编30322。电话：（404）727-3571。传真：（404）727-3722。电子邮件：ude.yrome.oiborcim@ar公司. 收稿日期：1998年3月2日；1998年6月23日接受。
摘要
CD4 T细胞在病毒免疫中起着核心作用。它们为B细胞和CD8 T细胞提供帮助，并可以充当效应器本身。尽管它们很重要，但对病毒特异性CD4 T细胞反应的大小和持续时间知之甚少。特别是，尚不清楚CD4 Th1记忆和CD4 Th2记忆是否都能被病毒感染诱导。为了解决这些问题，我们定量了急性感染淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）小鼠的病毒特异性CD4 Th1（白细胞介素2[IL-2]和γ-干扰素）和Th2（IL-4）反应。使用两种敏感的检测方法（酶联免疫斑点检测和细胞内染色）来测量单细胞水平的细胞因子生成，我们发现CD4 Th1和Th2反应都是在LCMV原发感染期间诱导的。在反应的峰值（第8天），LCMV特异性CD4 Th1细胞的频率为1/35至1/160 CD4 T细胞，Th2细胞的频率是1/400。病毒清除后，病毒特异性CD4 T细胞的数量下降到1/260到1/3700，然后无限期地保持在这个水平。在用LCMV重新激发后，CD4 Th1和Th2记忆细胞在体内都产生了记忆反应。这些结果表明，与某些只出现Th1或Th2反应的微生物感染不同，急性病毒感染可诱导具有长期记忆的混合CD4 T细胞反应。
CD4 T细胞在病毒免疫中起着重要作用。在水疱性口炎病毒、甲型流感病毒和仙台病毒等病毒感染中，CD4 T细胞帮助B细胞分泌中和抗体，促进病毒清除。一些抗病毒CD8 T细胞反应严重依赖于CD4 T细胞的帮助。这些包括对腺病毒、慢性淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）的反应(24)、单纯疱疹病毒(17)和γ-疱疹病毒-68或MHV-68(10)感染。即使在急性LCMV感染中，CD4基因敲除小鼠（CD4−/−)与CD4相比，小鼠产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）减少了两到三倍+/+在初级反应期间，小鼠的抗病毒记忆CTL数量随着时间的推移逐渐下降(36). 发现功能性CD4 T细胞反应（CD4缺失或CD4−/−小鼠）不能产生大量CTL，也不能控制快速复制的LCMV菌株(24). 在人类中，与人类免疫缺陷病毒感染相关的T辅助细胞数量的减少与病毒特异性CD8 CTL的丢失以及病毒滴度的增加和对其他传染源的敏感性有关。除流感病毒和仙台病毒感染小鼠外(14,32)，对于系统性病毒感染后病毒特异性CD4 T细胞的初始爆发大小以及CD4记忆库的大小，我们知之甚少。
此外，对病毒感染后产生的CD4 T细胞类型知之甚少。在抗原刺激后，T辅助细胞的发育沿着两条路径进行：一条导致T辅助细胞1型（Th1）细胞的形成，另一条导致Th2细胞的形成（参考文献综述1和26). Th1细胞和Th2细胞可以通过其细胞因子谱的差异来区分。Th1细胞分泌IL-2、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β（淋巴毒素-α）和γ干扰素（IFN-γ），并协助激活CD8 T细胞和巨噬细胞，促进免疫球蛋白G（IgG）抗体类转换为IgG2a同种型，而Th2细胞产生IL-4、IL-5，和IL-10，促进B细胞活化和IgG1抗体的形成。每个辅助T细胞亚群支配着另一个，因为由一个亚群产生的细胞因子对另一个子群的细胞因子产生负调节。大型利什曼原虫小鼠感染为这些对立的T辅助细胞的生物学意义提供了一个例子：易产生高水平Th1细胞因子的小鼠对这种细胞内寄生虫作出反应，从而解决了感染，而易产生较少IFN-γ的小鼠易感(15). 另一个例子是，小鼠自身免疫性疾病实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）是由自身反应性Th1细胞诱导的(20). 诱导Th2细胞和细胞因子改善疾病(11,18). 尽管仍有争议，但据报道，人类免疫缺陷病毒感染者在疾病进展过程中从Th1表型转变为Th2表型(12)，并且不知道为什么会发生这种变化。目前还不清楚产生了多少Th1和Th2细胞，什么机制控制着一种类型的发育，以及这在急性病毒感染中的生物学意义。
在本报告中，我们记录了LCMV感染小鼠中病毒特异性CD4 T细胞的激活和扩增以及CD4 T淋巴细胞记忆的寿命。我们的报告显示，到感染后1周，病毒特异性IFN-γ分泌CD4 T细胞扩张，导致1/35的CD4 T淋巴细胞出现频率，然后在接下来的2至3周内下降到1/260的CD4 T-细胞。该数量在感染后至少250天内保持稳定，免疫小鼠能够在再次激发后加速次级CD4反应。大多数LCMV特异性T细胞为Th1型，但也产生并维持了大量Th2 CD4 T细胞。鉴于CD4 T细胞在帮助产生和维持记忆CTL反应和B细胞反应中的中心作用，我们的数据表明，以CD4辅助细胞为靶点的疫苗策略可能有助于增加这些细胞的数量，以对抗病毒感染的保护性记忆反应。
材料和方法
老鼠。
C57BL/6型(H-2型b条)这些老鼠是从缅因州巴尔港的杰克逊实验室购买的。如前所述，这些实验中使用的C57BL/6载体小鼠是在埃默里大学生产和繁殖的(4). 这些小鼠是先天性感染，在主要组织相容性I类（MHC I）和MHC II分子的背景下表达病毒蛋白。
病毒。
在这些小鼠感染研究中使用了LCMV的Armstrong CA 1371株(5). 用Vero细胞斑块试验定量血清和肝脏中的感染病毒(5).
流式细胞术。
用识别CD8（克隆53-6.7）、CD4（克隆RM4-5）和CD44（克隆IM7）的抗体对脾细胞进行染色，抗体浓度为1μg抗体/106细胞。这些抗体购自Pharmingen（加利福尼亚州拉霍亚）。用于测量凋亡细胞的膜联蛋白V荧光素异硫氰酸盐（FITC）购自Pharmingen，并遵循制造商推荐的方案。
CD4 T细胞富集。
用CD4富集柱通过阴性选择富集CD4 T细胞。小鼠CD4亚群柱试剂盒从研发系统（明尼阿波利斯，明尼苏达州）购买，并使用制造商建议的方案。流式细胞术显示，根据该方案，CD4 T细胞纯度>80%，CD8 T细胞数量<0.5%。作为对CD8 T细胞污染水平的额外检查，在一些实验中，将MHC I限制性肽NP396-404添加到CD4细胞富集的培养物中，并通过酶联免疫斑点分析（ELISPOT）定量病毒特异性CD8 T细胞的数量。通过该测试，在富含CD4 T细胞的培养物中，几乎没有检测到高于背景水平的CD8 T细胞污染。柱富集后恢复的CD4 T细胞数量是加载到柱上的初始数量的25-50%。对柱富集前后CD44表达的分析表明，在富集过程中CD44hi亚群（活化）细胞相对丢失（数据未显示）。
病毒特异性IFN-γ分泌CD8和CD4 T细胞的定量。
用IFN-γELISPOT试验测定病毒特异性CD8和CD4 T细胞反应(13,30)使用LCMV免疫小鼠的全脾细胞或CD4纯化制剂。本试验的捕获抗体，大鼠抗鼠IFN-γ（克隆R4-6A2；Pharmingen），以2μg/ml（100μl/孔）的速度用在酯化纤维素底板中（法国米利波）。将稀释的效应细胞添加到平板中后，以5×10的比例添加饲养细胞（1200-rad照射的未感染小鼠脾细胞）5保持细胞间的接触。效应细胞在37°C下孵育36小时，无需（单独培养基）或有刺激。为了刺激，携带小鼠脾细胞或纯化的LCMV肽与MHC I结合并能特异性刺激CD8 T细胞反应(25,35)或与MHC II类（阿姆斯特朗的NP309-328和GP61-80）结合且仅刺激的LCMV肽I-A公司b条-限制性CD4 T细胞反应(27)使用了。培养期结束后，通过在磷酸盐缓冲盐水–吐温（0.05%）中清洗平板来去除细胞，然后以4μg/ml（100μl/孔）的速度添加生物素化抗鼠IFN-γ（克隆XMG1.2；Pharmingen）。在4°C下培养过夜后，去除未结合抗体，并添加辣根过氧化物酶-亲和素D（密苏里州圣路易斯Sigma）。用底物3-氨基-9-乙基-咔唑（Sigma）和0.015%的H形成斑点2O（运行）2每个斑点代表一个IFN-γ分泌细胞，这些细胞的频率可以通过将每个孔中计数的斑点数除以该稀释度下的细胞总数来确定。未感染的脾细胞含有IFN-γ产生细胞，频率≤2/106有或无刺激的细胞。以0.1μg/ml的最终浓度使用MHC I限制性肽NP396-404、GP33-41和GP276-286刺激CD8 T细胞，以1.0μg/ml最终浓度使用MHz II限制性肽NP309-328和GP61-80刺激CD4 T细胞。
病毒特异性IL-2和IL-4分泌CD4 T细胞的定量。
ELISPOT检测IL-2或IL-4分泌CD4 T细胞的方法与IFN-γELISPOT检测方法相同。用或不用载体脾细胞刺激刺激感染小鼠的纯化脾CD4 T细胞。用于IL-2 ELISPOT分析的捕获抗体，即纯化的抗小鼠IL-2（克隆JES6-1A12；Pharmingen），以8μg/ml的浓度使用，生物素化的抗小鼠IL-2检测抗体（克隆JES6-5H4；Pharmingen）以4μg/ml（100μl/well）的浓度使用。以4μg/ml的浓度使用纯化的抗小鼠IL-4（克隆BVD4-1D11；Pharmingen）作为IL-4 ELISPOT的捕获抗体，以4μg/ml的浓度使用生物素化的抗小鼠IL-4（克隆BVD6-24G2；Pharmingen）。未受感染的脾细胞含有分泌IL-2的细胞，频率<2/106细胞和IL-4分泌细胞，频率<2/106细胞。
细胞因子ELISA。
使用从Genzyme Diagnostics（马萨诸塞州剑桥）购买的细胞因子特异性ELISA试剂盒进行细胞因子ELISA，并按照制造商的建议进行检测和分析。ELISA使用带有适当过滤器的Bio-read Microplate阅读器3550（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad）进行读取。
细胞内IFN-γ染色。
脾细胞（106用培养基或NP309-328和GP61-80（1.0μg/ml）在体外用brefeldin A（Golgestop；Pharmingen）刺激96周平底板中每孔的细胞5小时。然后收获它们，在含有1%BSA和0.2%叠氮化钠的PBS中洗涤一次，并用藻红蛋白结合的单克隆抗CD4抗体（克隆RM4-5；Pharmingen）染色。清洗未结合抗体后，根据制造商推荐的方案，用细胞固定/细胞精染色试剂盒（Pharmingen）对细胞进行渗透和细胞内IFN-γ染色。对于细胞内IFN-γ染色，我们使用FITC-偶联的单克隆大鼠抗小鼠IFN-γ（克隆XMG1.2）及其对照同型抗体（大鼠IgG1）（Pharmingen）(25).
T细胞周转率分析。
如前所述，在饮用水（0.8mg/ml）中给小鼠喂食溴脱氧尿苷（BrdU；Sigma Chemical Co.）1周(33). BrdU是一种核苷类似物，被掺入细胞的DNA中，细胞在标记期间分裂（周转）。含有BrdU的细胞可以通过染色鉴定。首先用上述抗CD4和抗CD44抗体对细胞进行表面染色，然后在4°C下用67%乙醇固定30分钟。在室温下用含0.01%吐温20的1%多聚甲醛渗透30分钟后，在室温下将细胞与50个DNAse I（Sigma Chemical Co.）的Kunitz单位孵育10分钟。然后用FITC–anti-BrdU（Becton Dickinson，Mountain View，Calif.）对其进行染色，然后进行流式细胞仪分析。
结果
激活和扩增CD4 T细胞。
为了研究病毒感染期间的初级CD4 T细胞反应，用2×105流式细胞术分析LCMV Armstrong株的PFU和T细胞反应。与以前的报告一致(2,6,21,37)，产生了大量CTL，感染在感染后第8天得到控制，如血清和肝脏的斑块测定所示（数据未显示）。图显示感染后表达活化标记CD44的CD4 T细胞数量发生了变化。在幼年小鼠中，大多数细胞属于CD44lo亚群（静止），但CD44hi与CD44lo的比值从第0天的0.5变为第8天的3.7。随着对LCMV的免疫反应减弱，该比率在第15天变为1.9，并在第30天达到～0.9的稳态。
激活CD4 T细胞。感染后第0天、第8天、第15天和第30天，对小鼠的脾细胞进行CD4和CD44染色。显示了具有代表性的流式细胞术分析。注意，当表达CD44的CD4 T细胞比例增加时，CD4 T淋巴细胞被激活。由于感染后第8天在脾脏中发现的大多数扩张是由于CD8 T细胞引起的，因此CD4 T细胞的相对百分比似乎下降。有趣的是，这些细胞的激活与CD4荧光强度的增加有关，因为CD4的密度高于未激活细胞。数字表示每个象限中单元格的百分比。
激活还与细胞数量增加有关。活化的CD44hi CD4 T细胞数量从4×10增加6第0至8×10天的每个脾脏6第8天和第13×10天的每个脾脏6第15天（图。A） ●●●●。相反，感染后CD44lo CD4 T细胞的数量变化不大。第8天时细胞数量略有减少，但细胞数量恢复到～9×106到第30天。图B显示，CD8 T细胞在同一小鼠中的细胞数量增加更为明显。CD44hi-CD8 T细胞数量从3×10增加6每幼年脾脏45×106感染后第8天，每个脾脏的CD4 T细胞数量增加了五倍。
LCMV感染后T细胞膨胀。对感染后不同时间点的小鼠脾细胞进行CD4、CD8和CD44染色，并通过流式细胞术测定活化（CD44hi）或静止（CD44lo）的T细胞数量。数据来自四个以上的实验，每个时间点包括6到15只小鼠。误差条显示标准偏差。
为了研究细胞数量的增加是否是由于细胞分裂，在感染的第一周，在小鼠的饮用水中喂食BrdU，并通过流式细胞术测量掺入BrdU的CD4 T细胞的数量。图显示在对感染有反应的小鼠中，84%的CD44hi CD4 T细胞在第0天到第8天期间分裂，而来自幼年小鼠的CD44hi细胞只有43%分裂。CD44lo细胞不会因感染而增殖，这些BrdU阳性细胞的数量（7%）与幼年小鼠的数量（6%）相当。这些数据表明，CD44hi细胞之间存在病毒诱导的细胞分裂，脾脏中活化的CD4 T细胞数量的增加代表T细胞的扩张，而不是向该部位募集。
病毒感染后CD4 T细胞的体内增殖。在初级阶段（第0-8天），通过分裂T细胞在幼年小鼠和对LCMV感染有反应的小鼠中测量BrdU掺入。对活化和静止的CD4 T细胞（顶部）进行BrdU掺入分析（下文）。如图所示，84%的活化CD4 T细胞在感染小鼠中掺入BrdU，而在幼稚小鼠中只有43%的活化CD4 T细胞为BrdU阳性。这表明CD4 T细胞在感染后分裂为CD44hi。相反，静止（CD44lo）CD4 T细胞在BrdU掺入方面对感染的反应没有变化。喂食BrdU的小鼠中活化与非活化CD4 T细胞的比率低于感染对照小鼠。活化细胞的数量略有减少，很可能是由于这种化合物在将其纳入DNA的细胞中的低毒性。
长期CD4 Th1记忆的发展。
为了量化感染后病毒特异性CD4 Th1细胞的数量，通过柱富集纯化脾CD4 T细胞，并在病毒再刺激后用IFN-γ和IL-2 ELISPOT分析。到第8天，分泌IFN-γ的LCMV特异性CD4 T细胞的频率增加到1/162 CD4 T淋巴细胞（图。A） ●●●●。该频率对应于1.1×105每个脾脏的病毒特异性CD4细胞。
记忆CD4 T细胞的产生和维持。在感染LCMV后的不同时间处死小鼠，如图所示，对CD4 T细胞进行柱纯化并用细胞因子ELISPOT进行分析。可以看出，CD4 T细胞反应有三个明显的阶段：激活（第0天到第8天），病毒特异性T细胞膨胀到4×105至6×105每个脾脏；死亡（第8至30天），其中90%的T细胞死亡；和记忆（>30天），其中病毒特异性CD4 T细胞数量增加。这些特征可见于分泌IFN-γ的CD4 T细胞（A）、分泌IL-2的细胞（B）和分泌IL-4的细胞（C）。显示的数字是分泌细胞因子的CD4 T细胞占CD4 T总细胞的频率。注意，记忆CD4 T细胞的数量没有随着时间的推移而减少。误差条代表标准偏差，检测极限用虚线表示。
CD4应答高峰后，有87-95%的病毒特异性CD4 T细胞死亡。在此期间，CD4 T细胞的Annexin V染色表明，在同一试验中，约40%的CD4 T淋巴细胞发生凋亡，10至15%的幼年小鼠的CD4 T细胞发生凋亡（数据未显示）。感染后1至2个月，分泌IFN-γ的记忆性CD4 T细胞的频率从1/1100到1/3246，相当于4×10三至3×104每个脾脏（图。A） ●●●●。即使在6个月时，分泌IFN-γ的记忆性Th1 CD4细胞（5×10三每个脾脏）。
Th1应答也通过IFN-γELISPOT在表位水平上进行定量。图A显示，在反应的峰值（第8天），5×105每个脾脏的CD4 T细胞（1/38 CD4）识别LCMV GP61-80和1.3×105每个脾脏的CD4 T细胞（1/139）识别LCMV NP309-328。在免疫小鼠（第150天）中，识别这些表位的细胞较少；然而，仍有3.1×104每个脾脏的CD4 T细胞（1/336）识别GP61-80和9.0×10三每个脾脏的CD4 T细胞（1/1126）识别NP309-328，这表明两个表位都存在长期Th1记忆。有趣的是，在反应高峰和记忆阶段，识别GP61-80的细胞比识别NP309-328的细胞多出三到四倍。这表明，在死亡阶段，没有一组细胞选择性丢失，因为这两个表位特异性CD4 T细胞的数量下降了约15倍。
CD4 T细胞应答的表位特异性分析。在感染后第8天和第150天，用IFN-γELISPOT定量对LCMV GP61-80（○）或NP309-328（）应答的CD4 T细胞数量（A）。在第8天，对这两个表位作出反应的细胞数量增加。GP61-80特异性CD4 T细胞的频率为1/38，NP309-328特异性CD4T细胞的概率为1/139。免疫小鼠保留了两种特异性的较高数量的病毒特异性CD4细胞，其中1/336对GP61-80特异，1/1126对NP309-328特异。表位特异性CD4 T细胞的数量也通过IL-4 ELISPOT（B）定量。第8天，GP61-80特异性细胞的频率为1/200，NP309-328特异性细胞频率为1/600。在第150天，GP61-80的频率为1/400，NP309-328的频率为1/1620，表明两种表位特有的分泌IL-4的记忆细胞得以维持。
在用NP309-328和GP61-80重新刺激后，通过细胞内IFN-γ染色来表征LCMV特异性CD4 Th1应答。图描述了CD4 T细胞表面染色和细胞内IFN-γ染色。不到0.04%（1/2500）的原始CD4 T细胞（第0天）在刺激后产生IFN-γ（<4400/脾脏），但到第8天，2.8%的CD4 T淋巴细胞（1/36）在再刺激后生成IFN-γ，总计7.8×105每个脾脏。由于所有这些细胞都属于CD44hi亚群，这对应于1/18活化的CD4 T细胞的频率。第15天产生IFN-γ的CD4 T细胞百分比下降至0.7%（1/143），数量下降至5.9×104每个脾脏的病毒特异性细胞。之后，CD4记忆保持稳定，因为从第60天（0.3%）到第300天（0.4%），病毒特异性CD4 T细胞的百分比变化很小。在第300天，每个活化CD4细胞的记忆细胞频率为1/47，相当于4.1×104每个脾脏。
LCMV特异性CD4 T细胞的寿命。结果表明，CD4 T细胞在感染后第0、8、15、60和300天对NP309-328和GP61-80产生反应的细胞内IFN-γ。用肽刺激脾细胞5小时，然后对CD4和CD44进行表面染色，并对细胞内IFN-γ进行染色。CD4 T细胞上的流式细胞术斑点图显示IFN-γ的表达(年轴）与CD44(x个轴）。显示的数字是IFN-γ阳性的CD4细胞的百分比。在第8天LCMV特异性CD4 T细胞扩增后（IFN-γ阳性），出现下降，这可以在第15天看到。即使在第300天，第60天建立的记忆细胞的频率也保持不变。在第8天，一些CD4 T细胞即使没有刺激也能产生IFN-γ。这些可能代表体内IFN-γ阳性的活化细胞，并在整个染色过程中保留细胞因子。注意，所有对这些肽产生IFN-γ反应的CD4 T细胞都是CD44hi。
分泌IL-2的Th1细胞的数量与分泌IFN-γ的细胞的数量相似（图。B） ●●●●。有1.2×104第8天扩张期高峰时，每个脾脏中LCMV特异性IL-2分泌CD4 T细胞。到第15至30天，数量有所下降，但有大量LCMV特异性记忆细胞（4×10三每个脾脏）在感染后6个月的记忆期内保持不变。
长期CD4 Th2记忆的发展。
为了定量急性感染后病毒特异性Th2细胞的数量，对脾脏CD4 T细胞进行纯化并用IL-4 ELISPOT进行分析。类似于Th1应答，Th2应答在第8天达到峰值。此时LCMV特异性CD4 T细胞的频率为1/407 CD4 T淋巴细胞，对应于5×104每个脾脏的病毒特异性Th2细胞（图。C） ●●●●。
在峰值之后，有一段时间（第8至30天），分泌IL-4的细胞数量减少。在此之后，大量的记忆IL-4分泌细胞（2×10三至6×10三每个脾脏）在感染后至少稳定维持6个月（图。C） ●●●●。
图B显示对GP61-81和NP309-328特异的IL-4分泌细胞的数量。第8天，4×104至7×104每个脾脏的CD4 T细胞（1/200 CD4细胞）识别LCMV GP61-80和1×104至2×104每个脾脏的CD4 T细胞（1/600）识别LCMV NP309-328。在第150天，仍有1×104至3×104每个脾脏的CD4 T细胞（1/400）识别GP61-80和5×10三至7×10三每个脾脏的CD4 T细胞（1/1620）识别NP309-328。与IFN-γ分泌细胞的数量相似（图。A） 两个表位都有长期的Th2记忆，GP61-80的反应比NP309-328的反应更多。
纯化CD4 T细胞的ELISA分析表明，感染后也会产生IL-10产生细胞。在幼年小鼠中，在病毒刺激的上清液中发现<15ρg/ml，而在第8天，生成105ρg/ml。此外，150天前免疫的小鼠脾细胞在病毒刺激下产生高水平的IL-10（180ρg/ml），表明LCMV感染后产生长期CD4 Th2记忆。
CD4记忆性T细胞再激发后的记忆反应。
为了进一步证明大量记忆性T辅助细胞的存在，免疫小鼠和幼年小鼠被LCMV Armstrong株攻击，并在第3天通过荧光激活细胞分选仪和ELISPOT分析T细胞反应。与免疫对照组相比，重新激发的免疫小鼠中CD4和CD8 T细胞的活化和扩增更多，而幼年小鼠在这一早期点没有表现出活化（数据未显示）。图结果表明，虽然幼年小鼠在第3天没有产生特异性反应，免疫小鼠的病毒特异性CD4 T细胞数量增加，但重新激发的免疫小鼠的IFN-γ分泌CD4 T淋巴细胞数量增加了4.5倍，IL-2分泌记忆性CD4 T细胞数量增加（图。A和B）。再次激发后，IL-4分泌细胞的频率也增加（图。C） ●●●●。这表明，免疫小鼠体内存在的Th1和Th2细胞在再次感染后数量迅速增加。
免疫小鼠在再激发后产生加速的CD4 T细胞反应。提前3个月用2×10免疫小鼠5LCMV Armstrong的PFU被重新命名为106LCMV的PFU（腹腔内）。在再次激发后第3天，通过IFN-γELISPOT（A）、IL-2 ELISPOT（B）和IL-4 ELISPOT-（C）分析纯化的脾CD4 T细胞。免疫小鼠在第3天产生加速免疫反应（次要）。相反，接受挑战剂量的幼稚小鼠此时没有反应。显示未重新接种的免疫小鼠进行比较。
讨论
该报告显示，CD4 T细胞反应与CD8 T细胞反应一样，在病毒感染后有三个阶段：激活和扩张阶段发生在感染的第一周，死亡阶段发生在第二周，记忆阶段开始于感染后1个月，持续至少300天。
在感染后的第一周，病毒特异性CD4 T细胞数量的增加很可能是由于细胞克隆的扩增，而不是细胞从其他部位募集到脾脏。所有能产生IFN-γ的病毒特异性CD4 T细胞都是CD44hi（图。)，并且在此期间只有CD44hi细胞分裂（图。). 感染后第8天，Th1细胞形成高频率，如三种独立的检测（IL-2 ELISPOT、IFN-γELISPOT和细胞内IFN-γ染色）所示。IFN-γELISPOT（图。)和细胞内IFN-γ染色（图。)两者均表明，LCMV NP309-328-或GP61-80特异性细胞的频率为1/35至1/40 CD4 T细胞或～1/20活化的CD4 T淋巴细胞。表位分析表明5×105每个脾脏的细胞对GP61-80和1×10具有特异性5特定于第8天的NP309-328（图。). 病毒特异性IFN-γ分泌CD4 T细胞的总数可能高于此处报道的数量，因为只有两个I-A公司b条-使用限制性表位。CD4反应的特异性可能包括尚未确定的其他表位。
通过肽刺激非富集细胞（1/30）和病毒刺激CD4富集培养物（1/162）评估的病毒特异性CD4 T细胞的IFN-γELISPOT估计值略有差异。这可能代表了体外培养期间抗原提呈水平的差异。向培养物中添加肽可能会使呈现该特定肽的MHC II分子的数量饱和，从而更有效地刺激T细胞。另一种解释是，一些活化的CD4 T细胞在柱富集过程中丢失，因为浓缩后CD44hi细胞的百分比下降，而浓缩前CD44 T细胞的百分比则下降（数据未显示）。鉴于大多数肽特异性细胞都在CD44hi人群中，使用柱纯化CD4 T细胞可能低估了实际频率。
死亡阶段发生在感染后2至4周。Annexin V染色显示凋亡CD4增加了三倍+这一时期的T细胞比幼年小鼠的T细胞多。在此期间，病毒特异性IFN-γ和IL-4分泌CD4细胞的数量下降了87%至95%，反映了CD8 T细胞反应的情况(三,6,21,25). 表位分析表明，NP309-328特异性CD4 T细胞的数量与GP61-80特异性CD4T细胞的下降相似，并且两组在第8天到第150天之间都下降了约15倍。在第8天，GP61-80的特异性细胞是NP309-328的三到四倍，并且该比率在免疫小鼠中保持不变。
1个月后建立的CD4 T细胞记忆在感染后6至10个月内保持稳定。这可以通过使用单细胞细胞因子ELISPOT分析、ELISA分析和细胞内IFN-γ染色，然后进行流式细胞术定量来观察。免疫小鼠体内持续存在的所有病毒特异性CD4 T细胞都是CD44hi（图。)和CD69lo（数据未显示），表明它们是记忆细胞而不是最近激活的效应细胞（CD69hi）。小鼠在再次感染LCMV时也能够产生快速的次级CD4 T细胞反应。CD4 T细胞记忆的寿命与CD8 T细胞相当，但在数量上低了约10倍。记忆CD4 T细胞的数量可能是由扩张期的大小决定的，并且由于CD4细胞的扩张比CD8细胞少，所以记忆池的大小设置得更低。我们实验室的研究(25)以及其他(9)研究表明，感染后扩增的活化CD8 T细胞中，大多数（50%至70%）是针对LCMV的。本报告中显示的数据表明，LCMV特异性CD8 T细胞的扩增是LCMV特异性CD4 T细胞的35倍。如图所示。B、 即使感染后扩增的所有活化CD4 T细胞都是LCMV的特异性细胞，但T辅助细胞室的爆发大小仍将大约小五倍。
Th2反应表现出与Th1反应相似的扩张、死亡和记忆模式。感染后，IL-4分泌细胞增加，在第8天达到峰值，为4.5×104每个脾脏分泌IL-4的CD4 T细胞（图。C） ●●●●。ELISA分析表明也产生了产生IL-10的CD4 T细胞。在第8天到第30天期间，分泌IL-4的细胞数量下降，随后是一段记忆期，在此期间，病毒特异性细胞数量保持增加。然而，在任何时候，分泌IL-4的CD4细胞都少于分泌IFN-γ的CD4。如图所示。Th1细胞的频率始终高于Th2细胞的2.0倍。考虑到抗体同型分布，大多数T辅助反应由Th1细胞组成并不奇怪。所制备的依赖T细胞的抗病毒IgG抗体中有70%是IgG2a同型(37). Th2应答导致IgG1同型转换，LCMV感染后，IgG应答的较小成分（10%）属于这一类。
许多微生物感染导致Th1或Th2 CD4 T细胞反应。单核细胞增生李斯特菌,L.主要、和弓形虫感染倾向于诱导Th1反应；蠕虫感染倾向于引发Th2反应(28). 相反，急性LCMV感染后，Th1和Th2细胞混合形成，感染后Th1和Th2记忆都存在很长时间（图。和). 其他人也报道了LCMV感染后细胞因子产生的混合反应(29). IL-12和IFN-γ已被证明是启动和促进Th1发育的重要分子。由于LCMV是嗜巨噬细胞的，因此最初的抗病毒Th1反应可能由产生IL-12的活化巨噬细胞驱动(7,34)和产生IFN-γ的NK细胞。然而，这种Th1反应并不妨碍Th2的发育，因为也可以发现大量分泌IL-4的细胞。此外，在感染早期可能存在一些同时产生IFN-γ和IL-4的CD4 Th0细胞。对于急性感染小鼠中Th2反应如何发展，有几种可能的模型。Th2应答可能是由抗原特异性T细胞在初始激活后产生的低水平IL-4驱动的。根据一个模型，如果IL-4水平达到阈值，Th2分化就会启动，导致IL-4生成增加，从而导致额外的Th2细胞形成(1). LCMV感染后，可能达到了该阈值，导致Th1应答外出现明显的Th2应答。
在另一种T辅助细胞发育模型中，抗原负荷和协同刺激水平影响Th1或Th2分化。暴露于高抗原水平和接受高协同刺激的Th0细胞发育为Th2细胞，而暴露于低抗原水平（或低剂量感染）和低协同刺激水平的Th0淋巴细胞发育为Th1细胞(8,16,23,31). 由于急性病毒感染是一个动态过程，在第2至4天时抗原负荷较高，随后抗原水平较低(21)，有利于每个辅助T细胞亚群发育的条件可能随着感染后的时间而变化。T辅助细胞分化也可能受到共刺激类型的影响。据报道，在T辅助细胞发育的EAE模型中，B7.1和B7.2差异驱动Th1或Th2的发育(19)以及在自身免疫的NOD模型中(22). LCMV感染期间，脾脏中的B7.1和B7.2水平升高，可能会发生类似的机制（未发表的观察结果）。对感染LCMV的小鼠进行抗B7.1或抗B7.2抗体治疗的阻断研究应揭示这种机制对抗病毒T辅助细胞的发育是否重要。
记忆性CD4细胞通过促进中和抗体的产生和帮助CD8 CTL增殖，有助于病毒清除。它们也可能通过分泌IFN-γ来抑制病毒复制，并通过激活巨噬细胞来抵抗病毒感染和复制，从而发挥直接作用。这是首批量化CD4 T细胞反应初始爆发大小的研究之一，该研究表明急性病毒感染时存在长期Th1和Th2记忆。未来的研究将涉及控制记忆CD4 T细胞维持的激活要求和规则。这一信息可能会改进预防病毒感染的疫苗接种策略。
致谢
J.K.W.和M.S.A.为这项工作做出了同等贡献。
我们感谢Rita J.Concepcion、Morry Hsu、Mary Kathryn Large和Kaja Madhavi-Krishna提供的出色技术援助。
这项工作得到了NIH向R.A.M.S.Asano提供的AI 30048和NS 21496赠款的支持，并获得了退伍军人事务部的助理研究员奖和国家多发性硬化学会的博士后奖学金。M.Suresh得到了国家多发性硬化学会博士后奖学金的支持。
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