《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8273–8280.
CD28共刺激后，幼稚和记忆CD4 T细胞对人类免疫缺陷病毒1型感染的易感性不同：对传播和发病机制的影响
,1 ,2 ,三 ,2 ,2 ,2和2,*
詹姆斯·莱利
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
布鲁斯·莱文
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
南希·克雷赫德
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
塔拉·弗朗索马诺
马里兰州罗克维尔沃尔特·里德陆军研究所逆转录病毒科20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
师丹尼尔·金
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
理查德·G·卡罗尔
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
卡尔·H·琼
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
马里兰州罗克维尔沃尔特里德陆军研究所逆转录病毒科，邮编：20850，1和亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会、美国军事艾滋病毒研究计划、，2海军医学研究所免疫细胞生物学项目，三马里兰州贝塞斯达20889
1998年5月4日收到；1998年7月13日接受。
摘要
体外证据表明记忆CD4+细胞优先感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），但对HIV-1感染者的研究未能检测到优先记忆细胞耗竭。为了探索这个悖论，我们刺激CD45RA+CD4细胞+（幼稚）和CD45RO+CD4细胞+（记忆）细胞，并用CCR5依赖性（R5）或CXCR4依赖性（X4）HIV-1分离株感染它们。天真的CD4+与记忆细胞相比，细胞支持的X4 HIV复制更少。然而，幼稚细胞易受R5病毒感染，而记忆细胞仍对感染和病毒复制具有抵抗力。与未分离的细胞一样，在感染前将原始细胞和记忆细胞混合，导致细胞对R5感染具有抵抗力，对X4感染高度敏感。虽然幼稚和记忆CD4+亚群下调CCR5表达以响应CD28共刺激，只有记忆细胞在刺激后产生高水平的β-趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β。中和这些β-趋化因子产生记忆CD4+对R5 HIV-1分离株感染高度敏感的细胞，表明CCR5的下调不足以介导对CCR5 HIV-1毒株的完全保护。这些结果表明，对R5 HIV-1分离株的敏感性不仅取决于CCR5表达水平，还取决于CCR 5表达和β-趋化因子产生的平衡。此外，我们的结果提示了一种HIV-1传播和发病机制的模型，其中幼稚而非记忆性CD4+T细胞是HIV-1早期复制的靶细胞。
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染伴有CD4缺失+T淋巴细胞与免疫功能的进行性丧失(26). CD4细胞+T淋巴细胞是一个异质人群，关于HIV-1是否针对特定CD4存在争议+要消除的子类型(18,53). 在某种程度上，这场争论的焦点是CD4是幼稚的还是记忆的+细胞亚群优先被HIV-1耗尽。天真的CD4+T淋巴细胞以前没有接触过抗原；暴露于同源抗原后，细胞增殖并获得效应器功能。激活细胞的一个子集恢复到静止状态，此时称为记忆细胞(61). 典型的，幼稚细胞是CD45RA+CD45RO公司−对有丝分裂刺激的反应具有更大的钙通量和增殖能力，而记忆细胞是CD45RO+CD45RA−并且有更广泛的细胞因子表达谱(7). 幼稚细胞几乎只存在于次级淋巴器官中，而记忆细胞的组织分布更广。这些不同的分布被认为是由于记忆细胞上粘附分子表达水平较高所致(41).
在体外，记忆细胞更有效地感染HIV-1(31,55,58,60,67)而且它们更容易受到艾滋病毒诱导的细胞病变影响(15,70). 然而，大多数对HIV-1血清转换器的研究要么表明这两种亚型都没有特异性缺失(14,29,42,50,51,62)或表明幼稚细胞的特定耗竭(5,6,54). 体外研究的一个主要局限性是几乎只使用CXCR4依赖型（X4）病毒。X4病毒，也称为合胞体诱导型或T细胞嗜性病毒，使用α-趋化因子受体CXCR4作为共受体(27). CXCR4依赖型病毒在HIV感染过程中出现较晚，并且比CCR5依赖型（R5）病毒更容易引起细胞病变(21). R5病毒，也称为非同步诱导病毒或嗜巨噬细胞病毒，使用CCR5作为共受体(三,13,23–25). R5病毒对传播至关重要，在感染的早期、无症状阶段占主导地位(45,68). 因此，迄今为止，对传播至关重要的病毒分离物（R5病毒）很少用于体外急性感染模型系统。
而病毒进入CD4需要辅受体表达+细胞，生产性HIV感染需要细胞激活和进入G1细胞周期的b期(35,69). T细胞的激活和增殖至少需要两个信号(9). 在主要组织相容性复合体II类环境中呈现的抗原通过触发T细胞受体-CD3复合体提供第一个信号。共刺激信号的传递是通过连接CD4上的CD28共受体来完成的+电池表面(33). 以前，我们已经证明，抗CD3/CD28刺激导致指数型多克隆T细胞生长(37,38). 此外，它使细胞对R5 HIV分离物的感染具有抵抗力。这种HIV耐药状态是由于天然CCR5配体（RANTES、MIP-1α和MIP-1β）表达增加以及伴随的CCR5表达下调所致(12,52). 在本报告中，我们试图检测CD3/CD28共刺激或有丝分裂凝集素激活的幼稚和记忆细胞对HIV的敏感性。我们报告说，对R5病毒的敏感性不仅取决于CCR5表达水平，而是取决于CCR 5表达和β-趋化因子表达之间的平衡。总之，这些发现提示了一种关于辅受体表达在HIV传播和发病机制中的作用的新机制。
材料和方法
抗体。
以下纯化的无叠氮抗体用于细胞纯化：抗CD8 OKT8（免疫球蛋白G2a[IgG2a]）、抗CD11b OKM1（IgG2b）、抗CD14 63D3（IgG1）、抗CD 16 3G8（IgGl）、抗CD20 1F5（IgG2a）和抗HLA-DR 2.06（IgG 1）。所有的杂交瘤都是从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得的，除了3G8，它是Stephen Shaw（马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院）赠送的礼物。CD45RA和CD45RO单克隆抗体来自Caltag（加利福尼亚州伯林盖姆）。抗CD3（OKT3[IgG2a]）(36)和抗CD28（9.3[IgG2a]）(30)用于细胞刺激。β-趋化因子中和抗体（NAbs）购自R&D Systems（明尼苏达州明尼阿波利斯）。
细胞分离和刺激。
通过Percoll（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）梯度离心法分离外周血淋巴细胞，该方法是通过健康供体的分离获得的白血球。CD28编号+CD4细胞+如前所述，使用磁珠（Dynal，Lake Success，纽约）通过阴性选择纯化T细胞(34). 纯化CD28+CD4细胞+T细胞，>98%CD3+，>98%CD28+和<3%CD8+通过流式细胞术判断，分离为CD4+CD45RO公司+和CD4+CD45RA+如前所述，通过否定选择进行子集(39). 这些制剂通常纯度大于95%。最近的报告表明，通过选择CD45RA，原始细胞进一步富集+CD62L型+单元格(47). 然而，本研究中使用的供体细胞通常<3%CD45RA+CD62L型−，无需进一步净化。细胞在10岁时培养6/ml完全培养基RPMI 1640（Bio Whittaker，Walkersville，马里兰州）中添加10%胎牛血清（Hyclone，Logan，犹他州）–2 mM我-谷氨酰胺（Bio-Whittaker）–20 mM HEPES（Bio Whittake）。OKT3和9.3刺激细胞，它们共价连接到磁珠（tosyl-activated M-450；Dynal）上，每个磁珠约150 fg(38)并以1:1的比例添加到单元格中。或者，用5μg植物血凝素（PHA）（密苏里州圣路易斯Sigma Chemical Co.）和100 U白细胞介素2（IL-2）（印第安纳波利斯Boehringer Mannheim）/ml刺激细胞。在Coulter计数器模型ZM（佛罗里达州Hialeah Coulter）上监测细胞体积。以2至3天的间隔给药细胞，并将其维持在106至2×106细胞/ml。
流式细胞荧光分析。
样品在4°C下用抗CD45RA–异硫氰酸荧光素、抗CD45RO–藻红蛋白（PE）（加利福尼亚州圣何塞Becton Dickinson）、抗CXCR4–PE和抗CCR5–PE（加利福尼亚州圣地亚哥Pharmingen）染色30分钟。在磷酸盐缓冲液-0.01%叠氮化钠-0.05%牛血清白蛋白（洗涤缓冲液）中洗涤后，用0.1%多聚甲醛在4°C下固定染色细胞。对未固定的新鲜抗-CCR5和抗CXCR4染色细胞进行分析。根据标准光散射直方图（积分前向散射与对数90°）对活淋巴细胞进行门控后，在Coulter Epics Elite上通过流式细胞仪对样本进行分析。
急性感染和PCR/液体杂交程序。
刺激6天后，细胞感染了HIV-1美国-1(43)或HIV-1NL4-3型(1)如前所述(12,52). 在感染开始之前立即去除抗体包被的珠子。每次感染5×106将细胞重新悬浮在400μl含10%的50%条件培养基中4至3×10450%的HIV-1组织培养感染剂量。将细胞在37°C下孵育2 h，在完整培养基中洗涤三次以去除多余的病毒，并在106/毫升。如有指示，在感染开始前，将β-趋化因子的NAb与条件培养基预孵育2小时。抗RANTES NAb的使用浓度为100μg/ml，而抗MIP-1α和抗MIP-βNAb的最终浓度为50μg/ml。山羊IgG（Sigma）被用作最终浓度为200μg/ml的对照抗体。抗体浓度在实验期间保持不变。在指定的时间点，106通过离心将细胞制成颗粒，并在−70°C下冷冻。使用HIV裂解细胞颗粒并通过PCR扩增堵住-特异性引物，通过与放射性标记的内探针杂交检测扩增序列(64,65). 杂交产物在10%聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行解析，暴露在磷光成像仪屏幕上1小时，并在磷光显像仪445 SI（加利福尼亚州森尼维尔市分子动力学）上进行显影。为了确保反应在分析的线性范围内进行，记录HIV的增量堵住质粒标准物同时扩增（数据未显示）。PCR扩增人β-珠蛋白序列，以证明每个PCR反应混合物中存在同等水平的输入DNA(64,65). 使用ImageQuant软件（分子动力学）生成数字。
趋化因子测量。
根据制造商的说明，使用研发系统的酶联免疫吸附分析试剂盒测量细胞上清液中的MIP-1α、MIP-1β和RANTES水平。
趋化因子受体RT-PCR分析。
使用RNA STAT-60（Tel-Test，Friendswood，Tex）从细胞中分离出总RNA，并使用StrataScript逆转录酶PCR（RT-PCR）试剂盒（Stratagene，La Jolla，Calif.）合成cDNA。cDNA产物在H中稀释2O至预定的最佳浓度（CCR5为1:3，CXCR4为1:300），并使用以下程序进行放大：95°C 30 s，55°C 30秒，72°C 90 s（25个循环）。对于CCR5特异性扩增，使用以下引物：CCR5-42（5′-GGG TGG AAC AAG ATG GAT TAT CAA GTG TCA-3′）和CCR5-640（5′-ATG TCT GGA AAT TCT TCC AGA ATT GAT ACT-3′）。对于CXCR4特异性扩增，使用以下引物：CXCR4-489（5′-CCA CCA ACA GTC AGA GGC CAA GGA AGC TGT-3′）和CXCR4-1122（5′-TCT GTG TTA GCT GGA GTG AAA ACT TGA AGA-3′）。如前所述，对部分PCR反应混合物进行杂交(64)带有CCR5（CCR5-81[5′-GGG CTC CGA TGT ATA ATA ATT GTC ATA-3′]）或CXCR4（CXCR4-840[5′-CCA GGA GGA TGA AGG AGT CGA TGC TGA TCC-3′]）特异的末端标记寡核苷酸探针。将杂交产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离，暴露于磷光体成像仪屏幕过夜，并在磷光体成像仪445 SI（分子动力学）上显影。使用ImageQuant软件（分子动力学）生成数据。为了比较每个RNA样本的18S和28S rRNA水平，在1.5%变性琼脂糖凝胶上电泳1μg(56).
结果
CD3/CD28刺激的幼稚和记忆性CD4的分离与分化+细胞。
CD4细胞+根据CD45亚型表达将健康供体细胞分为幼稚和记忆人群。为了避免选择过程引起的任何异常激活，对细胞进行了阴性选择，并且通常纯度大于95%（图。). 根据较小的平均细胞体积和HLA-DR或CD25表达的缺失判断细胞处于静止状态（数据未显示）。在用抗CD3/抗CD28涂层磁珠刺激后，这两种磁珠都是幼稚的（CD45RA+CD45RO公司−)和存储器（CD45RO+CD45RA−)在最初的14天里，种群数量增长相当（数据未显示），尽管在较长的时间内，幼稚细胞的增长速度超过了它们的记忆兄弟(66). 刺激后，两个亚群的细胞体积都至少增加了两倍，但记忆细胞始终保持略大于幼稚细胞（数据未显示）。激活后，原始细胞从CD45RA转化+CD45RO公司−CD45RA表型−CD45RO公司+表型(17,59). 双色荧光激活细胞分选仪分析显示，刺激后6天，95%的CD45RA+CD45RO公司−细胞变成CD45RA−CD45RO公司+（图。). 然而，如下文所示，这些细胞在功能上仍与最初的CD45RA不同−CD45RO公司+人口。
幼稚和记忆性CD4的分离与分化+CD3/CD28共刺激后的细胞。CD4细胞+分离T细胞并通过阴性选择将其分为CD45RO+和CD45RA+子集。分离后（第0天）和CD3/CD28刺激6天后，对幼稚细胞和记忆细胞进行双色细胞荧光分析。所示数据代表了至少三个实验。
CD3/CD28刺激的幼稚细胞易受R5 HIV-1感染。
幼稚和记忆CD4的敏感性+用R5或X4 HIV-1分离株刺激6天后感染细胞，检测HIV-1感染的T淋巴细胞。PHA/IL-2刺激的幼稚和记忆细胞被X4 HIV-1强烈感染（图。A） ●●●●。同样，在PHA/IL-2刺激后，两个CD4细胞亚群都感染了R5病毒（图。B） ●●●●。艾滋病咨询门诊堵住感染72小时后检测到DNA，通过对两个细胞亚群的后期时间点进行分析，发现感染正在传播。同样，当PHA/IL-2刺激的幼稚和记忆CD4细胞在感染前立即结合时，混合人群对R5和X4依赖性病毒也敏感。
CD4亚群中不同的R5和X4复制动力学。纯化CD4+（CD4）、CD45RO+（RO）和CD45RA+用PHA/IL-2或CD3/CD28刺激（RA）细胞6天，并感染HIVNL4-3型（CXCR4依赖性）（A）或HIV美国-1材料和方法中描述的HIV-1（CCR5依赖）（B）菌株。在感染后0、2、72和144小时取样，并分析细胞颗粒堵住采用液体杂交的定量PCR检测DNA。所示数据代表了四个实验。
CD3/CD28刺激的幼稚和记忆细胞群，以及混合的幼年和记忆细胞，容易感染CXCR-4依赖性病毒（图。A） ●●●●。然而，根据以前的报告，与记忆细胞相比，原始CD3/CD28刺激细胞对R4依赖性感染的耐受性要低得多(15,31,58,60,67). 与之形成鲜明对比的是，感染R5病毒的CD3/CD28刺激的幼稚和记忆细胞群经历了两种完全不同的结果（图。B） ●●●●。令人惊讶的是，幼稚细胞支持弱的R5依赖性病毒感染，而记忆细胞对R5依赖分离物的感染保持完全抵抗。如之前报道的普通CD3/CD28刺激CD4+单元格(12,52)在感染R5依赖性HIV分离物之前，CD3/CD28刺激的幼稚细胞和记忆细胞汇集在一起，产生了完全耐药的细胞群。因此，当CD3/CD28刺激幼稚的CD4时+这些细胞与记忆细胞分离后，容易受到低水平R5病毒感染。此外，这表明先前报道的未分化CD4细胞未感染很可能是记忆细胞对幼稚细胞产生保护作用的结果。
HIV-1的定量分析堵住上述实验的DNA积累如图所示。在CD3/CD28刺激后，只有幼稚的CD4+细胞亚群易受R5分离的HIV感染。与PHA/IL-2刺激细胞相比，RA亚群的感染动力学延迟，而记忆亚群和重组CD4细胞群中检测到很少或没有HIV。记忆与重组CD4+CD3/CD28共刺激后，细胞支持X4病毒的高水平感染；然而，原始细胞产生10到50倍的减少堵住DNA比其他人群多。相反，依赖于X4（NL4-3）和R5（US-1）的病毒在PHA刺激后均产生高水平的CD4细胞亚群感染。结果如图所示。和进一步表明，HIV-1在初级CD4细胞亚群中的感染和复制严重依赖于所使用的HIV菌株以及T细胞激活的形式。
DNA HIV-1的定量分析堵住实验内容如图所示。。每100000个细胞的拷贝数是通过使用含有堵住序列，并将这些值归一化为β-珠蛋白值。顶部面板显示了图中的感染数据。B、 底部面板显示了图中的感染数据。答：。
共受体表达水平与共刺激CD4的敏感性无关+R5 HIV-1分离株的细胞亚群。
CD3/CD28刺激的幼稚CD4的差异易感性+R5和X4 HIV-1分离株的细胞表明，与记忆细胞群体相比，在这些细胞中，CXCR4表达降低，CCR5表达增强。以前，我们发现CD3/CD28共刺激抑制了未分化CD4中CCR5 mRNA的积累，但不抑制CXCR4 mRNA的表达+细胞群(12). 为了更详细地检查幼稚和记忆细胞群中稳态CXCR4和CCR5转录水平，开发了一种半定量趋化因子受体RT-PCR分析，如材料和方法所述。用PHA/IL-2或CD3/CD28激活记忆和幼稚细胞6天，第6天与上述实验的感染日一致，并用RT-PCR检测共受体的表达。对RT产物的两倍稀释液进行测试，以确保PCR在线性范围内。CXCR4 mRNA在PHA/IL-2和CD3/CD28刺激的细胞中都很容易检测到（图。). 在静止和激活的CD4细胞亚群中未观察到CXCR4 mRNA的显著差异，这与之前报道的该共受体的组成性表达一致(4,8,28). 然而，激活后，CD3/CD28刺激的幼稚人群的转录水平低于CD3/CD28-刺激记忆细胞的转录水平（大约四倍），这与感染和病毒复制数据一致（图。和).
趋化因子受体在CD4细胞和CD45RA中的表达+（RA）和CD45RO+（RO）亚群。从纯化的CD4中分离出总RNA+，CD45RO+和CD45RA+休息（第0天）或用PHA/IL-2或CD3/CD28免疫球刺激6天的细胞。（A） 合成cDNA并稀释至最佳水平（CCR5为1:3，CXCR4为1:300），然后在随后的PCR和液体杂交反应中使用2.5、5或10μl RT产物。NoRT表示运行10μl RT产品并省略逆转录酶的控制通道。所示数据代表了三个实验。（B） 在1.5%变性琼脂糖凝胶上电泳每个样品的一微克总RNA。
与CXCR4相比，CCR5 mRNA水平在CD4细胞亚群之间差异很大，这是细胞激活方法的结果（图。). 在静止的CD4中检测到低水平的CCR5 mRNA+而这些转录物主要局限于记忆细胞群。正如感染数据所预测的那样，PHA/IL-2刺激导致记忆和幼稚细胞群中稳态CCR5转录水平的大幅增加。CD3/CD28刺激6天后，CCR5 mRNA水平下降至静息细胞水平以下。在记忆细胞群中检测到微量CCR5 mRNA，但令人惊讶的是，尽管CCR5对R5病毒敏感，但其在幼稚细胞中的检测水平低于检测极限。因此，幼稚细胞和记忆细胞中CCR5 mRNA水平与感染敏感性无关。
通过检测幼稚和记忆细胞群中CCR5和CXCR4的表面表达，进一步探讨了CCR5 mRNA水平和对R5 HIV-1分离株敏感性之间的差异（表). CXCR4在静止细胞上的表达更为显著，在幼稚细胞上观察到优先表达，这与以前的报道一致(8,28). 根据所有亚群的平均荧光强度判断，PHA/IL-2刺激导致CXCR4表达水平上调（数据未显示），尽管表达CXCR4的细胞比例仅略有变化。CD3/CD28刺激导致所有CD4的表面CXCR4表达减少+细胞，这在幼稚细胞中最为明显。在CD3/CD28共刺激后检查的四个供体中，38%（平均标准误差[SEM]=2%）的记忆细胞表达CXCR4，而只有21%（SEM=4%）的原始细胞表达CXCR。这为为什么幼稚细胞不太容易被X4病毒感染提供了可能的解释。
表1
活化对HIV-1辅助受体细胞表面CD4细胞亚群表达的影响一
| 细胞状况（染色日） | %具有表型的细胞：
|
|---|
CD4细胞+表达：
| CD4/45RA+表达：
| CD4/45RO+表达：
|
|---|
| CXCR4系列 | CCR5号机组 | CXCR4系列 | CCR5号机组 | CXCR4系列 | CCR5号机组 |
|---|
| 正在休息（0） | 81 | 5 | 75 | 2 | 68 | 9 |
| PHA/IL-2刺激（6） | 77 | 10 | 87 | 6 | 87 | 28 |
| CD3/28刺激（6） | 32 | 1 | 29 | 1 | 41 | 1 |
静止CD4+细胞表达低表面水平的CCR5，这种表达仅限于记忆子集，这与Bleul等人最近的观察结果一致(8). 正如感染和RNA数据预测的那样，在PHA/IL-2刺激后，记忆和幼稚细胞亚群中CCR5表达增加。相反，CD3/CD28共刺激导致记忆和原始CD4细胞亚群中CCR5表达降低至背景水平，与mRNA数据一致。与mRNA表达数据一致，CD3/CD28刺激的幼稚细胞虽然易受R5病毒感染，但CCR5表达为阴性。因此，CCR5共受体表达水平不能解释CD3/CD28刺激的幼稚细胞和记忆细胞对R5 HIV-1分离株的不同敏感性。
CD3/CD28共刺激不会在记忆和初始CD4中触发等效的β-趋化因子生成+细胞。
β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES，CCR5的天然配体(57)，阻断R5 HIV-1分离株对易感细胞的感染(19). 在人类淋巴细胞中，CD28刺激上调RANTES启动子活性(46)在小鼠细胞中，CD28刺激对MIP-1α而非RANTES分泌至关重要(32). 此外，我们还证明了未分化CD4+与PHA/IL-2刺激相比，细胞在CD3/CD28共刺激下产生的CCR5配体通常多50到100倍(52). CD3/CD28刺激的幼稚细胞和记忆细胞中CCR5表达和HIV敏感性之间的不一致促使我们在CD3/CD286刺激后6天检查这些细胞亚群中β-趋化因子的产生（表). 尽管供体间MIP-1α、MIP-1β和RANTES的绝对水平不同，但在每种情况下，共刺激后上清液中β-趋化因子的积累在记忆细胞中显著高于原始细胞。到目前为止，我们还不知道样本之间分泌量的差异是否反映了供体之间的差异，或者是新生细胞群体与记忆细胞之间的差异性污染。以前，人们注意到幼稚的CD4+和CD8+抗CD3和佛波酯加离子霉素刺激的细胞产生的β-趋化因子明显少于类似刺激的记忆细胞(20). 因此，在CD3/CD28刺激的细胞亚群中，R5 HIV-1分离株的抗感染性与CCR5表达无关，而与CCR5-配体（β-趋化因子）的产生有关。
表2
CD3/CD28共刺激CD4细胞亚群后β-趋化因子的分泌一
| 供体和β-趋化因子 | β-趋化因子产生量（pg/ml）：
|
|---|
| CD4细胞+细胞 | CD4/45RA+细胞 | CD4/45RO+细胞 |
|---|
| 捐赠者1 |
| 兰特斯 | 19,768 | 4,545 | 32,899 |
| MIP-1α | 93,775 | 33,471 | 215,000 |
| MIP-1β | 196,000 | 31339个 | 270,000 |
| 捐赠者2 |
| 兰特斯 | 22,935 | 975 | 54,773 |
| MIP-1α | 180,000 | 682 | 180,000 |
| MIP-1β | 468,000 | 6,637 | 484,000 |
β-趋化因子功能的中和使CD3/CD28刺激的记忆细胞对R5病毒感染敏感。
对CD3/CD28刺激细胞中CCR5表面表达和β-趋化因子产生的分析表明，记忆细胞尽管有较高水平的CCR5表达，但仍然对R5病毒具有抵抗力，因为其高水平的β-趋化因子产生限制了感染病毒以CCR5为核心受体的能力。因此，我们假设中和与CCR5结合的β-趋化因子会使记忆细胞容易受到R5病毒的感染。在感染R5 HIV-1分离株之前，通过用RANTES、MIP-1α和MIP-1β的中和抗体培养CD3/CD28刺激细胞来验证这一假设（图。). 与用对照IgG处理的相同细胞相比，用β-趋化因子中和抗体预培养导致CD3/CD28刺激的幼稚细胞对HIV的敏感性适度增加（数据未显示）。相反，当用β-趋化因子中和抗体预处理先前耐药的CD3/CD28刺激的记忆细胞时，如HIV-1所示，随后发生了严重感染堵住DNA积累。β-趋化因子对CD3/CD28刺激的记忆细胞的中和作用导致培养上清液中p24的生成增加了近300倍（数据未显示）。该观察结果表明，CD3/CD28刺激的记忆细胞对R5病毒的耐药性是由于它们能够通过产生β-趋化因子来阻止R5病毒利用共受体。此外，该观察结果表明，未分化CD3/CD28刺激CD4的耐药性+R5 HIV分离株的细胞来源于记忆细胞驱动的β-趋化因子的产生，足以阻断记忆细胞和幼稚细胞上的共同受体。
用β-趋化因子中和抗体处理的共刺激记忆细胞易受R5 HIV-1感染。纯化CD45RA+（RA）和CD45RO+用CD3/CD28刺激（RO）细胞6天并感染HIV美国-1（R5病毒株）。在感染后0、2、72和144小时采集样本，并分析细胞颗粒中的HIV-1堵住DNA通过定量PCR液体杂交分析。所示数据代表了两个实验。
讨论
作为X4共受体的α-和β-趋化因子受体的鉴定(27)和R5 HIV-1分离株(三,13,23–25)分别促进了对HIV-1感染和发病机制的理解的迅速发展。在本报告中，我们证明了R5病毒，即对传播至关重要的分离物(22,45,68)，感染CD3/CD28刺激的原始CD4+细胞。相反，R5分离株不能感染CD3/CD28刺激的记忆细胞或未分化的CD4+T细胞。鉴于幼稚细胞表达的CCR5水平低于记忆细胞，这种敏感性令人惊讶。然而，共刺激后，发现记忆细胞分泌的天然CCR5配体RANTES、MIP-1α和MIP-1β水平显著高于原始细胞。中和这些β-趋化因子使记忆细胞极易感染R5分离物。因此，这些观察结果表明，在细胞水平上对R5分离物的敏感性不是由CCR5表达的绝对水平决定的，而是由未被占用的CCR5水平决定的。我们之前的观察结果支持了这一断言，即CD3/CD28共刺激导致CD4不分裂+通过上调β-趋化因子表达对R5 HIV-1分离株耐药的细胞(52)和抑制CCR5上调(12).
与共刺激CD4细胞亚群对R5株感染的不同敏感性相比，我们发现这两个亚群都容易感染CXCR4依赖株。然而，病毒在共刺激的幼稚细胞中的复制效率至少是记忆细胞的10倍。这些结果证实了其他研究的结果，即CXCR4依赖性菌株在幼稚细胞中复制的能力相对于在记忆细胞中复制的能力受损(55,60,67). 事实上，我们的研究很可能低估了这种影响的程度，因为我们幼稚的细胞群被大约3%的记忆细胞污染，因为我们没有排除CD62L−我们人群中的细胞(55). Spina及其同事发现，病毒在幼稚细胞中的复制效率低下，尤其依赖于尼日利亚石油公司功能(60).
CD3/CD28共刺激的使用揭示了HIV-1协同受体调节CD4细胞的不同方面。R5分离株不能感染CD3/CD28刺激的记忆细胞或未分化的CD4+T细胞。这种形式的自然免疫似乎通过由增强的β-趋化因子分泌介导的旁分泌机制和涉及共刺激介导的CCR5表达下调的自分泌机制发挥作用。事实上，CD3/CD28共刺激对迄今为止检测到的所有β-趋化因子受体转录物CCR1、CCR2b普遍具有抑制作用(40)、CCR3和Bonzo/Strl33(52个). 尽管缺乏可检测的CCR5表达，但CD3/CD28刺激的幼稚细胞对R5病毒的敏感性令人惊讶，因为CCR5在病毒进入中起着重要作用(三). 然而，普拉特及其同事最近报告说，在最佳CD4水平存在的情况下，病毒进入只需要微量CCR5，这表明在原始细胞表面检测不到的CCR5水平可能足以进入(48). 虽然R5分离株可能通过替代共受体感染幼稚细胞，但CD3/CD28共刺激引起的全局β-趋化因子受体下调使这种可能性不大，因为将外源性重组RANTES和MIP-1α添加到幼稚电池中阻止了感染（数据未显示）。
与CCR5相比，CXCR4在供体之间和细胞活化后的表达变化较小。然而，我们确实注意到CD28介导的CXCR4 mRNA上调与记忆细胞和幼稚细胞表面CXCR4水平降低之间的不一致（表). 福斯特及其同事通过证明CXCR4在细胞内大量储存，为这些观察提供了潜在的解释(28). 他们发现，佛波酯处理的细胞信号可以通过内化作用导致CXCR4表面表达的快速下调。尽管CD3/CD28刺激似乎会导致CXCR4表面表达下调，但我们之前对未分化CD4细胞的研究表明，细胞上仍存在大量功能性CXCR4，正如细胞介导与表达X4包膜的细胞融合的能力所示(12).
我们发现CD3/CD28刺激的幼稚细胞快速获得CD45RO表达的“记忆”标记。CD45RA-CD45RO转换的动力学与先前报道的脐血原始细胞的动力学相似(47). 然而，幼稚细胞在维持HIV-1复制能力受损的情况下仍保持其幼稚特征，在我们之前的研究中，我们发现在CD3/CD28刺激后，它们仍然无法分泌γ-干扰素(39). 因此，原始细胞向记忆细胞的转化是一个复杂的多步骤过程，从CD45RA到CD45RO的转化可能是最早的变化之一。
我们目前研究的结果可能表明，HIV传播和发病机制的现有模型有所改变。虽然人们普遍认为树突状细胞和/或巨噬细胞（树突）是传入病毒的最初目标(10,11)，HIV-1随后被引入CD4的机制+T细胞数量尚不清楚。基于Bleul等人的论证(8)Unutmaz和Littman显示了CCR5表达的主要记忆分布，他们提出记忆T细胞是感染树突的首要目标(63). 在这个模型中，树突状细胞和巨噬细胞是第一批被传播病毒感染的细胞。虽然树突病毒可以将X4病毒传播给循环T细胞，但这种情况发生的频率很低，R5病毒主要传播给新的宿主(10,11,49). 基于记忆细胞较高的CCR5表面水平和静止记忆细胞迁移到炎症部位的倾向(41)，有人建议R5首先在CD4存储器中建立+细胞数量。该模型的其他证据来自体外研究，表明记忆细胞是HIV-1的更好靶点，尽管只使用了X4病毒(31,55,58,60,67). 在此，我们表明，将X4病毒生成的数据推广到所有HIV-1毒株过于简单，R5和X4病毒在幼稚细胞和记忆细胞方面具有不同的倾向性。我们还发现，CCR5总表达水平与共刺激淋巴细胞感染HIV-1 R5分离株的敏感性无关。因此，我们从共刺激细胞获得的结果不支持Unutmaz和Littman模型的几个方面，这些共刺激细胞的激活方式可能比PHA/IL-2的刺激方式更具生理活性。值得注意的是，我们的结果不太可能与静止淋巴细胞有关，因为CCR5在RNA水平上没有检测到的表达量（图。)或在表面上(8)在静息记忆细胞中未检测到β-趋化因子分泌（数据未显示）。
我们断言，与天然配体结合的辅受体水平决定了HIV易感性，这使我们提出了一种改变的病毒传播模型。在此模型中，如图。树突细胞是HIV感染的最初目标，而幼稚T细胞是病毒最初几轮复制的目标。此外，我们认为成功的早期传播事件并不发生在外围，而是发生在区域次级淋巴器官。据报道，树突状细胞会迁移到淋巴结(16)并优先通过DC-CK1与幼稚T细胞相互作用，DC-CK1是最近描述的一种趋化因子，可将幼稚细胞吸引到树突状细胞(2). 在这种抗原提呈和细胞活化的环境中，β-趋化因子的产生没有伴随增加，活化的原始细胞是HIV-1感染的理想靶点。记忆细胞由于其广泛的组织分布，并不集中在淋巴结中，因此在最初的传播事件中可能代表性不足。更重要的是，尽管记忆细胞的CCR5表达水平较高，但由于其高水平β-趋化因子的产生，它们对R5病毒的感染具有抵抗力。此外，由于这种高水平的β-趋化因子的产生，记忆细胞可能能够为附近的幼稚细胞提供R5病毒的保护。在生理情况下，很难估计可用于结合CCR5的β-趋化因子的浓度；然而，CD3/CD28刺激导致最佳的趋化因子分泌，这可能不会被天然配体相互作用复制（B7家族）。然而，在B7-1共刺激下，幼稚细胞和记忆细胞之间趋化因子产生的相对差异保持不变(52个). 随着感染的成熟和X4病毒的出现，记忆细胞变得容易感染，而幼稚细胞仍然容易感染。
HIV-1传播模型。在这个模型中，R5病毒优先感染周围的树突状细胞（DC），DC将病毒输送到淋巴结，淋巴结中存在高浓度活化的原始CD4 T细胞和低水平的β-趋化因子。幼稚细胞优先被耗尽，但偶尔可以通过附近激活的记忆细胞保护其免受R5病毒的感染。
这个模型的一个含义是，幼稚细胞在感染后死亡的速度必须比记忆细胞快，这是为了解释Schnittman及其同事首次观察到的循环记忆细胞优先携带HIV-1病毒的现象(58). 该模型的另一个预测是，虽然幼稚细胞可以作为CCR5依赖性病毒的靶细胞，但记忆细胞有望成为病毒载量的主要产生者，因为幼稚的细胞可能死亡更快，不能产生与记忆细胞一样多的子代病毒(31,55,58,60,67). 最后，如果这个模型是正确的，它可以用来解释先前报道的HIV-1感染成人幼稚细胞快速耗竭的现象(14,44,54,70). 因此，通过检测共刺激的幼稚和记忆CD4淋巴细胞，发现CCR5总表达和未被占用的CCR5水平之间的差异，对病毒传播和发病机制具有重要意义。
致谢
我们感谢美国国家海军医学中心血库的F.C.Music、S.E.Allen和Julio Cotte，感谢他们在抽血方面的帮助。此外，我们感谢Dave Ritchey、Doug Smoot和Steve Perfetto提供的出色技术支持，以及Patrick Blair对手稿的批判性阅读。我们也感谢D.Birx给予的鼓励和支持。
本研究得到了陆军合同DAMD17-93-V-3004和亨利·杰克逊基金会的支持。
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