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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8257–8263.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.8257-8263.1998年
预防性维修识别码：第10183页
PMID：9733869

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gC介导体内免疫逃避

约翰·卢宾斯基,1 王丽阳（Liyang Wang）,1 雅典娜M.苏利卡,2 莱因哈德汉堡,三 里克·A·韦泽尔,4,† 哈维·科尔滕,4,‡ 加里·科恩,5 罗斯林·J·艾森伯格,6 约翰·兰布里斯,2和哈维·弗里德曼1,*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

许多微生物编码与宿主免疫相关分子相互作用的蛋白质；然而，这些分子很少被证明能促进体内免疫逃避。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）糖蛋白C（gC）结合补体成分C3并在体外抑制补体介导的病毒中和和感染细胞的溶解。为了研究体内gC和C3相互作用的重要性，我们研究了补体接触和C3缺乏动物中gC缺失株的毒力。使用补体接触豚鼠的阴道感染模型，我们发现gC-null病毒的滴度较低，产生的阴道炎比野生型或gC拯救型病毒轻，表明gC在毒力中起作用。为了确定补体的重要性，对C3缺乏豚鼠进行了研究；结果表明，gC-null病毒的阴道滴度显著增加，而野生型和gC拯救型病毒的滴度无显著变化。在小鼠身上观察到类似的发现，在皮肤接种点，gC无效病毒产生的疾病明显少于gC拯救病毒。C3基因敲除小鼠的研究证明了C3的重要性，其中gC-null病毒的疾病评分显著高于补体接触小鼠。结果表明，gC-null病毒大约是100倍（2 log10)动物体内的野生型病毒和gC-C3相互作用参与发病机制的毒性较小。

病毒编码受体并分泌干扰宿主免疫介质的分子(35); 然而，病毒免疫逃逸分子在体内的重要性仍相对未知。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）编码多种免疫调节剂，包括糖蛋白C（gC），一种C3结合蛋白(14,33)，gE/gI，免疫球蛋白G的Fc受体(1,8,32)和ICP47，主要组织相容性复合体I类分子中HSV肽呈现的抑制剂(18,26). gC通过结合补体成分C3b抑制补体级联激活(14,17)并通过阻断properdin和C5与C3b的结合(17,28,33). 这些过程干扰经典和替代补体途径的扩增以及膜攻击复合物的生成。在体外，gC保护HSV感染细胞免受补体介导的裂解(21)和来自补体介导的中和作用的无细胞病毒(16,19,24); 然而，gC在体内作为补体抑制剂的作用尚未确定。

HSV-1是越来越多与补体系统分子相互作用的病毒之一。病毒和补体之间的相互作用可分为两大类：（i）使用细胞上补体受体进入的病毒（例如，EB病毒、麻疹病毒和回声病毒）(2,11,31)和（ii）抑制补体激活的病毒（例如HSV-1、HSV-2、EB病毒、赛米里疱疹病毒、伪狂犬病病毒、牛疱疹病毒1和痘苗病毒）(10,12,21,27,30,36,38,40). 致病性病毒中广泛存在的补体修饰蛋白表明，它们在疾病进展中发挥着重要作用，并表明它们可能是预防或治疗策略的适当靶点。

许多研究已经检验了gC在动物模型中的作用；然而，没有一个是专门用来评估gC和补体之间的相互作用的。例如，对HSV-1株KOS和KOS的gC突变体进行的研究(45)很难评估gC-补体相互作用，因为KOS在HSV-1毒株中不常见，因为它比大多数毒株表现出更少的C3b结合(15). 将病毒直接接种到大脑或脚垫的研究使用绕过粘膜表面补体防御机制的途径(5,7,45). 感染角膜的研究(4,22,41)评估一个相对无血管且预计补体水平较低的组织(25). 我们选择通过粘膜途径感染豚鼠(44)和小鼠皮肤划痕接种(43). 两种感染途径都允许病毒和补体之间的相互作用。已知所用的gC突变株对体外补体失活敏感(16)和一个标记拯救的回复物作为对照。结果证实了gC在发病机制中的重要性，并表明gC是一种毒力因子，因为它与C3相互作用。

材料和方法

细胞培养和病毒株。

Vero细胞在37°C和5%CO中生长2在Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、20μg/ml庆大霉素和20 mM HEPES（pH 7.3）。为了制备纯化病毒池，以5倍感染率（MOI）感染Vero细胞；收集上清液以检测无细胞病毒，并按前述方法在5%至65%蔗糖梯度上离心(16). 收集可见的病毒带，并在4°C下用500体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行透析，通过Vero细胞上的菌斑试验测定滴度。

NS是一种野生型、低传播数HSV-1临床分离株，是这些研究中使用的突变株的亲本菌株(14). NS-gC公司无效的是一种gC阴性病毒，通过用ICP6:：LacZ盒取代整个gC-1蛋白编码序列而构建(16). 它不表达gC或绑定C3b。rNS-gC无效的是通过使用来自NS的gC将gC-null病毒拯救回野生型表型(16). 以前曾描述过病毒株的Southern印迹、Western印迹和对补体介导中和的敏感性(16). gC突变体NS-gC无效的被人体补体迅速中和，对补体介导中和的敏感性是野生型或拯救型病毒的50至100倍，这两种病毒对补体几乎完全耐药(16). 在为体内研究准备纯化病毒池之前，对所有突变株和拯救株进行三次菌斑纯化。

确定野生型、gC突变型和拯救型病毒的复制表型。

在MOI为5时感染Vero细胞，绘制单步生长曲线；在感染后1、4、8、12、20和24小时，收集细胞和上清液，并通过噬菌斑测定法测定滴度(16).

测定野生型和gC突变病毒的附着表型。（i） 测量颗粒感染率。

通过将纯化病毒的等效PFU加载到十二烷基硫酸钠-7.5%聚丙烯酰胺凝胶上，并使用兔多克隆抗体NC-1通过Western blot分析检测病毒衣壳抗原VP5，从而确定颗粒感染率(6,23). 通过密度分析比较VP5谱带的强度。

（ii）病毒附着分析。

35在MOI为5时感染Vero细胞制备S-标记病毒。感染后4 h，在Hanks平衡盐溶液中冲洗细胞，并用DMEM覆盖0.1×蛋氨酸、0.1×半胱氨酸、2%透析FBS和100μCi的Tran35每毫升S标签（ICN）。感染后24小时，纯化无细胞病毒(16). 如前所述测量病毒对细胞的粘附(23)，进行了修改。简单地说，HEp-2或Vero细胞生长在24孔组织培养板中，直到汇合并用PBS清洗，然后在37°C下添加1ml PBS–1%牛血清白蛋白（BSA）1h。将板冷却至4°C并用PBS–0.1%BSA清洗35将S标记病毒添加到200μl PBS–1%BSA中。在4°C下摇动平板，并在时间零点和1、2、3、4、6、8和20 h用PBS洗涤，然后在室温下添加0.5 ml 10 mM Tris–10 mM EDTA–0.25%Triton X-100，并将溶液转移到闪烁瓶（Ecolume；ICN）中。放射性是在闪烁计数器中测定的。为了绘制附着动力学图，通过确定35每个PFU的S计数。

测定MDCK细胞中gC突变病毒的表型。

进行检测以确定gC突变病毒与MDCK细胞顶端表面的结合是否有缺陷(42). 将连续10倍稀释的病毒在37°C下加入MDCK细胞的5至8天融合单层中1小时，然后清洗单层并用0.6%琼脂糖和DMEM–5%FBS覆盖。48小时后，用冷甲醇丙酮固定MDCK电池并清洗，用兔抗gB多克隆抗体R69对病灶进行免疫过氧化物酶染色(42). 计算Vero细胞上斑块与MDCK细胞上斑块的比率，以表明gC突变体是否在心尖附着中有缺陷。为了测量基底外侧感染，Vero细胞生长在含有3.0μm孔洞的胶原涂层Transwell插入膜（Costar；Fisher Scientific）上，感染于基底表面，并如上所述在48小时进行gB染色。

体内研究。（i） 豚鼠接种。

如前所述，体重175至225 g的雌性哈特利品系豚鼠受到感染(44). 简单地说，用PBS湿润的海藻酸钙拭子（Calgiswab 3；Spectrum Labs，Houston，Tex）打破阴道膜，去除蛋白质物质，并通过软导管引入50μl病毒。通过将湿润的拭子插入阴道，旋转拭子五次，然后将拭子放在1 ml DMEM–10%FBS中，在接种后4 h和1、3、5、7和10天测量阴道滴度。样品在−70°C下保存，直到通过菌斑试验测定滴度。

（ii）阴道炎评分。

每天观察动物，疾病严重程度评分如下：轻度或中度红斑0.5分，严重红斑1.0分，阴道分泌物0.5分，阴道小泡1.0分。分配给动物的最高每日得分为1.5。将感染后前10天所有动物的每日得分相加，除以治疗组的动物数量，计算阴道炎平均得分。对学生进行比较组的统计分析t吨测试。

（iii）C3D豚鼠。

实验是用补体成分C3有遗传缺陷的独特C3D近交系豚鼠群体进行的(三). 这些动物最初是在近交系2动物群中鉴定的。他们的血清C3水平为正常值的5.7%。这种数量的C3足以支持抗体包被红细胞的溶血，并导致50%的总溶血补体活性(16)1:16至1:32，占正常豚鼠血清中活性的12.5至25%。

（iv）C57BL/6和C3敲除小鼠的皮肤接种。

C3-null小鼠是通过靶向删除C3基因而产生的(48). 简言之，通过胚胎干细胞中的同源重组，将位于C3基因侧翼的2.4-kb片段（包括其启动子和外显子1）替换为新霉素抗性基因。将干细胞注射到C57BL/6囊胚、与C57BL/7雌性繁殖的嵌合体后代和纯合C3中−/−由杂合子C3-基因型创始人培育的动物。这些小鼠缺乏补体活性和C3蛋白，通过酶联免疫吸附试验可以检测1 ng/ml的C3。

如前所述，C3-null小鼠和亲本菌株C57BL/6通过划痕接种感染(39,43). 感染是通过剃掉右翼并用脱毛膏剥去毛发引起的。20小时后，5×105将含有10μl无菌DMEM的PFU涂敷在离脊柱几毫米的裸露侧腹上，用一根27 gauge的针头在大约3×3毫米的区域轻轻刮30次。疾病评分表示为感染后第3天到第8天的评分总和(39). 接种部位的疾病评分如下：无疾病为0分，无水疱肿胀为0.5分，每个水疱或痂为1.0分，最高每日得分为5分。如果水疱或痂融合，则根据融合病灶的大小进行评分。与接种部位分开的部位出现的肿胀和病变被视为皮肤病或带状病变。这些病变的评分与接种部位相同，只是使用了最大每日评分10分，因为在涉及的较大皮肤面积上可以计算出更多的病变。

平均AUC的计算和统计方法。

阴道滴度绘制为平均对数10平均值±标准误差（SEM）和曲线下面积（AUC）通过使用治疗组在每个时间点的几何平均值来确定。使用pcnonlin 4.0（位于肯塔基州列克星敦的SCI软件）计算AUC，并通过方差分析评估治疗组之间的统计显著性(34).

结果

野生型和gC突变病毒的附着表型。

一些gC-null病毒株在病毒附着到细胞上时有缺陷(49)，而其他都是正常的(20); 因此，我们对NS-gC的粘附表型进行了表征无效的病毒。根据VP5衣壳的含量对野生型和gC-null病毒进行标准化(23)因为基于PFU的测量可能会对附着缺陷突变体给出误导性的值。通过Western blotting，NS和NS-gC的等效PFU无效的产生了类似强度的VP5带（图​（图1A），1A） ，这表明这两种病毒的裂解效率是相当的。结合动力学35标有S的NS和NS-gC无效的当病毒被添加到HEp-2细胞中时（图。​（图1B）1B） 或Vero单元格（未显示）。我们得出结论，NS-gC的粘附表型无效的与野生型病毒相当。

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（A） 野生型和gC突变病毒的颗粒感染率。NS或NS-gC无效的病毒（106通过Western blotting检测病毒衣壳抗原VP5的PFU。用密度测定法对条带进行定量。这两种病毒具有相似的PFU/VP5比率，这表明其感染效率相当。尺寸以千道尔顿表示。（B） NS或NS-gC的附着动力学无效的病毒。[35S] 蛋氨酸-和[35S] 将半胱氨酸标记的无细胞病毒添加到4℃的HEp-2细胞中，并在不同时间测定结合计数。NS和NS-gC无效的具有类似的结合动力学。

极化MDCK细胞感染。

据报道，HSV-1（F）的gC-null菌株大于10000倍（4 log10)在感染极化细胞顶端表面的能力方面不如野生型病毒有效，这表明gC可能对与顶端细胞表面受体的相互作用很重要(42). 然而，HSV-1 SC16和HFEM的gC突变株没有表现出这种表型，与野生型病毒的差异不到两倍(20). 确定NS-gC的表型无效的病毒，我们评估了其感染极化MDCK细胞的能力。NS-gC公司无效的产量为12.6倍（1.1 log10)斑块少于NS（表​（表1）。1). 正如其他人报告的那样，当病毒被添加到基底外侧表面时，没有发现差异（未显示）(20,42). 这些结果表明NS-gC无效的与野生型病毒不同的是其感染极化细胞的能力；然而，与报道的HSV-1（F）gC缺失突变相比，差异很小(42).

表1

野生型或gC缺失突变病毒感染MDCK细胞

病毒平均滴度±SEM(n个= 4)
Vero细胞滴度/MDCK细胞滴度MDCK细胞上形成斑块所需PFU的倍数增加
Vero细胞MDCK细胞顶面
NS公司108.0±0.6105.1±0.6794:11
NS-gC公司无效的108.0±0.2104.0±0.110,000:1一12.6
一NS-gC对比结果无效的并且NS对MDCK细胞的作用效率在统计学上是不同的，P（P）= 0.003. 

豚鼠HSV-1感染。

在感染动物之前，我们执行了一步生长曲线；结果表明，突变型、拯救型和野生型病毒的复制动力学具有可比性（未显示）。将野生型HSV-1以100倍滴度（5×10三至5×105)确定病毒复制的剂量反应动力学和阴道疾病评分。在最高接种量下，阴道滴度在接种后第1天达到峰值，而在两个较低剂量下，滴度在第1天和第3天达到峰值（图。​（图2A）。2A） ●●●●。接种量每增加10倍，大约产生2 log10峰值滴度增加。由于动物感染率为5×10，因此阴道炎评分与阴道滴度相关5PFU有最严重的阴道炎，感染5×104PFU得分中等，接种5×10三PFU得分最低（图。​（图2B）。2B） ●●●●。

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野生型NS病毒的剂量反应研究。（A） NS阴道内接种5×105, 5 × 104，或5×10三PFU。在感染后4 h和1、3、5、7和10天采集阴道拭子，并测定其滴度。计算AUC作为病毒载量的测量。5×10时AUC为28.35PFU，5×10时为24.64PFU和14.3（5×10时）三AUC为5×105PFU在5×10时显著大于AUC三PFU（功率因数校正装置）(P（P）<0.01），AUC为5×104PFU在5×10时显著大于AUC三PFU（功率因数校正装置）(P（P）= 0.05). （B） 阴道炎评分为5×105, 5 × 104、和5×10三PFU。得分为5×105PFU显著大于5×10的分数4PFU（功率因数校正装置）(P（P）=0.03），得分为5×104显著大于5×10的分数三PFU（功率因数校正装置）(P（P）< 0.01). 误差线代表±SEM。

补体接触豚鼠中gC-null病毒的毒力。

我们通过比较由gC-null病毒引起的疾病和由野生型或挽救型病毒引起的病来检查gC在毒力中的作用。Hartley株豚鼠阴道内接种5×105PFU。gC-null菌株复制到滴度10至100倍（1至2 log10)在10天的感染过程中低于野生型或拯救型病毒(P（P）<0.01，将gC无效病毒的AUC与野生型或拯救病毒的AUC进行比较）（图。​（图3A）。三A） ●●●●。gC-null病毒感染动物的阴道炎严重程度也显著降低(P（P）<0.01，与NS-gC相比无效的使用NS或rNS-gC无效的)（图。​（图3B），三B） 表明gC-null病毒的滴度较低，产生的阴道炎较野生型或gC-拯救型病毒轻。这些结果表明，gC在毒力中起重要作用。

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gC-null病毒的阴道滴度和阴道炎评分低于获救和野生型病毒。（A） 豚鼠接种5×105NS的PFU，rNS-gC无效的或NS-gC无效的病毒。在指定时间采集阴道拭子，并测量滴度。NS的AUC为28.3，rNS-gC为30.3无效的，对于NS gC为16.9无效的.NS和rNS-gC无效的与NS-gC显著不同无效的(P（P）< 0.01). （B） 三种病毒的阴道炎评分。NS-gC公司无效的与rNS-gC显著不同无效的(P（P）<0.01）和NS(P（P）= 0.02). 误差线代表±SEM。

gC-null病毒在C3D豚鼠中的毒力。

用C3D豚鼠进行实验，以确定补体是否解释了gC-null和野生型或拯救型病毒之间的毒力差异。我们假设，如果gC-补体相互作用很重要，那么在C3D豚鼠中，gC-null病毒的滴度应显著高于野生型或挽救型病毒的滴量。接种物5×10三选择PFU进行感染，因为这是在互补接触动物中产生可检测阴道滴度的最低剂量；因此，我们可以检测到滴度的大幅增加。C3D豚鼠的gC-null病毒阴道滴度显著高于补体接触动物（图。​（图4A）。4A） ●●●●。NS-gC的AUC无效的C3D豚鼠为12.7，而补体接触动物为3.6(P（P）< 0.02). 感染后第1天的病毒滴度峰值超过300倍（2.5 log10)C3D动物高于互补接触对照组(P（P）= 0.003). 相反，C3D动物中挽救病毒的阴道滴度（AUC为24.1）仅略高于补体完整对照组（AUC为16，P（P）=无意义[图。4B] ）。C3D动物的野生型NS病毒阴道滴度（AUC为17.4）也仅略高于补体接触对照组（AUC 14.3，P（P）=无意义[图。4C] ）。结果表明，NS-gC的滴度无效的动物体内C3的存在对病毒有显著影响，而野生型和拯救型病毒的滴度则没有影响。因此，我们得出结论，C3至少在一定程度上解释了补体接触动物中gC阴性病毒阴道滴度下降的原因。

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gC和补体之间的相互作用对豚鼠HSV-1的毒力很重要。C3D或补体接触豚鼠接种5×10三NS-gC的PFU无效的（A） ，rNS-gC无效的（B） 或NS（C）。在指定时间采集阴道拭子，并测量滴度。NS-gC的AUC无效的互补接触动物（3.6）与C3D动物（12.7）显著不同(P（P）= 0.02). 在补体接触和C3D豚鼠中，获救或野生型病毒的AUC没有显著差异。误差线代表±SEM。

感染gC-null、挽救型或野生型病毒的补充接触动物在5×10时的阴道炎评分较低三PFU（分数范围为1.1至1.7），而C3D豚鼠中所有三种病毒的分数都较高（范围为4.5至5.2）（结果未显示）。因此，在C3D豚鼠中，NS-gC无效的病毒引起的阴道炎评分与被拯救病毒和野生型病毒引起的评分相当。

我们比较了接种5×10的补体完整豚鼠中gC无效、拯救和野生型病毒的阴道滴度三PFU。NS-gC的平均AUC无效的（3.6）明显低于拯救病毒（15）或野生型病毒（14.3）（比较图。​图4；4; NS-gC公司无效的与rNS-gC相比无效的或NS，P（P）<0.01），支持图。​图3A三接种量高出100倍。有趣的是，在C3D豚鼠中，NS-gC的AUC无效的病毒（12.7）低于拯救病毒（24.1）（比较图。​图4A4A和B；P（P）=0.045），尽管AUC与野生型病毒的AUC没有显著差异（17.4）（图的顶部曲线。​图4C）。4C） ●●●●。由于C3D豚鼠并非完全缺乏C3，因此可能由于残留的C3活性，gC空病毒的滴度会低于被拯救的病毒。另外，这一结果也增加了gC在体内调节其他功能的可能性，例如粘附细胞(19,23,46,49)或极化细胞顶面感染(20,42)导致gC-null病毒滴度降低。由于没有C3基因敲除豚鼠，我们选择在C3基因击除小鼠中进行额外的研究。

C3基因敲除小鼠中gC-null、挽救型和野生型病毒的毒力。

C57BL/6转基因C3敲除小鼠的可用性使我们能够在另一动物模型中测试gC-C3相互作用的作用。小鼠侧面模型(43)用于评估接种和带状传播部位的疾病(39). 在这个模型中，感染是通过刮擦接种开始的，病毒在局部复制，通过轴突转运传播到神经节，在神经节发生额外复制，然后通过轴突运输返回皮肤，并在皮肤（带状）分布中产生损伤(39,43). 在补体接触C57BL/6小鼠中，gC-null（7.4）和挽救（26.1）病毒的疾病评分之间存在高度显著差异(P（P）<0.0001）（图。​（图5A），5A） ，这表明gC是一种毒力因子，并证实了对豚鼠的结果。为了评估C3的作用，比较了C3基因敲除小鼠和补体接触小鼠中gC-null病毒的疾病评分（图。​（图5A）。5A） ●●●●。C3基因敲除小鼠（20.6）的得分显著高于补体接触小鼠（7.4）(P（P）<0.0001）。相反，C3基因敲除小鼠和补体接触小鼠中挽救病毒的疾病评分没有差异（图。​（图5A）。5A） ●●●●。这些结果提供了强有力的证据，证明gC可以保护机体免受补体的影响。值得注意的是，在C3基因敲除小鼠中，gC-null病毒的疾病评分仍然低于挽救病毒（图。​（图5A；5A；NS-gC公司无效的与rNS-gC相比，疾病得分为20.6无效的得分27.1，P（P）< 0.01). 这一结果表明，gC除了抑制C3外，还可能介导功能。动物型疾病评分进一步支持了gC的另一个功能，因为挽救病毒在C3基因敲除小鼠中引起皮肤病，而NS-gC无效的病毒没有（结果未显示）。

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gC和C3之间的相互作用对HSV-1在小鼠中的毒力很重要。（A） C57BL/6 C3基因敲除或C57BL/6亲本品系补体接触小鼠皮内接种5×105NS-gC的PFU无效的或rNS-gC无效的病毒。通过计算病变数量，在接种点确定疾病评分。NS-gC的疾病评分无效的C3基因敲除小鼠为20.6，补体接触小鼠为7.4(P（P）<0.0001）。rNS gC的疾病评分无效的C3基因敲除小鼠为27.1，补体接触小鼠为26.1(P（P）=不重要）。研究的动物数量显示在每个栏的上方。（B） rNS-gC的剂量反应研究无效的接种5×10的C57BL/6补体接触小鼠5, 5 × 104, 5 × 10三，或5×102PFU。绘制的疾病评分代表每组6只小鼠（5×10中5只小鼠5PFU组）。疾病评分为5×10三rNS-gC的PFU无效的为6.9，与A组中接种5×10疫苗的动物的7.4分相当5NS gC的PFU无效的病毒。误差线代表±SEM。

为了估计gC效应的大小，对补体接触小鼠进行了剂量反应实验。动物接种了连续10倍稀释的rNS-gC无效的病毒的剂量范围为500000至500 PFU（图。​（图5B）。5B） ●●●●。当动物接种5000 PFU时，疾病评分为6.9，这与动物接种500000 PFU gC-null病毒时的疾病评分7.4相当（图。​（图5A）。5A） ●●●●。因此，需要100倍以上的gC空病毒才能产生与gC拯救病毒在互补接触小鼠中产生的疾病相当的疾病。

讨论

本研究涉及HSV-1 gC介导的体内活动，重点关注其在免疫逃避中的作用。HSV-1 gC已被证明能在体外介导多种活性，包括抑制补体介导的无细胞病毒中和作用和补体介介导的感染细胞裂解作用(16,21). 研究表明，HSV-1 gC也能介导病毒粘附到细胞表面硫酸乙酰肝素(23,49)并且是极化细胞顶端感染所必需的(42). 然而，其他使用不同HSV-1 gC-null株和不同细胞系的报告指出，病毒附着或极化上皮细胞感染不需要gC(20). 我们以前的结果表明，NS-gC无效的对补体介导的中和作用的敏感性是野生型或拯救型病毒的50到100倍(16). 我们现在定义NS-gC的附着表型无效的并报告该突变株在HEp-2和Vero细胞上的附着类似于野生型病毒。然而，NS-gC无效的与野生型病毒略有不同，它产生12.6倍（1.1 log10)极化MDCK细胞顶面斑块较少。该偏差远小于>10000倍（4 log10)MDCK细胞上HSV-1（F）gC-null病毒的差异报告(42)但与在Caco-2细胞上观察到的HSV-1菌株SC16和HFEM的gC突变体的2倍差异相当(20). 因此，体外研究表明NS-gC无效的病毒在细胞附着方面正常，在极化MDCK细胞的顶端感染方面略有缺陷。然而，最显著的异常是对补体介导中和的显著敏感性。

结果如图所示。​图3三和​和55对于补体接触豚鼠和小鼠，明确证明gC是一种毒力因子。我们假设，如果gC-补体相互作用在毒力中很重要，那么gC-空病毒在C3D中的毒力应该比在补体接触动物中的强。此外，如果gC的唯一功能是抑制C3的活性，那么gC-null病毒应该与C3D动物中的野生型和拯救型病毒一样具有毒性。我们证明，在C3D豚鼠中，gC-null病毒的滴度显著高于补体接触动物，而野生型或挽救型病毒的滴数没有显著变化。作为对gC-C3相互作用重要性的进一步支持，我们表明，在C3基因敲除小鼠中，gC-null病毒的疾病评分显著高于互补接触小鼠，而挽救病毒的评分保持不变。在C3D豚鼠和C3敲除小鼠中的结果有力地支持了gC作为体内免疫逃避分子的重要性。

实验还表明，gC除了与C3相互作用外，还可能具有其他功能。在C3D豚鼠中，感染gC-null病毒不会导致阴道滴度与挽救病毒的滴度相当。在C3D豚鼠中，C3水平降低但并不缺失；因此，残留的C3可以解释较低的gC无效病毒滴度。然而，残留的C3不能解释C3基因敲除小鼠在gC-null和挽救病毒之间表现出显著差异的观察结果。因此，结果表明，除了结合C3和C3片段外，iC3b和C3c片段(14,33,47)，gC可能在体内介导其他活性。这可能反映了gC在极化上皮细胞顶端感染中的作用，或者可能在修改补体级联中的其他步骤中发挥作用，因为我们以前的结果表明gC阻断C5和properdin参与补体激活(17,28,33). NS-gC毒性降低的另一种可能解释无效的在C3D动物中，gC基因座外引入了沉默突变。然而，这似乎不太可能，因为gC-null病毒的拯救毒株与野生型毒株一样致命。研究计划通过构建破坏补体结合域的gC突变病毒来解决与极化细胞的粘附是否有助于提高毒力(29)但保留分子的邻近区域完整，而gC-C5相互作用在C5D小鼠毒力中的可能作用可以评估(37).

豚鼠和小鼠的剂量反应研究使我们能够评估gC对毒力的影响程度。当NS-gC无效的将病毒以5×10接种到豚鼠体内5PFU，阴道滴度AUC为16.9，低于NS接种5×10时的AUC4PFU（22.9）(P（P）=0.01），与5×10的AUC相当三PFU（14.3）。因此，在没有gC的情况下，需要大约100倍以上的病毒才能产生与gC存在时相当的阴道滴度。小鼠也获得了类似的结果，因为5×105gC-null病毒PFU产生的疾病分数与5×10产生的疾病得分相当三拯救病毒的PFU。通过比较豚鼠的阴道炎评分，对gC影响程度的估计稍低。NS-gC公司无效的病毒在5×105PFU导致阴道炎评分为3.3，与NS接种10倍（1 log）时的3.5分相似10)-剂量较低。我们得出结论，gC具有10到100倍（1到2 log10)对毒力的影响。

gC对野生型病毒预防补体介导病毒失活的有效性如何？对C3基因敲除小鼠的研究表明，补体接触动物和C3D动物中的野生型病毒之间没有差异。在C3D豚鼠中，野生型滴度仅略高于补体接触动物。这些结果与体外结果一致，体外结果表明补体对野生型病毒中和或对受感染细胞的溶解几乎没有影响(16,21). 我们的结论是，gC为野生型病毒提供了几乎完全的保护，以抵抗补体攻击。

感染后第1天，C3D豚鼠的gC阴性病毒阴道滴度显著高于补体接触动物(P（P）<0.005），这是在抗体形成之前。这一发现表明，gC可以保护机体免受抗体诱导的补体激活，这与体外结果一致(16,21,24). 这种保护对无细胞病毒还是对病毒感染的细胞最重要还有待确定，确定哪种补体途径在体内修饰HSV感染也是如此。

这项研究的信息可用于制定策略来修改gC介导的免疫逃避。gC存在于病毒上，并在感染细胞表面表达。这使得gC成为疫苗的一个有吸引力的靶点，其目的是诱导抗体阻断gC功能，从而使病毒或受感染细胞更容易受到补体的影响。一种策略是添加gC和其他免疫逃避分子，如gE和gI(9,13)并确定多价疫苗是否通过阻止免疫逃逸来提高疫苗效力。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院HL 28220和AI 25011的资助。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）