人免疫缺陷病毒1型Tat与转录辅活化因子p300和CREB结合蛋白的相互作用

摘要

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）转录激活子（Tat）通过病毒长末端重复序列（LTR）中的RNA元件刺激病毒基因表达(14,17). 为了优化HIV基因表达的反式激活，Tat需要特定的上游转录因子，包括Sp1(13)，TATA结合蛋白(18,39)，Tat相关激酶（TAK）(11,43)，TFIIH(9,30)，提示(16)，和RNA聚合酶II(4,24,42). Tat的一个重要作用是通过其羧基末端结构域的磷酸化增加RNA聚合酶的加工能力，这可能与宿主细胞辅因子一起发生(19). 在与Tat相关的因子中，TAK已被证明通过其激活域在体内外与Tat相互作用(44,45). Tat调节转录延伸的能力可能与其与负责启动的基础转录复合物相互作用的能力有关，并且已经证明Tat影响转录启动。例如，Tat通过其基本结构域以独立于Tat反应区（TAR）的方式与起始前复合体相互作用，这种关联可能具有功能意义(8)，TFIIH已被证明可以调节其功能(三,9,30). 虽然其对HIV基因表达的影响具有间接重要性，但Tat激活需要相关基础复合物的组装(9,13,15,18,39,42).

在与基础转录复合体相关的因子中，p300和相关CREB结合蛋白（CBP）(2)已成为一大类细胞转录因子的辅激活因子（有关综述，请参阅参考文献5和34). p300，最初通过与E1A的相互作用识别(6)与美国海关与边境保护局高度相关(23); 这两种分子都是对细胞生长变化作出反应的大核磷蛋白(5)融入多种信号传导途径(12,28,37). 迄今为止，与Tat结合的细胞辅因子还没有参与染色质重塑。因为组蛋白去乙酰化抑制剂最近被证明可以激活整合的HIV-1 LTR(38)p300影响组蛋白乙酰化(1,29,44)，我们探讨了Tat与p300相互作用的可能性。

材料和方法

结果

为了分析Tat依赖性基因激活是否依赖p300，我们检测了12S E1A通过Tat抑制HIV-CAT表达转录激活的能力。Jurkat淋巴细胞与HIV-CAT、12S E1A表达质粒和Tat表达载体共转染。Tat激活HIV启动子（图。​（图1A，1A、 左图）被12S E1A抑制，而不能结合p300的12S E1A突变体的共转染(40)，对Tat活化没有影响（图。​（图1B，1B、 左）。由于HIV LTR包含两个κB位点，NF-κB的转录活性可以被E1A抑制(31)12S E1A对Tat诱导的基因表达的影响通过使用具有突变κB位点的HIV-CAT报告子[（ΔκB）HIV-CAT]进行检测。12S E1A wt抑制了κB非依赖性Tat诱导的基因表达，而突变的12S E1A不与p300结合（图。​（图1B，1B、 右侧）。为了解决野生型或突变体12S E1A在这些条件下影响Tat表达的可能性，我们使用编码CAT报告蛋白的相同表达质粒重复实验。在相同摩尔比（500倍质量过剩）下，野生型或突变型12S E1A没有显著改变CAT的表达，这表明12S E1A对Tat转录功能的影响不是由于Tat表达的改变（图。​（图1，1，图例）。12S E1A wt或突变型12S E1 A本身未观察到HIV-CAT或（ΔκB）HIV-CAT的转录激活（图。​（图1C）。1C） ●●●●。这些数据增加了p300可以增强Tat依赖性基因激活的可能性。

在单独的窗口中打开

图1

12S E1A wt抑制Tat诱导的HIV-1基因表达。Jurkat T白血病细胞转染HIV-CAT（3μg）或（ΔκB）HIV-CAT3μg和RSV-Tat（10 ng）（A）或与RSV-12S E1A wt（5μg）和12S E1BΔp300（5μg）（B）联合转染。还用HIV-CAT（3μg）或ΔκB-HIV CAT（2μg）（C）单独转染RSV-12S E1A wt（5μg）和12S E1AΔp300（5μg）。包括一个对照RSV载体，以便在每个样本中使用相同数量的表达质粒。误差条表示三个独立实验平均值的标准误差。野生型或突变型12S E1A的质量超过500倍并没有显著改变RSV-CAT的表达（转化率分别为0.77或0.72%）。

为了确定p300和CBP是否能与Tat发生生化相互作用，进行了结合分析。核蛋白提取物与GST-Tat融合蛋白（氨基酸1至86）孵育。p300和CBP很容易通过GST-Tat柱洗脱液的Western blotting检测，而不是GST对照（图。​（图2A）。2A） ●●●●。用针对p300的多克隆抗体进行的联合免疫沉淀研究在体内证实了这种相互作用。在来自Tat转染的293细胞的核提取物的抗p300免疫沉淀物中检测到Tat的水平增加（图。​（图2B）。2B） ●●●●。在对照免疫沉淀中观察到Tat的背景结合，可能是由于其与抗血清的非特异性结合。这些发现表明Tat可以在细胞内与p300发生生化反应。

在单独的窗口中打开

图2

Tat在体内外与p300和CBP相互作用。（A） 来自Jurkat核提取物的p300和CBP用GST Tat（泳道3和6）或用GST作为阴性对照（泳道2和5）亲和纯化。三次洗涤后，结合蛋白通过SDS-PAGE溶解，然后进行p300（左）或CBP（右）的Western blot分析。通道1和通道4代表20μg的输入蛋白质。（B） Tat和p300在体内相互作用。Tat通过使用CMV表达质粒（CMV-Tat）在293细胞中表达，并用对照兔IgG（第8道）和抗p300 IgG的抗体（第9道）进行免疫沉淀（IP）。结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，然后进行Tat的Western blot分析。通道7代表25μg的输入蛋白质。（C） Tat直接与p300的羧基末端半部分相互作用。在体外翻译的p300中，氨基末端一半（左）和羧基末端一半（右）与GST-Tat（12和15道）或GST（11和14道）结合。通道10和13代表10%的体外翻译输入蛋白。

p300介导Tat相互作用的区域是通过与体外翻译蛋白的进一步结合研究确定的。很容易检测到羧基末端p300区域（氨基酸1542到2412）的结合（图。​（图2C）。2C） ●●●●。相反，p300的氨基末端片段没有检测到与GST-Tat的结合，表明这种相互作用不是由于Tat的非特异性结合，而是由于p300和Tat中两个不同结构域的特定相互作用。为了证实p300-Tat相互作用的特异性，GST-Tat也被用于与其他蛋白质（包括RelA和Stat2）的结合研究。在相同的缓冲条件下（数据未显示），这些蛋白质均未与GST-Tat结合，证实了这种相互作用的特异性。进一步定位显示p300的跨区域残基1542-1710足以介导这种相互作用（图。​（图3）。三). p300的这个羧基末端区域也被证明可以介导与TFIIB的相互作用(20)，细胞周期蛋白E/Cdk2(32)和腺病毒E1A(6). 接下来定义了此交互所需的Tat区域。制备了一系列缺失突变体作为GST融合蛋白大肠杆菌并用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠纯化。只有包含Tat基本结构域（残基48至57）的融合蛋白结合p300，包括仅表达该基本结构域区域的融合蛋白（图。​（图4A，4A、 顶部）。作为阴性对照，对λ噬菌体N基因编码的抗终止剂的基本结构域进行了结合分析。这种蛋白质的氨基酸序列与Tat富含精氨酸的结构域相似(21)但在功能上或绑定到TAR的能力上不能替代此域(35). 使用这两种GST融合蛋白进行的结合分析表明，Tat的基本结构域与p300结合，但噬菌体λN基因的结构域没有结合（图。​（图4A，4A、 底部），表明Tat的这个特定氨基酸序列介导与p300的结合。由于TAR结合区域需要该区域才能与TAR结合，因此已知该区域处于非活性状态，因此未使用此Tat结合区域发生突变的功能性实验。

在单独的窗口中打开

图3

Tat在氨基酸残基1542和1710之间结合p300。将Tat固定在表达GST-Tat的细菌提取物中的谷胱甘肽珠上，并与p300（3、6、9和12道）的放射性标记、经体外翻译的羧基末端缺失突变体孵育。经过三次洗涤后，结合蛋白通过SDS-PAGE进行分解。GST被用作阴性对照（第2、5、8和11车道）。通道1、4、7和10代表输入蛋白质的10%。在泳道4、6、7和9中，注意到由于DNA模板的不完全酶消化而产生的少量全长p300。

在单独的窗口中打开

图4

Tat通过其基本域结合p300。（A，顶部）Tat的基本域负责p300相互作用。将不同的GST-Tat缺失突变体固定在细菌提取物中的谷胱甘肽珠上，并与放射性标记的、在体外翻译的、羧基末端p300残基1253到1710（通道3到6）孵育。GST被用作阴性对照（第2车道）。通道1代表输入蛋白质的10%。（A，底部）Tat的基本结构域特异性结合p300。将GST-Tat（48-57）和GST-Tat（NBD）融合蛋白固定在细菌提取物中的谷胱甘肽小球上，并与放射性标记的、在体外翻译的羧基末端p300残基1253-1710（通道9和10）孵育。GST被用作阴性对照（第8车道）。通道7代表输入蛋白质的10%。（B） 将（ΔκB）HIV-CAT（3μg）和Tat（10 ng）转染Jurkat细胞。包括对照RSV载体，以便在每个样本中使用总计10 ng的表达质粒。值表示背景级别上的转换百分比。（C） 转染编码p300的表达载体可刺激Tat诱导的转录激活。将（ΔκB）HIV-CAT（3μg）、RSV-Tat（10 ng）、RSV对照（10 ng。包括对照RSV载体，使得在每个样品中使用等摩尔的RSV载体。pBluescript用于弥补质量差异。值（+Tat）表示Tat转录激活水平的转换百分比。误差条表示三个独立实验平均值的标准误差。

通过将Jurkat细胞与（ΔκB）HIV-CAT及Tat和p300表达载体共转染，进一步研究了p300对Tat活化的功能贡献。在没有Tat的情况下，p300的表达对该启动子几乎没有影响（图。​（图4C）；4C） ；然而，p300的表达以剂量依赖的方式增加了Tat的激活（图。​（图4C），4C） 这种协同效应很容易用少量Tat表达载体质粒（10 ng）检测到。因此，这两种蛋白质的相互作用与它们在功能上协同作用的能力有关。

讨论

在本研究中，我们报告了p300与HIV-1 Tat蛋白相互作用，并充当Tat依赖型HIV-1基因表达的辅激活子。12S E1A能够以NF-κB非依赖性的方式与p300结合，从而抑制Tat诱导的HIV基因表达。定义了p300和Tat之间的生化相互作用，并通过共转染证实了Tat和p300之间的功能相互作用。这种相互作用所需的Tat区域包括Tat高度保守的基本结构域，它介导与TAR RNA干环结构的结合。这些发现表明，辅激活子p300和CBP可能在Tat和基础转录装置之间提供联系。据我们所知，Tat与共激活因子p300和CBP的相互作用也代表了RNA结合蛋白与转录共激活因子的首次证明。

最近有报道称，p300和CBP不仅与细胞转录因子相互作用，还与组蛋白乙酰转移酶（HAT）、P/CAF结合(44)，并具有固有的HAT活性(29). 这里描述的研究结果表明，这些辅活化子可以作为RNA结合蛋白的适配器，并通过染色质的靶向乙酰化促进转录调控。有人认为，少量可能包装在病毒粒子中的Tat蛋白可能会触发HIV-1 LTR附近染色质的重塑(10)，而组蛋白乙酰化引起的染色质重塑先前与HIV-1启动子的转录激活有关(38). 也有报道称核小体会对聚合酶延伸率产生负面影响，这种影响在整合HIV-1模板中也可以观察到(15).

这些观察结果以及本文报道的研究结果表明，Tat通过与p300结合而与起始前复合体相互作用，并与之共同调节多种功能。首先，这种复合物可以与NF-κB结合，从而进一步促进HIV转录(32). 其次，它可能诱导组蛋白乙酰化，从而导致染色质改变，促进转录和Tat功能。第三，这种相互作用似乎是在启动子处组装相关的Tat反应RNA聚合酶II复合物所必需的。值得注意的是，这种相互作用与对Tat有反应的转录复合物的组装有关，尽管p300-CBP复合物不太可能直接影响Tat缓解的转录延伸阻滞。Tat的基本结构域负责与p300和TAR结合，这表明二聚化的Tat可以促进与细胞因子形成适当的起始前复合物，如P-TEFb，促进与TAR结合；TFIIH，可能改变RNA聚合酶活性。最近，有报道称，一种新的细胞周期蛋白相关蛋白，即细胞周期蛋白T，与TAR结合Cdk9相互作用，由此产生的复合物以Tat依赖的方式缓解阻滞延长(41). Tat可以与p300相关的发现表明，HAT活性（来自p300或其相关蛋白之一）被招募到这个聚合酶复合体中，进一步促进了Tat对转录延伸的深远影响。

Tat蛋白形成二聚体(7)因此，它可能与p300和TAR RNA结构同时相互作用。或者，Tat可以分别结合TAR或p300。TAR RNA结构是否会以正或负的方式影响Tat与p300的相互作用尚待确定。Tat的二聚体可能是12S E1A无法完全抑制Tat依赖性转录激活的原因（图。​（图1B），1B） 相比之下，p300和Tat在刺激基因表达方面的实质性功能协同作用（图。​（图4C）。4C） ●●●●。因此，HIV-1 Tat可能在多个步骤发挥作用，包括与起始前复合体中的p300结合，然后与TAR结合，并向转录延伸复合体招募额外成分，以增强HIV基因表达和病毒复制。

致谢

参考文献