爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）是一种嗜淋巴性人类疱疹病毒，潜伏感染B淋巴细胞，导致受感染细胞伴随生长转化。感染与几种人类癌症密切相关，包括鼻咽癌和非洲伯基特淋巴瘤，并且在免疫缺陷患者的几种淋巴增殖性疾病中也起作用。在体外，EBV的转化潜力通过其使B淋巴细胞永生并在培养中无限期生长的能力得到证明。永生化是通过表达相对较小的EBV编码基因子集来实现的，这些基因用于建立和维持细胞转化（有关综述，请参阅参考文献28).
EBV在宿主之间的传播依赖于大约100个或更多病毒基因的激活，最终导致感染性病毒的产生(28). 虽然这些基因在潜伏期内保持静止，但通过使用各种试剂（包括佛波酯、丁酸盐、Ca）处理潜伏感染的B淋巴细胞，可以在体外完成导致病毒复制相关基因表达的遗传程序中的切换+2个离子载体和抗免疫球蛋白(三,14,27,35,46,50). 通过交联表面免疫球蛋白或重叠感染激活裂解级联反应，最初导致两个病毒基因BZLF1和BRLF1的表达，这两个基因表现出相似的诱导动力学（诱导后2到4小时达到最大mRNA水平）(4,17,45). BZLF1基因产物（此处称为Zta，但也称为ZEBRA和EB1）已被证明是转录激活物(6,8,15,20,21,32,40,47). Zta和Rta的表达导致早期基因的激活，最终导致病毒复制。在所有被检测的病毒转录因子中，Zta是唯一的，因为它的表达可以启动整个裂解级联反应(9,10,25,37)Zta表达的调节似乎是调节进入裂解周期的关键。
Zta与蛋白质的碱性亮氨酸拉链家族的转录因子具有结构相似性，并且与福君大家族，尤其是Fos，与之在DNA结合域上有很强的同源性(6,15,18,22,29,31). Zta二聚体结合并激活AP-1位点的转录(15,21,47)以及DNA复制的EBV裂解起源中存在的特殊Z反应元件(32). 反过来，存在于BZLF1启动子区的Zta和AP-1样位点在诱导Zta表达以响应抗表面免疫球蛋白抗体、Ca2+离子载体或佛波酯(7,11,19,44,47).
BZLF1启动子（Zp）表现出非常低的基础活性，该活性被病毒裂解周期的诱导物有效地上调(7,11,19,44,47). Zp从bp−221到+12的区域包含必要的顺式维持低基础活性和裂解周期诱导剂激活的元素(11,19). 在这个序列中，定义了三种不同类型的响应元素（见图。). 第一个是富含A+T的序列，称为ZI结构域，其四个拷贝散布在启动子（ZIA-D）中。第二个由一个独特的元素ZII表示，它与一致的CRE/AP-1结合位点具有同源性(1,12,26,30). 第三个由两个位点组成，称为ZIIIA和ZIIIB，它们结合BZLF1基因产物Zta(20). ZIIIA而非ZIIB是AP-1响应元素(20). BZLF1基因的诱导似乎涉及两个步骤：（i）通过ZI和ZII结构域介导的裂解周期诱导物对启动子的初始激活，导致BZLF基因的低水平转录；其次是（ii）BZLF1启动子的自激活，这是通过Zta结合到ZIIIA和ZIIIB结构域介导的。之前已经注意到，Zta活化与通过ZI和ZII结构域的诱导强烈协同（例如，由佛波酯触发）(20). 因此，有人提出，初始信号的持续时间和大小可以决定是否在适当的时间间隔内产生足够的Zta来触发整个裂解级联(20).
（A） 临界点示意图顺式与这些位点结合的元素和已知因子的区域为bp−221到Zp的+14。还报道了c-Jun和ATFa与ZII CRE/AP-1基序的结合（48）。ZIIR，假设细胞阻遏物与阴性结合顺式ZII域中CRE/AP-1基序上游的元素（见文本）。（B） ZID和ZII结构域区域中Zp的核苷酸序列。显示了用EBV阴性BL细胞系制备的核提取物保护DNA酶I消化的区域(19). 还总结了引入ZIIR元素的突变，其指定名称显示在左侧（见正文）。
Zp中的ZI结构域最近被证明与普遍存在的细胞转录因子Sp1和Sp3结合(5,33)和/或肌细胞增强因子2D（MEF2D）(5,34). ZIA和ZID域可以绑定Sp1、Sp3或MEF2D，而ZIB域只绑定MEF2D而ZIC域只绑定Sp1和Sp3（图。). 值得注意的是，我们之前已经证明，免疫抑制剂环孢菌素A和FK506可以抑制通过交联表面免疫球蛋白诱导EBV裂解周期(23)最近，我们发现这种敏感性取决于Zp MEF2位点（ZIA、ZIB或ZID）与ZII域的存在(34). 在本文中，我们剖析了ZII域并确定了两个不同的顺式该区域内的元素，之前提到的CREB/AP-1基序(16,20,42,48)和之前未识别的负片顺式元素。后者顺式该元素抑制Zp的基础转录和激活转录，并可能在调节EBV的激活中发挥重要作用。
材料和方法
细胞培养和转染。
EBV阴性的伯基特淋巴瘤B细胞系DG75在37°C的RPMI 1640培养基中生长，该培养基补充有10%热灭活的胎牛血清、100U青霉素和100mg链霉素/ml。如前所述，用DEAE葡聚糖和二甲基亚砜（DMSO）休克转染DG75细胞(5). 简单地说，107每次转染的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次，细胞颗粒重新悬浮在0.5ml无血清的RPMI 1640培养基中。将细胞添加到含有DEAE-右旋糖酐（1 mg/ml）和2μg质粒DNA的0.5 ml RPMI 1640培养基中。在室温下培养30分钟后，细胞受到二甲基亚砜休克（添加0.5毫升20%二甲基亚磺酸2分钟）。用PBS洗涤后，将细胞重新悬浮在含有10%血清的10 ml RPMI 1640中，并在37°C和5%CO中培养2孵化器。对于由佛波醇乙酸十四酯（TPA）和/或离子霉素诱导的反应，试剂的最终浓度分别为20 ng/ml和1μM（离子霉素）。蛋白激酶A（PKA）催化亚单位的过度表达是通过使用Rous肉瘤病毒长末端重复驱动表达载体实现的，之前已经描述过(36).
CAT和荧光素酶报告基因分析。
在转染后48至72小时收集转染细胞，并在PBS中清洗一次。对于氯霉素乙酰转移酶（CAT）检测，将细胞悬浮在100μl 0.25 M Tris-HCl（pH 7.5）中，并通过冻融进行三次裂解。离心后收集细胞裂解物，并如前所述进行报告基因测定(5,24). 用PhosphorImager（分子动力学）对乙酰化的氯霉素进行定量。为了评估荧光素酶活性，将细胞重新悬浮在细胞裂解缓冲液中，并根据制造商的方案（Promega）进行分析。
报告结构的构建。
−221ZpCAT报告子结构包含从bp−221到+12的BZLF1启动子序列，其构造如前所述(5,19). 人工启动子构建物3×ZIB-ZII-βGCAT和3×ZIC-ZII/βGCAT是通过克隆β-珠蛋白TATA盒上游的指示Zp元件来生成的，该元件驱动CAT报告基因在修饰的pGL2载体中的表达(5). 将3×ZIB元素克隆到艾娃我-Xba公司I限制位点，并且ZII元素被克隆到Xba公司我-巴姆HI站点。Zp元件的序列为：3×ZIB，5′-CCGGGCACCAGCTTATTTAGACATTACACTCCACACGCTTATTATACACTTCT-3′；3×ZIC，5′-CCGGGCTCCTCCTCTTTTTAGAAACTACTCCTCTTTTAAACTCCTCT CTTTTAGAAA CTACTCT CTTAGAAAAACTCTCTCTCCT CTTTGAAACTAT-3′；和1×ZII，5′-CATAGACGTCCAAACCATACATCACAGAGGAG-3′。一些人工启动子结构也被克隆到pGL-2荧光素酶报告质粒（Promega）中。
图中总结了引入ZII域的突变。,、和图中未显示的其他突变为：1×ZIIm2cm3，5′-CATAGACGTCaacAACCATGgtATCACAGAGGAG-3′；和3×ZIBm3，5′-CCGGGCACCAGgggATTTAGACACCACTCCACAGgATTTGACACACTCCAGgATttGACACCACAGGgATTTAACACTCT-3′（小写字母表示突变残基）。含有猴病毒40（SV40）早期启动子的pGL-2荧光素酶载体和含有SV40启动子和增强子的pGL-2控制载体购自Promega。胸苷激酶启动子荧光素酶质粒由David Leib（华盛顿大学医学院）慷慨提供。使用Xba公司一、 用Klenow和dNTP填充5′悬挑，并重新开始施工。通过在Xba公司I部位：垫片+10，5′-CTACGTTAC-3′；和垫片+15，5′-CTAGCGTTACGACTC-3′。所有突变体和人工启动子的结构经DNA测序证实。
一系列含有ZIC和ZII结构域的人工启动子构建物的活性，克隆于兔β-珠蛋白TATA盒上游，驱动CAT基因的转录(5). 有代表性的CAT分析与人工启动子结构的示意图一起显示。1×ZII-βgCAT、1×ZIC-1×ZII-βgCAT和3×ZIC-1×ZII-βgCAT报告构建体的活性已在先前发表(5)此处显示的和用于与包含ZII域的多个副本的报告器构造的活动进行比较。如材料和方法中所述，将报告构建物瞬时转染到EBV阴性BL细胞系DG75中。如图所示，在没有和存在TPA（最终浓度为10 ng/ml）的情况下，对每个构建体的活性进行分析。
由Zp或Zp（cm4）突变体驱动的报告结构的cAMP诱导性分析。（A） 如材料和方法中所述，将−221ZpLuciferase报告子结构与驱动蛋白激酶A催化亚单位表达的载体瞬时转染DG75细胞。转染细胞用TPA（10 ng/ml）和离子霉素（1μM）处理指定时间，然后在Tuner Designs光度计（Promega）上测定萤火虫荧光素酶活性。在每种条件下观察到的活动以相对光单位表示。数据来自六个独立的实验，并显示了平均值的标准误差。（B） 如材料和方法中所述，用−221ZpCAT或含有CRE/AP-1基序[−221Zp（cm4）CAT]突变的等效报告构建体瞬时转染DG75细胞。转染细胞未经处理或用指定试剂处理48小时。在转染后48小时收集细胞并检测CAT活性。显示了相对于未诱导−221ZpCAT报告子结构活性的折叠诱导。以0.3 mM的最终浓度使用CPT-cAMP。将TPA添加到10 ng/ml的最终浓度，并将离子霉素添加到1μM的最终密度。数据由三个独立的实验汇编而成，并显示了平均值的标准误差。
EMSA。
DG75核提取物的制备如前所述(2,13)，并将等分样品储存在−70°C下。用T4多核苷酸激酶和[γ-32P] ATP。EMSA反应的总体积为25μl[20 mM Tris-HCl（pH 7.9）、10%甘油、0.1 M KCl、0.5 mM苯甲基磺酰氟、0.5 mM二硫苏糖醇、1μg聚（dI-dC）（dI-d C）、5μg DG75粗核提取物]。在室温下培养5分钟后，32添加P标记探针（25000 cpm），并继续培养25 min。将反应混合物加载到4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在0.5×Tris-硼酸盐-EDTA中电泳（1×Tris-borate-EDTA为90 mM Tris、64.6 mM硼酸和2.5 mM EDTA[PH8.3]）。使用添加探针之前添加的未标记双链DNA寡核苷酸进行竞争分析。使用1μg抗ATF-1、ATF-2、CREB结合蛋白、c-Jun或c-Fos（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）的抗体进行超移实验。EMSA中使用的寡核苷酸的正义链序列为ZII，5′-ACGTCACAACCATGACATCACAGAGGAG-3′和ZIIcm3，5′-ACGTCCCAAACCATGgtATCACAGAGAG-3’。
DNA酶I足迹。
DNase I足迹分析基本上如前所述(19). 80微克核提取物与32在10 mM Tris（pH 7.9）、0.5 mM EDTA、0.5 mM-二硫苏糖醇、5%甘油和2%聚乙烯醇中加入1μg聚（dI-dC）（dI-d C）的P标记DNA，总体积为50μl。在室温下孵育20 min后，添加DNase I，让反应孵育30 s。通过添加120μl停止缓冲液（8 M尿素、0.5%十二烷基硫酸钠、5 mM EDTA）终止消化，然后用苯酚萃取样品两次，用酚氯仿（1:1）萃取样品两遍，一次用氯仿。用乙醇沉淀回收裂解的DNA，并用8%变性（7M尿素）丙烯酰胺凝胶分离样品，如前所述(2).
结果
ZII域的CRE/AP-1站点是积极的顺式Zp诱导所需的元素。
以前对Zp的有限突变提供了证据，证明ZII结构域中的CRE/AP-1基序对于已知的裂解周期诱导剂诱导Zp是必要的(11,19). 我们最近报道了克隆到含有β-珠蛋白TATA盒驱动CAT报告基因表达的人工启动子构建物中的多聚ZI结构域（一到三个拷贝）的活性因ZII结构域的单个拷贝（1×）的存在而大大增强（图。) (5,7,33,34). 然而，当ZII结构域被多重聚合（单独或与ZIC结构域的三个拷贝（3×）结合）并克隆到驱动CAT基因表达的最小启动子（β-珠蛋白TATA盒）上游（3×ZII-βGCAT或3×ZIC-3×ZII/βGCAT）时，这些报告结构体未表现出任何可检测到的基础或佛波酯诱导活性。这一观察结果表明，ZII结构域可能由多个顺式元素，可以导致转录的激活或抑制。
为了进一步从功能上剖析ZII结构域，我们构建了一系列跨越CRE/AP-1基序的2-bp突变（参见插图至图。). 然后将这些突变并入含有三个ZIB结构域拷贝的人工启动子构建物中，该结构域链接到pGL-2荧光素酶报告质粒（Promega）中最小β-珠蛋白启动子上游克隆的野生型（wt）或突变ZII结构域的单个拷贝。值得注意的是，我们之前已经表明，3×ZIB-1×ZII-βGCAT报告子结构的行为与完整的BZLF1启动子的行为非常相似(34). 在EBV阴性的Burkitt淋巴瘤细胞系DG75中评估了这些报告构建物的TPA和离子霉素诱导性（图。). 该分析表明，破坏核心CRE/AP-1基序的突变严重削弱了TPA和异构酶诱导活性。
ZII结构域内CRE/AP-1基序突变对3×ZIB-1×ZII-βg荧光素酶报告基因构建物的TPA和/或离子霉素诱导性的影响。人工启动子构建体，3×ZIB-1×ZII-βg萤光素酶，如材料和方法中所述产生。引入ZII结构域的突变如插图所示。如材料和方法所述，瞬时转染EBV阴性BL细胞系DG75，并在转染后48 h收集细胞裂解物。TPA和离子霉素的最终浓度分别为10 ng/ml和1μM。根据未诱导wt结构的活性计算折叠诱导。所示数据代表了两个独立实验的结果，并指出了平均值的标准误差。
为了扩展这一分析，利用DG75细胞系制备的粗核提取物，通过EMSA评估与ZII结构域的蛋白质结合（图。). EMSA和wt-ZII结构域探针观察到两种主要的蛋白质-DNA复合物。这些复合物具有特异性，因为它们可以被wt ZII结构域探针竞争，但不能被CRE/AP-1基序核心中含有突变的ZII结构区探针（ZIIcm4突变探针）竞争（见图。A） ●●●●。重要的是，EMSA观察到的两个主要络合物的形成之间存在直接关联（图。)ZII突变体的活性（图。). 因此，功能性CRE/AP-1基序似乎对该人工启动子结构的活性至关重要。
EMSA与32含有wt ZII结构域或ZII CRE/AP-1基序中指示突变的P标记探针。使用DG75细胞系的粗核提取物，如材料和方法所述。ZII结构域突变体的核苷酸序列如图所示。EMSA结合反应条件如材料和方法中所述。凝胶左侧的箭头表示形成的特定复合物。
与ZII结构域结合的细胞因子分析。（A） 与wt和cm4突变的ZII结构域寡核苷酸以及包含一致CREB结合位点的寡核苷酸结合到ZII DNA探针的竞争（向EMSA结合反应中添加100 ng每个冷寡核苷酸竞争对手）。此外，还显示了pan-CREB抗体（见正文）超移观察到的复合物的能力，以及结合或重组CREB蛋白的能力。材料和方法中描述了EMSA、抗体超转移和重组CREB蛋白结合的条件。（B和C）使用针对特定CREB/ATF或AP-1家族成员的抗体的特定复合物的抗体超转移。对于每个超转移分析，按照材料和方法中的描述，向EMSA反应中添加1μg抗体。所有抗体均购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。
ATF-1和ATF-2与ZII结构域中的CRE/AP-1位点结合。
为了解决哪些细胞因子与ZII结构域中的CRE/AP-1基序结合，我们证明了含有一致CRE位点的寡核苷酸可以与EMSA使用wt-ZII结构区探针观察到的复合物形成竞争（图。A） ●●●●。此外，当pan-CREB兔多克隆抗体（抗血清244；针对含有人类CREB-1蛋白128至162残基的肽进行培养时，该区域在许多CREB/ATF家族成员中非常保守[49])，与EMSA反应孵育后，较低的络合物消失，在缓慢迁移络合物上方可检测到微弱的超位移（图。A） ●●●●。在其他分析中，该抗体导致更强的超位移，如图所示。C（α-creb）。将ZII结构域探针与重组CREB-1蛋白孵育后，发现复合物的形成类似于EMSA与DG75核提取物观察到的较低复合物的迁移（图。A） ●●●●。将pan-CREB兔多克隆抗体添加到含有重组CREB-1蛋白的EMSA反应中，导致超位移，其迁移位置与EMSA使用DG75核提取物观察到的上复合物的位置相似。因此，对于DG75核提取物，将兔多克隆抗体添加到EMSA反应中可能导致与上部复合物共迁移的超迁移下部复合物，而部分或全部上部复合物的超迁移可能导致迁移较慢的超迁移复合物的出现。
为了进一步解决哪些细胞因子与CRE/AP-1基序结合的问题，我们使用了针对特定CREB和AP-1家族成员的抗体（图。B和C）。抗-ATF-1抗体导致较低的复合物发生强烈的超位移，基于增加的带强度（最明显的是图。C） 似乎与上层建筑融为一体。抗ATF-2抗体似乎会使顶部复合物的一部分发生超位移（图。B） ●●●●。此外，EMSA在某些情况下观察到抗CREB-1抗体对低复合物的弱超位移（图。B） ●●●●。然而，针对CREB-2、ATF-3、ATF-4、CREB-结合蛋白、c-Jun或c-Fos的抗体似乎没有改变上下复合物（图。B和C）。因此，ATF-1和ATF-2似乎是DG75核提取物中结合ZII结构域的主要细胞因子。目前尚不清楚这些因子是以同二聚体形式结合还是以异二聚体的形式与其他尚未确认的CREB/ATF或AP-1家族成员结合。
对与ZII结构域结合的CREB/ATF家族成员的鉴定提出了Zp是否可由cAMP诱导的问题(39,41). 我们最初评估了PKA催化亚单位的过度表达是否可以增强TPA和离子霉素对Zp的诱导作用（图。A） ●●●●。虽然PKA催化亚单位的表达对TPA和离子霉素处理12小时后Zp的激活水平没有影响，但在TPA和电离霉素诱导24小时后观察到五倍的增强（图。A） ●●●●。在细胞暴露于TPA和离子霉素48小时后，TPA和Zp的离子霉素诱导增加量略低（约为三倍）（图。A） ●●●●。此外，我们利用cAMP类似物8-氯苯基硫代-cAMP（CPT-cAMP）评估了cAMP对Zp的诱导作用。将CPT-cAMP添加到瞬时转染wt Zp（−221ZpCAT）报告结构或包含CRE/AP-1基序−221 Zp（cm4）CAT突变的同一报告结构的DG75细胞中，不会导致可检测到的Zp活性诱导（图。B） ●●●●。然而，CPT-cAMP能够增强TPA、离子霉素或TPA和离子霉素的组合对Zp的诱导作用（图。B） ●●●●。此外，CRE/AP-1基序的突变几乎完全消除了这些试剂的任何组合对Zp的诱导作用，强调了这一关键作用顺式元素在Zp的转录起始中起作用。这些结果表明，仅cAMP不足以激活Zp的转录，但可以增强TPA和离子霉素的诱导作用。
ZII结构域CRE/AP-1基序上游的突变揭示了一个潜在的负性顺式元素。
识别其他顺式我们引入了一系列3-bp突变（m1到m3；见图。)CRE/AP-1基序的上游。如上所述，这些突变被克隆到人工启动子结构中，该结构由ZIB结构域的三个拷贝组成，与最小β-珠蛋白TATA盒上游的wt或突变ZII结构域的单个拷贝相连。令人惊讶的是，所有三个引入CRE/AP-1基序上游的突变都强烈增强了Zp的诱导性，其中m2突变的影响最大（TPA-plus-ionomycin诱导的活性增加了15倍以上；图。). 为了确保这不是无意中产生转录激活物结合位点的结果，一个明显的突变（m2a；图。B） 被引入ZII域。m2a突变体的活性与m2突变体的几乎没有区别（数据未显示）。m4突变，破坏CRE/AP-1基序（该突变与先前报道的MII突变相同[19])，几乎完全消除了人工启动子的诱导性（图。).
ZII结构域CRE/AP-1基序上游区域突变对TPA和/或离子霉素诱导的影响。插入物中显示的突变在3×ZIB-1×ZII-βgCAT报告子结构的上下文中引入ZII域。在DG75细胞中进行转染，并在转染后48至72小时收集细胞裂解物以进行CAT分析。它们对突变体3×ZIB-ZII-CAT构建体的相对诱导是相对于wt 3×ZIB-ZII的TPA离子霉素诱导的活性。所提供的数据来自四个独立的转染和CAT测定，并显示了平均值的标准误差。
为了确定在完整的BZLF1启动子的背景下，是否也观察到CRE/AP-1上游区域突变后观察到的3×ZIB-ZII-βgCAT报告子结构的活性增强，一个5 bp的突变（它引入了诊断生态RI站点）被设计到Zp[Zp（Rm）；图。B] 在−221ZpCAT报告结构的上下文中。如3×ZIB-ZIIm2-βgCAT报告子结构所观察到的，在Zp的这个区域引入突变也显著增加了启动子活性（TPA-plus-ionomycin诱导的活性增加了10倍以上；见图。A） ●●●●。如图的插图所示。A、 这个阴性突变顺式元素导致基础以及TPA-、离子霉素和TPA-plus-ionomycin诱导的Zp活性增加。后者表明这一点顺式元素在潜伏期抑制Zp活性中可能起重要作用。基于Zp活性的抑制，我们将其命名为顺式ZII结构域阻遏物的ZIIR元素。
−221ZpCAT报告子结构背景下的ZIIR元素突变。引入ZIIR元素（ZIIRm）的突变如图所示。（A）将wt（−221ZpCAT）和突变报告基因构建物（−22 1ZpRmCAT）瞬时转染到DG75细胞系中，并按照材料和方法中的描述评估CAT活性。如图所示，在TPA（20 ng/ml）和/或离子霉素（1μM）存在或不存在的情况下培养转基因细胞。活性是相对于TPA-plus-ionomycin诱导的wt−221ZpCAT报告子结构的活性给出的。插图显示了ZIIRm突变对基础、TPA-和离子粘蛋白诱导的活性的影响。TPA和离子霉素对−221ZpCAT结构体相对于未诱导活性的平均诱导为444倍，而−221 ZpRmCAT结构物相对于未诱导活动的平均诱导是5722倍。给出的数据代表了四个独立的实验，并显示了平均值的标准误差。（B） 在EBV阳性BL细胞系克隆16（Cl-16）和EBV阴性T细胞系Jurkat中评估wt（−221ZpCAT）和突变（−22 1ZpRmCAT）报告结构的活性。转染细胞在TPA（20 ng/ml）和离子霉素（1μM）存在下培养。显示了TPA-plus-ionomycin诱导的突变体和wt报告结构活性的比率。数据代表至少两个独立的实验，并显示了平均值的标准误差。
消除ZIIR抑制Zp活性的可能性顺式元素是EBV阴性DG75 BL细胞系所特有的，我们在另外两种细胞系（EBV阳性BL细胞系克隆16和EBV阴性T细胞系Jurkat）中检测了−221ZpRm报告子构建体的活性。如图所示。B、 在克隆16细胞系和Jurkat细胞系中，−221ZpRm报告子结构的活性均显著高于未突变的报告子结构（TPA-plus-ionomycin诱导的活性增加了约7倍），而TPA-plus-ionomicin诱导的活动增加了约45倍）。因此，ZIIR的抑制功能顺式元素似乎不限于特定的单元格类型。
ZIIR抑制启动子活性顺式元素是上下文相关的。
为了确定ZIIR是否能抑制异源启动子的活性顺式元件被克隆到SV40早期启动子的上游（图。A） 或单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（数据未显示）。在这两种情况下，无论是否存在佛波酯，均未观察到启动子活性受到抑制。作为阴性对照，突变的ZIIR元件（ZIIRm）的三个拷贝也被克隆到这些异源启动子的上游，同样没有观察到对启动子活性的影响（图。A和数据未显示）。综上所述，这些数据表明ZIIR在启动子中的位置可能对其功能至关重要。
（A） ZIIR元件无法抑制SV40早期启动子的转录。如材料和方法中所述，在无增强子SV40启动子上游克隆一个或三个ZIIR元件拷贝。此外，作为对照，突变的ZIIR元素（ZIIRm；见图。)也克隆到SV40启动子上游。将这些报告构建物瞬时转染到DG75细胞系中，并测定未诱导和TPA诱导的活性。活动以相对光单位（rlu）表示。数据表示两个独立实验的平均值，并显示平均值的标准误差。（B） 在3×ZIC-ZII-βgCAT报告子结构背景下突变ZIIR元素的影响。前面已经描述了3×ZIC-ZII-βgCAT报告子结构（5）。所示数据代表三个独立的分析，并显示平均值的标准误差。折叠诱导是相对于未诱导报告子结构的活性推导出来的。
为了解决绑定在ZIIR上游的特定细胞因子是否会影响所观察到的抑制或激活水平的问题，我们用Zp的三个ZIC结构域拷贝替换了3×ZI-ZII-βgCAT和3×ZI-ZIIm2-βgCAT报告子结构中的三个ZIB结构域拷贝。我们之前曾报道过，ZIC元素绑定Sp1和Sp3，但不绑定MEF2D，而ZIB元素绑定MEF2C，而不绑定Sp1或Sp3（如图所示。A）(5,33,34). ZIIR突变只导致启动子活性适度增强（<2倍；图。B） 当比较3×ZIC-ZII-βgCAT和3×ZIC-ZIIm2-βgCAT。基于这些结果，ZIIR施加的抑制似乎是上下文敏感的。
ZIIR可能参与调节与ZIB元素结合的MEF2D与与ZII CRE/AP-1基序结合的因子之间的协同作用。为了解决ZIIR功能是否需要一个功能CRE/AP-1基序和一个功能MEF2D域的问题，生成了几个人工启动子结构，包含wt和突变ZIB和ZII域的各种组合。将其瞬时转染到DG75细胞系中，并检测未诱导和TPA加离子霉素诱导的活性（图。). 在仅含有β-珠蛋白TATA盒上游ZII结构域单一拷贝的人工启动子（ZIIm2和ZIIm2a；见图。B代表突变）导致相对于未突变ZII结构域的活性适度增强（图。). 在ZIIR突变（ZIIm2cm3）的背景下，CRE/AP-1基序的突变消除了观察到的诱导性，证明了功能性CRE/AP1基序的需要（图。). 3×ZIB-ZII-βgCAT报告子中CRE/AP-1基序或MEF2D结合位点的突变严重降低了诱导活性（参见[ZIBm3]三[ZII]和[ZIB]三图中[ZIIcm3]。). 在含有突变的MEF2D位点或突变的CRE/AP-1位点的人工启动子的背景下突变ZIIR导致活性降低（3×ZIB-ZIIm2cm3和3×ZIBm3-ZIIm2；图。). 最后，在人工启动子的背景下，ZIIR的突变，其中MEF2D位点和CRE/AP-1基序已经突变，导致很少或没有可检测的激活（3×ZIBm3-ZIIm2cm3；图。). 因此，这些结果与ZIIR功能调节MEF2D和与ZII CRE/AP-1基序结合的因子之间的协同作用的假设一致。
通过突变ZIIR元件观察到的去抑郁需要功能性CRE/AP-1基序和/或功能性MEF2D结合位点。将含有不同wt和突变ZIB和ZII结构域组合的人工启动子构建物转染到DG75细胞系中，然后用TPA（10 ng/ml）和离子霉素（1.0μM）诱导。报告结构的活性显示为相对于3×ZIB-βgCAT报告结构（定义为1.0）的活性。未显示3×ZIB-1×ZIIm2-βgCAT报告子结构的活性（相对活性，>2000）。给出的数据由两个独立的实验汇编而成，并显示了平均值的标准误差。
MEF2D和CRE/AP-1元件在DNA螺旋上的相对位置影响TPA和离子霉素的诱导性，并且独立于ZIIR结构域。
为了确定ZII结构域上游ZIB元素的距离和方向是否对活性和ZIIR功能产生影响，生成了几个修改的3×ZIB-ZII-βgCAT和3×ZIP-ZIIm2-βgCAT-报告结构。ZII结构域和3×ZIB盒之间的距离增加了4、10或15 bp。对于3×ZIB-ZII-βgCAT（图。)而3×ZIB-ZIIm2-βgCAT（数据未显示）将ZIB结构域和ZII结构域之间的距离增加4或15 bp，导致TPA、离子霉素和TPA加离子霉素诱导性显著降低。然而，将这些结构域之间的距离增加10 bp会导致这些结构体的诱导性略有增强。这表明MEF2D和CRE/AP-1的阶段化顺式DNA螺旋上的元素对观察到的协同作用有着深刻的影响。如图所示。，最初的人工启动子结构设计为顺式元素位于螺旋线的同一侧(5).
MEF2D位点相对于CRE/AP-1基序的阶段性变化的影响。如材料和方法中所述，将3×ZIB-ZII-βgCAT报告子结构体和包含ZII结构域和指定长度的ZIB结构域之间间隔的衍生物瞬时转染到DG75细胞系中。转染细胞未经处理或用TPA（10 ng/ml）和/或离子霉素（1.0μM）诱导。这些活性是相对于TPA-plus-ionomycin诱导的父报告结构（无间隔物）的活性进行计算的，其定义为1.0。数据表示四个独立实验的平均值，并显示平均值的标准误差。
与ZII结构域结合的细胞蛋白的表征未能鉴定与ZIIR元件形成的特定复合物。
根据ZIIR元素的行为，它可能通过结合细胞阻遏物发挥作用。然而，EMSA多次尝试都未能确定依赖ZIIR元件的特定蛋白-DNA复合物。值得注意的是，我们最初通过使用DNA酶I足迹分析和粗制B细胞核提取物对Zp蛋白结合的分析，证明了ZIIR元素的至少部分保护作用（如图所示）。B）(19). 因此，为了评估DNase I足迹分析检测到EMSA无法轻易识别的细胞因子结合的可能性，利用wt和突变模板以及DG75核提取物进行了DNaseⅠ足迹分析（图。). 令人惊讶的是，ZIIR（ZIIrm）突变并没有消除DG75核提取物对该区域的保护作用（图。). 这一结果表明，MEF2D与ZID结构域的结合以及CREB/ATF因子与ZII结构域的结合足以防止ZIIR元件内的DNase I切割。因此，无论是EMSA还是DNase I足迹分析都无法提供细胞因子与ZIIR结合的直接证据，这一机制尚未解决顺式元素函数。
利用DG75细胞制备的粗核提取物对wt−221Zp和ZIIRm突变体（−221 ZpRm）进行DNase I保护分析。如材料和方法所述，分析了正链[Zp（+）]和反链[Zp（−）]的保护作用。显示了ZII和ZID域的位置。分机，存在DG75核提取物；无Ext.，无核提取物。
讨论
在本报告中，我们分析了ZII结构域内的功能元件，该区域以前被确定为Zp诱导的关键区域(5,7,11,19,20). 许多研究人员已经注意到一个清晰可识别的CRE/AP-1基序，在我们对Zp的最初表征中，我们证明了破坏该基序的突变（MII）严重降低了TPA的诱导性(19). 最近，发表了两份关于ZII域的独立分析(42,48). 鲁夫和罗林斯(42)报道了一种他们称之为ZIIBC的复合物的特征。据报道，该复合物由26和36 kDa蛋白组成，并能与ZII CRE/AP-1基序结合。然而，这些研究人员无法使用针对广泛CREB和AP-1家族成员的抗体试剂来鉴定这种复合物的成分。Wang等人还报告了与ZII域结合的因子的详细分析(48)他鉴定了12种不同的DNA蛋白复合物。这些研究人员能够确定其中一些复合物中是否存在ATFa、ATF-1、ATF-2和c-Jun。此外，他们证明ATF-1的过度表达导致Zp驱动的报告结构的激活。值得注意的是，一些观察到的复合物的形成与CRE/AP-1基序无关，可能反映了与ZIIR元素的结合。
在这里提出的分析中，我们通过EMSA确定了两个主要络合物，并能够证明ATF-1，也许CREB-1在较低络合物中存在，ATF-2在较高络合物中也存在。根据Wang等人获得的结果(48)，似乎我们观察到的迁移速度更快的复合物对应于四个迁移紧密的复合物，它们被称为第二组，其中两个含有ATF-1。同样，我们通过EMSA观察到的上部复合物可能与Wang等人(48)指第一组，其中两组含有ATF-2。令人惊讶的是，我们未能检测到第四组中明显丰富的复合物。这可能反映了核提取物制备的差异，或者未能从凝胶中的自由探针中解析这些复合物。值得注意的是，Wang等人未能确定任何与形成第三组或第四组复合物（迁移最快的复合物）有关的细胞因子。目前，尚不清楚哪种细胞因子对Zp在体内的功能很重要，尽管这些研究人员确实证明了ATF-1的过表达激活了Zp(48)提示ATF-1可能对Zp活性很重要。
大量负面信息顺式在BZLF1基因转录起始位点上游的区域已鉴定出一些元素(38). 细胞阻遏物YY1的三个结合位点已在bp−300到−450的区域中确定(38). 两个远端YY1结合位点的缺失导致启动子活性显著上调，而YY1的过度表达则下调Zp活性。此外，据报道，五个H1基序具有负性功能顺式元素，已确定(43). 其中四幅地图位于约-280至-450 bp的区域，而第五幅地图位于ZII域的下游。在远端H1基序中，有两个与已鉴定的YY1结合位点重叠(38). 这些研究人员报告称，在诱导病毒裂解周期时，与远端H1基序的结合被消除，这表明它们在潜伏期间对下调Zp活性很重要(43). 值得注意的是，除了ZII域下游的H1基序映射外，所有识别出的阴性顺式bp−221上游的元素图。因此，这些远端阴性顺式元素不能解释含有bp−221到+12序列的Zp驱动报告基因结构所显示的极低的基础活性。
在本文中，我们确定了一个强有力的否定顺式ZIIR元素，可能在潜伏期内从Zp下调转录中发挥重要作用。ZIIR很可能与细胞阻遏物结合，但到目前为止，我们还未能检测到与该结构域结合的特定蛋白复合物。或者，结合CRE/AP-1基序的复合物之一可能用于抑制转录，并且该复合物的结合对CRE/AP1基序上游区域的突变敏感。如果后者属实，则该复合物要么无法与EMSA观察到的其他CREB/ATF复合物区分开来，要么无法被EMSA检测到。ZpRm突变体的DNase I足迹分析表明，尽管甲基化干扰分析未能确定该区域内的任何接触者，但ZIIR区域受到B细胞核提取物的DNaseI消化的保护（数据未显示）。体内足迹可能有助于阐明这一问题。此外，产生携带ZIIRm突变的EBV株将有助于明确了解这种阴性的作用顺式调节病毒潜伏期的元素。
