《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8214–8219.
流感病毒RNA聚合酶作用于病毒RNA的5′端顺式至聚腺苷酸mRNA
摘要
我们之前通过有限的突变证明，流感病毒病毒RNA（vRNA）5′端的保守序列元件是体外mRNA多聚腺苷化所必需的。为了进一步表征可能参与多聚腺苷酸化的vRNA 5′端核苷酸残基，我们在体外合成并转录了一套完整的短型和长型vRNA样模板，该模板在vRNA的核苷酸1′至13′（素数表示从5′端开始编号）发生突变。用逆转录PCR和[α-32P] ATP掺入分析。这些独立分析的结果表明，与在位置1′、4′至6′和10′突变的vRNA模板相比，在位置2′、3′、7′至9′和11′至13′突变的vRNA模板合成聚腺苷化转录物的效率较低。已知位置2′、3′、7′至9′和11′参与RNA聚合酶结合。此外，已知位于11′至13′位置的残基参与了vRNA 3′端和5′端之间的碱基配对。这些发现表明，RNA聚合酶必须与模板vRNA的5′端结合，而模板vRNA必须与同一模板的3′端相互作用才能发生聚腺苷酸化。这些结果支持一个模型，其中顺式-流感病毒的多聚腺苷化需要活性RNA聚合酶。
甲型流感病毒含有八段负性单链RNA(19). 这些RNA片段与核蛋白和三种P蛋白（PB1、PB2和PA）结合，形成核糖核蛋白（RNP）复合体，负责病毒基因组的转录和复制。在病毒的生命周期中，病毒粒子RNA（vRNA）基因组转录成mRNA并复制成cRNA。cRNA是vRNA的全长拷贝，是vRNA合成的模板(13). 相反，mRNA是vRNA的不完整拷贝。mRNA的转录是由一个被限制的RNA片段启动的，该RNA片段通过聚合酶复合体的内切酶活性从宿主mRNA上切割下来(21). mRNA合成终止于vRNA模板5′端约17个核苷酸（nt）的尿苷轨道，然后发生多聚腺苷化。聚合酶复合物（PB1、PB2和PA）负责转录和复制(7)，但控制转录和复制交替模式的因素尚不清楚。核蛋白可能通过抑制cRNA合成的过早终止而参与从转录到复制的“转换”(1,28).
所有8个vRNA片段的3′端和5′端分别有12和13 nt的保守序列，它们部分互补，被认为是RNA转录和复制的调控元件(三,24). 体外和体内系统的最新发展使得研究用于调节流感病毒vRNA、cRNA和mRNA合成的RNA信号成为可能(8,10,11,16–18,20,23,26). 体内研究表明，甲型流感病毒26 3′端和22 5′端nt的模型vRNA模板含有转录和复制信号，以及将RNA包装成病毒颗粒的信号(16). 最初，保守的3′端被认为足以作为mRNA和cRNA合成的启动子(20,26). 然而，进一步的体外研究表明，保守的5′端含有聚合酶结合位点(4,30)聚合酶需要3′端和5′端来启动转录(4,5)和内切酶活性(2,6).
流感病毒信使核糖核酸的早期序列分析表明，多腺苷酸化位点是尿苷残基的轨迹（5至7个残基长，即U5–7)vRNA的5′端附近(24,25). 由于尿苷的轨道紧邻预测的碱基配对区，这一观察结果导致了一个多聚腺苷化模型，其中碱基配对区域充当病毒转录的物理屏障(25). 因此，病毒聚合酶不是转录vRNA的5′端，而是反复复制U5–7追踪，从而在mRNA的3′端添加poly（a）尾巴。随后，体内研究表明，U5–7轨迹和相邻碱基配对区对于氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因的表达是必不可少的(14,15). 然而，5′vRNA末端参与转录起始和聚合酶结合提示了一种新的聚腺苷酸化模型(4,30). 在这个修正的模型中，由于空间位阻，聚合酶无法转录与其结合的5′末端序列。相反，重复复制U5–7轨迹会导致在转录本中添加poly（a）tail。我们最近的研究通过证明vRNA的5′端是聚腺苷酸化所必需的来支持这个新模型(23).
在这里，为了进一步了解控制多聚腺苷酸化的分子机制，构建了vRNA保守5′末端13个残基中每个残基的点突变，并通过两种独立的体外实验对多聚腺苷酸酸化进行了表征(23). 我们发现已知参与聚合酶结合的残基(4)聚腺苷酸化需要。此外，已知的残基对聚合酶结合不重要，但已知的是RNA叉结构中3′端和5′端之间的碱基配对所需的残基(4)聚腺苷化也需要。这些观察结果表明，流感病毒RNA聚合酶复合物必须与模板vRNA的5′端结合，并进一步暗示模板vRNA 5′端必须与同一模板的3′端相互作用才能发生聚腺苷酸化。
材料和方法
甲型流感病毒聚合酶的制备。
如前所述，从A型流感病毒株X31中分离出RNA聚合酶，X31是A/HK/8/68和A/PR/8/34的重配子(26). 简而言之，病毒被Triton X-100和溶血磷脂破坏。然后通过甘油梯度离心分离RNP，然后通过微球菌核酸酶（Sigma）消化去除内源性vRNA。
质粒的构建。
717-nt长的野生型RNA及其突变体是由pBXPCAT1（Palese P.的礼物）及其衍生物合成的。质粒pBXPCAT1编码一个717-nt长的RNA，该RNA带有一个反义CAT基因，其两侧有来自流感病毒a/PR/8/34片段8的连接子序列和vRNA末端序列（图。A）(14). PCR合成pBXPCAT1突变质粒(22). 编码野生型49米RNA及其突变体的质粒（图。B） 通过消化pBXPCAT或其衍生物获得Xho公司我和Bgl公司二、 最后填充Klenow片段，并重新注入T4 DNA连接酶。所有突变序列均经DNA测序证实。
用于体外流感病毒转录反应的RNA模板。RNA分支模型中的拟议碱基对(4,5)用垂直线表示。素数表示从5′端开始的核苷酸编号，以区别于3′端的核苷酸(4). 从1′到13′位置的点突变指示在序列上方。U型6轨道，即提议的poly（A）站点，采用黑体字。（A） 717-nt模板的顺序。箭头表示Xho公司我和Bgl公司质粒pBXPCAT1中的II位点。下划线和上划线分别表示CAT基因的起始密码子和终止密码子。（B） 49聚体模板的序列。
RNA模板制备。
在含有0.25μgBpu公司AI-线性质粒DNA、10 U胎盘核糖核酸酶抑制剂、1 mM每个三磷酸核苷（NTP）、40 mM Tris-HCl（pH 8.0）、8 mM MgCl2、50 mM NaCl、2 mM亚精胺和10 mM二硫苏糖醇。反应混合物在37°C下孵育20分钟至2小时，然后在37°C下与2U无RNase DNase I孵育10分钟。通过酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化RNA。RNA模板通过凝胶电泳和溴化乙锭染色（717-nt RNAs）或RNA凝胶电泳定量，RNA凝胶电泳用多核苷酸激酶和[γ]标记-32P] ATP，然后是荧光成像仪（分子动力学）分析（49米RNA）。除了在[α-32P] ATP掺入试验（见结果），试验中的每种流感病毒反应使用相同数量的每个模板RNA。
体外流感病毒转录。
5至20μl反应混合物包含0.1至1μg RNA模板、1μg核酸酶处理的RNP（约5 ng聚合酶蛋白[27])，每个NTP 500μM，0.5 mM腺苷酸（3′→5′）鸟苷（ApG），50 mM Tris-HCl（pH 7.4），50 mmM KCl，10 mM NaCl，5 mM MgCl25 mM二硫苏糖醇和10 U胎盘核糖核酸酶抑制剂。反应在30°C下孵育3小时。49米RNA的反应产物通过凝胶电泳进行分析（见下文：[α-32P] ATP掺入分析），717-nt vRNA的反应产物直接用于逆转录-PCR（RT-PCR）分析（见下文：RT-PCR分析）。
[α-32P] ATP掺入试验。
体外转录混合物中的ATP浓度降低至25μM，[α-32P] 将ATP（3000 Ci/mmol）（Amersham）添加到5-μl反应混合物中。将反应混合物在30°C下培养3 h。反应产物是萃取酚氯仿，并在乙醇中沉淀10μg大肠杆菌载体tRNA和2.4 M醋酸铵。RNA颗粒在甲酰胺负载染料中重新悬浮，在99°C下加热3分钟，并在16%聚丙烯酰胺-7 M尿素凝胶上进行分析。为了量化mRNA产物的产量，将凝胶干燥，并通过磷成像仪分析检查mRNA产物高分子量涂片。
RT-PCR分析。
体外转录反应中717-nt vRNA的聚腺苷化产物在含有50 pmol的5′GC-夹心T的10μl反应混合物中进行反转录20底漆（5′-GCCCGGGATCCT20-3′），每个dNTP 200μM，10 U胎盘RNase抑制剂，100 U Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（Promega），10 mM Tris-HCl（pH 9.0），50 mM KCl，2.5 mM MgCl2，和0.1%Triton X-100在40°C下保持20分钟。50皮摩尔CAT特异性引物（5′-CGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAGGG-3′）和1.5 U塔克将聚合酶添加到反转录产物中，然后通过PCR进行扩增（94°C下30s，65°C下30min，72°C下2min），共33个周期。PCR产物在TAE缓冲液（40 mM Tris碱、20 mM乙酸、1 mM EDTA）中1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。为了观察717-nt RNA模板合成的cRNA，将5μl转录反应混合物设置为含有10μCi的[α-32P] CTP（800 Ci/mmol）和50μM CTP。用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳和8M尿素分析cRNA产物。干燥凝胶，并通过磷成像仪分析检查cRNA产物。
结果
5′vRNA保守序列的点突变对多聚腺苷酸化的影响。
在本研究中，我们通过构建点突变来研究流感病毒vRNA 5′保守序列中单个核苷酸在多聚腺苷酸化中的作用。用两种先前描述的检测方法检测来自体外转录的突变vRNA-like模板的聚腺苷化产物(23). 在5′vRNA保守序列的1′至13′位置突变的长（717-nt）和短（49-mer）vRNA样模板被制成（图。). 选择的点突变与之前通过光化学交联评估RNA聚合酶与vRNA保守5′区结合的研究相同(4)并确定单个5′核苷酸在转录起始中的作用(5). 后一项研究使用了3′和5′保守序列RNA，这些RNA分别在10和11′位引入互补突变。添加的3′臂的第10位突变可能通过阻止聚合酶（通常由相关的内源性5′臂介导）与聚合酶的相互作用来消除体外转录检测中的活性。通过在11′位置添加携带互补突变的外源5′臂，可以恢复活性。因此，将添加的3′和5′臂与位置10和11′互补突变结合，使转录依赖于外源5′臂的添加，而不是RNA聚合酶制剂中存在的内源性5′臂。内源性臂允许RNA聚合酶转录任何添加的RNA，前提是它携带3′保守序列，而与5′端的序列无关。因此，在本研究中，所有添加的模板都发生了转录起始（除了49-mer 2′[G→U]突变；见下文），因为所有模板都有野生型3′端。然而，不同的突变vRNAs合成聚腺苷化转录物的能力不同。
RT-PCR聚腺苷酸化分析。
图图1显示了RT-PCR检测中从717-nt vRNA-like模板转录的多聚腺苷化RNA，该模板在3′和5′末端携带野生型序列（见材料和方法）。特征宽带包含不同长度的cDNA，这取决于在用5′GC-clamped T反转录期间poly（A）尾部发生启动的位置20底漆。宽带来源于mRNA，在其他地方也有严格的特征(23). 在位置1′至13′突变的模板的结果如图所示。，第2至14车道。聚腺苷化产物检测到突变位点为1′（A→U）、4′（A～U）、5′（G→U），6′（A＞U）和10′（A＜U）的突变体。8′（A→U）和9′（C→A。这种微弱的波段被认为是一种负面结果，因为没有特征性的宽带。所有其他突变体（2′、3′、7′和11′至13′）在本试验中均为阴性（估计野生型活性<10%）。所有突变模板都是cRNA合成的模板，这是由在[α-32P] CTP后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术（数据未显示）。这些结果表明，717-nt vRNA-like模板的2′、3′、7′、8′、9′、11′、12′和13′位置的突变均显著影响多聚腺苷化，而1′、4′、5′、6′和10′位置的变异可以耐受，而对多聚腺苷化没有显著影响。
RT-PCR分析中vRNA 5′端保守序列中点突变的影响。用5′GC钳制T进行测定20引物和717-nt vRNA。RT-PCR检测在每个突变体的至少三个独立的流感病毒转录反应中得到了一致的结果。车道1，野生型（WT）717-nt vRNA；车道2至14，点突变；15号车道，无模板；16号跑道，DNA大小标记。
[α-32P] ATP掺入聚腺苷化试验。
在[α-32P] ATP掺入分析，聚腺苷化mRNA和cRNA产物均从野生型49-mer vRNA-like模板转录而来（图。，车道1）。转录产物通常作为高分子量mRNA涂片和主要cRNA产物运行（图。). 这些产品的真实性已经过证明(23). cRNA产物通常分为两条带（下带未显示），我们现在认为，主要的上cRNA带可能是cRNA产物和模板vRNA之间或两个cRNA分子之间形成的复合物。这种双工体在16%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶中的稳定性令人惊讶(29). 当流感病毒转录反应中省略RNA模板时，未观察到任何产物（图。，车道15）。
[α]中vRNA 5′端保守序列点突变的影响-32P] ATP掺入试验。除2′（G→U）vRNA突变体（第3通道）外，所有vRNA模板在流感病毒转录反应中均过量存在。mRNA、cRNA和来源已指出。起源处的信号被认为是由于来自残余内源性vRNA的放射性标记和/或转录产物的非特异性结合。通道1和16，野生型（WT）49-mer；车道2至14，点突变；15号车道，无模板；17巷，2′（G→C）突变。
除了位置2′（G→U）突变体外，所有突变体都是体外转录试验中cRNA合成的模板（图。，车道2至14）。反应中使用的2′（G→U）突变模板vRNA的数量如图所示。由于使用T7 RNA聚合酶难以在第2位用尿苷合成RNA，第3通道的RNA比用于其他突变RNA的RNA低约10倍。该问题仅出现在[α-32P] ATP掺入试验要求模板浓度比RT-PCR检测mRNA的模板浓度高几倍。因此，2′（G→U）突变体缺乏cRNA信号是因为缺乏足够的模板vRNA。相反，我们检测了一个替代突变体2′（G→U）C） 通过T7 RNA聚合酶更有效地合成。这种替代突变是[α]中cRNA合成的模板-32P] ATP掺入试验（图。，17号车道）。还合成了2′（G→C）突变体（717 nt长），并在RT-PCR分析中进行了测试，其中在制备cRNA的条件下也未能生成聚腺苷酸RNA（数据未显示）。
为了量化这些突变体相对于野生型的多聚腺苷酸化活性，通过磷成像仪分析多聚腺苷酸化产物（图。). 对于聚腺苷酸mRNA合成，突变体1′（A→U）和10′（A>U）的mRNA水平与野生型结构的mRNA相当。突变体4′（A→U）、5′（G→U）和6′（A→U）各自产生聚腺苷酸化产物，但效率降低，约为野生型模板的一半。相反，突变体2′（G→C）、3′（U→A）、7′（A→U）、8′（A→U）、9′（C→A）、11′（A→U）、12′（G→U）和13′（G→U）的聚腺苷酸化活性受到严重影响。这些突变体的mRNA生成水平低于野生型水平的20%。
49-mer vRNA-like模板5′端点突变（1′至13′）对[α-32P] ATP掺入试验。mRNA产物（高分子量涂片；图。)通过PhosphorImager分析对来自不同vRNA模板的vRNA进行定量。显示了相对于野生型（WT）49米（100%）的聚腺苷酸化活性。突变体的平均偏差和标准偏差来自三个或更多独立的分析。指出了实验中使用的点突变体。4′、5′和6′位的活性与野生型的差异均有统计学意义(对, <0.01).
讨论
以前我们证明，在ApG引发的流感病毒转录反应中，聚腺苷化产物可以在体外合成(23). 该研究中两个vRNA-like点突变（位置3′和4′）获得的结果(23)支持mRNA合成需要聚合酶与模板的5′序列结合的假设(4,30). 这种结合对于聚腺苷酸化是必需的，即使模板具有野生型互补序列（10到15和11′到16′）和正确定位的U6track，转录后生成cRNA(23). 此外，在体内研究中，即使保留野生型保守序列，延长碱基配对区的长度也会破坏基因表达(14). 因此，双链区不负责阻止聚合酶的进展并导致多聚腺苷化。
在本研究中，我们旨在研究vRNA保守的5′端残基在聚腺苷酸化中的可能作用。具体来说，我们希望区分5′结合聚合酶可能导致多聚腺苷酸化的两种替代机制。在一个模型中，由聚合酶蛋白和vRNA模板保守的5′臂组成的复合物可以作用于顺式转录同一vRNA模板的3′端。后来，由于空间位阻，聚合酶将无法转录其结合位点，从而导致U上结结巴巴的聚腺苷酸化5–7轨道（图。A）(4). 或者，5′键复合物仅能在一秒钟内起到阻断作用，反式-作用聚合酶（即转录聚合酶没有附着在活性模板的5′臂上），不能取代5′结合聚合酶，导致U5–7轨道（图。B） ●●●●。如果聚腺苷化由反式-作用聚合酶，则vRNA的5′端结合聚合酶的能力将单独决定给定模板是否会产生聚腺苷化转录物。相反，如果聚腺苷化需要顺式-作用聚合酶，则需要vRNA的5′端结合聚合酶的能力和vRNA的5'端与同一模板的3'端相互作用的能力。
关于5′-结合的聚合酶引起流感病毒mRNA多腺苷酸化的机制的两个可能模型。（a）转录由5′-结合的聚合酶启动，顺式-作用聚合酶（P）。在整个转录过程中，聚合酶始终附着在模板的5′端。因此，聚合酶无法转录其附着的位点。相反，mRNA的多聚腺苷酸化通过重复复制U5–7轨道。（B） 转录由反式-作用聚合酶（P1)，其与不同vRNA模板的5′端结合。当转录被5′结合聚合酶阻断时（P2)，的反式-作用聚合酶（P1)通过重复复制U启动聚腺苷酸化5–7轨道。
在RT-PCR和[α-32P] ATP掺入分析中，可以检测到来自位置1′、4′、5′、6′和10′突变模板的聚腺苷化产物（图。和). 相反，长（717-nt）vRNA模板在2′、3′、7′至9′和11′至13′位置突变，在RT-PCR分析中无法检测到mRNA水平（图。)在合成cRNA的条件下。与RT-PCR分析结果一致，[α-32P] ATP掺入试验表明，在2′、3′、7′至9′和11′至13′突变的短（49米）vRNA突变体的多聚腺苷酸化活性受到严重影响。在这些突变体中检测到少于20%的野生型聚腺苷酸化活性，而cRNA仍在有效合成中（图。). 综合两种分析结果，在mRNA的聚腺苷酸化中，2′、3′、7′至9′和11′至13′位置的残基比1′、4′至6′和10′位置的残留物更重要。
以前(4,5)，我们证明vRNA 5′端的保守序列参与转录起始和聚合酶结合（表). 当我们将这些结果与目前的结果进行比较时，除了位置1′外，所有对聚合酶结合重要的残基（即2′、3′、7′至9′和11′）也对聚腺苷酸化活性至关重要。聚合酶结合和聚腺苷酸化活性之间的相关性证实了我们对位于3′和4′位置的两个5′突变体的初步结论(23)RNA聚合酶必须与vRNA模板的5′端结合才能发生聚腺苷酸化。它也支持我们早期的绑定研究(4)其中与聚合酶结合有关的精确残基与另一种体外试验中确定的残基略有不同(30). 突变这些位置会破坏聚合酶和模板之间的相互作用，并阻止多聚腺苷化。有趣的是，位置4′到6′的突变略微降低了[α-32P] ATP掺入试验（图。). 该结果在RT-PCR分析中并不明显，因为该分析不适合检测微小的数量差异。虽然4′到6′位置的突变与聚合酶结合和聚腺苷化活性明显兼容（表)在交联分析中，这些模板之间的单个聚合酶蛋白的结合模式和强度存在细微差异(4). 因此，位置4′至6′的突变可能通过一种未知的机制对聚腺苷酸化产生较小的影响。
表1
vRNA 5′端点突变对聚合酶结合、转录起始和多聚腺苷酸化的影响
| 职位 | 结果一在以下测定中：
|
|---|
| 聚合酶结合（4） | 转录起始（5） | 聚腺苷酸化（本研究） |
|---|
| 1′A→U | − | ± | + |
| 2′G→Ub条 | − | − | − |
| 3′U→A | − | − | − |
| 4′A→U | + | + | + |
| 5′G→U | + | + | + |
| 6′A→U | + | + | + |
| 7′A→U | − | − | − |
| 8′A→U | − | − | − |
| 9′C→A | − | − | − |
| 10′A→U | + | + | + |
| 11′A→U | − | − | − |
| 12′G→U | + | ND（无损检测） | − |
| 13′G→U | + | − | − |
在早期的聚合酶结合研究中，1′位突变显示聚合酶的结合较差(4)但具有野生型聚腺苷酸化活性（表). 然而，我们也应该注意到，与野生型相比，具有相同突变的模板显示出48%的转录起始活性(5)这表明聚合酶实际上可以耐受1′位（a→U）突变并启动转录。显然，这种相互作用程度足以实现聚腺苷化。
对于位置12′和13′突变体，早期数据表明这些位置对聚合酶结合并不重要(4). 然而，这些突变体的聚腺苷酸化活性大大降低，清楚地表明聚合酶结合本身不足以实现聚腺苷酸化。我们之前发现，vRNA 5′和3′末端的11′至13′和10至12位之间的碱基配对分别参与转录起始(4,5)（表). 因此，通过突变位置12′或13′破坏RNA双链区可以阻止5′结合的聚合酶与其结合的模板的3′端相互作用和转录。因此，不会发生聚腺苷酸化。推测，双链中非保守碱基的突变（位置14′至16′和13至15）也会以同样的方式阻止聚腺苷化。事实上，这种突变会干扰体内实验中的基因表达(15). 除了碱基配对外，聚腺苷酸化还可能需要双链区中的特定序列。例如，在体内试验中，尽管大多数替代碱基对都可以耐受，但在一个例子中，当所有5 bp的双链都被交换时，基因表达大大降低(15). 对于11′位突变，我们无法区分聚腺苷酸化活性的降低是由于RNA双链区的破坏还是RNA聚合酶与模板之间的相互作用的破坏。然而，用12′和13′位突变体获得的结果表明，vRNA的5′和3′端必须相互作用才能启动转录并导致多聚腺苷酸化。这些结果支持了聚腺苷酸化是由顺式-作用聚合酶。
当我们比较vRNA保守5′末端序列中单个残基在聚合酶结合中的作用时(4)，转录起始(5)和聚腺苷化（本研究）（表)，我们对vRNA的5′端如何参与mRNA合成有了更清晰的了解（图。A） ●●●●。首先，聚合酶必须与vRNA的5′端结合。其次，vRNA模板的5′端与结合的聚合酶必须通过形成RNA双链体（残基10至15与残基11′至16′配对）与同一模板的3′端相互作用。片段末端之间的这种相互作用与cap引物的使用有关(6)和转录起始(4,5). 转录开始后，随着聚合酶沿着模板进行，双链体融化，并保持与5′结合位点的结合。在整个链条伸长过程中顺式-活性聚合酶复合物仍与5′末端序列结合。因此，聚合酶无法通过其5′结合位点转录，而5′结合部位仍然是复合物的一部分。因此，多聚腺苷酸化是通过重复复制U5–7通过与相邻5′末端序列结合而抑制聚合酶的追踪（图。A） ●●●●。由5′和3′末端和RNA聚合酶组成的复合物的聚腺苷酸化要求也与无聚合酶RNP不能采用圆形构象（或panhandle或RNA fork）的事实一致(12)事实上，当mRNA产量最高时，这种环状构象最为丰富(9).
总之，我们的结果表明，除了提供RNA聚合酶结合信号外，vRNA模板的5′端还必须与同一模板的3′端相互作用，才能发生聚腺苷酸化。这些结果支持以下假设：，顺式-流感病毒多聚腺苷化需要活性聚合酶复合物。
致谢
L.L.M.P.由克劳彻基金会支持，D.C.P.由MRC支持（向G.G.B.提供项目拨款G9523972）。
参考文献
1Beaton A R，Krug R M.流感病毒模板RNA合成过程中的转录反终止需要核衣壳蛋白，并且不需要5′端。美国国家科学院院刊。1986;83:6282–6286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Cianci C，Tiley L，Krystal M.通过模板RNA结合对流感病毒聚合酶的差异激活。《维罗尔杂志》。1995;69:3995–3999. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Desselberger U，Racaniello V R，Zazra J J，Palese P。甲型、乙型和丙型流感病毒RNA片段的3′和5′末端序列高度保守，显示部分反向互补性。基因。1980;8:315–328.[公共医学][谷歌学者] 4Fodor E，Pritlove D C，Brownlee G G。流感病毒手柄参与转录的启动。《维罗尔杂志》。1994;68:4092–4096. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Fodor E，Pritlove D C，Brownlee G G。甲型流感病毒转录起始过程中病毒粒子RNA的RNA-fork模型表征。《维罗尔杂志》。1995;69:4012–4019. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Hagen M，Chung T D Y，Butcher J A，Krystal M。重组流感病毒聚合酶：5′和3′病毒末端对核酸内切酶活性的要求。《维罗尔杂志》。1994;68:1509–1515. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Hay A J、Lomnicza B、Bellamy A R、Skehel J J。流感病毒基因组的转录。病毒学。1977;83:337–355.[公共医学][谷歌学者] 8本田A、上田K、长田K、石杉A。流感病毒的RNA聚合酶：NP在RNA链延长中的作用。生物化学杂志。1988;104：1021–1026。[公共医学][谷歌学者] 9Hsu M、Parvin J D、Gupta S、Krystal M、Palese P。流感病毒的基因组RNA在病毒粒子和感染细胞中通过末端柄以环状构象保持。美国国家科学院院刊。1987;84:8140–8144. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Huang T S，Palese P，Krystal M.基因组复制所需流感病毒蛋白的测定。《维罗尔杂志》。1990;64:5669–5673. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Kimura N，Nishida M，Nagata K，Ishihama A，Oda K，Nakada S.重组流感病毒RNA在细胞中的转录，可表达流感病毒RNA聚合酶和核蛋白基因。维罗尔将军。1992;73:1321–1328.[公共医学][谷歌学者] 12Klumpp K，Ruigrok R W H，Baudin F.流感病毒聚合酶和核蛋白在形成功能性RNP结构中的作用。EMBO J。1997;16：1248–1257。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Krug R F，Alonso-Caplan F V，Julkunen I，Katze M G.流感病毒基因组的表达和复制。作者：克鲁格·R·M，编辑。流感病毒。纽约，N.Y:Plenum Press；1989年，第89–142页。[谷歌学者] 14Li X，Palese P.流感病毒RNA多聚腺苷化信号的表征。《维罗尔杂志》。1994;68:1245–1249. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Luo G，Luytjes W，Enami M，Palese P。流感病毒RNA的多聚腺苷化信号涉及一段尿苷，然后是锅柄结构的RNA双链。《维罗尔杂志》。1991;65:2861–2867. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Luytjes W，Krystal M，Enami M，Parvin J D，Palese P.流感病毒对外源基因的扩增、表达和包装。单元格。1989;59:1107–1113.[公共医学][谷歌学者] 17Martin J、Albo C、Ortin J，Melero A、Portela A。体外使用从感染细胞纯化的病毒蛋白重建活性流感病毒核糖核蛋白复合物。维罗尔将军。1992;73:1855–1859.[公共医学][谷歌学者] 18Nagata K、Takeuchi K、Ishihama A。体外流感病毒RNA的合成：流感病毒复制所需因子的生化互补分析。生物化学杂志。1989;106:205–208.[公共医学][谷歌学者] 19苍白P.流感病毒的基因。单元格。1977;10:1–10.[公共医学][谷歌学者] 20Parvin J D、Palese P、Honda A、Ishihama A、Krystal M。流感病毒RNA聚合酶的启动子分析。《维罗尔杂志》。1989;63:5142–5152. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Plotch S J、Bouloy M、Ulmanen I、Krug R M。独特的上限（M7依赖GpppXm）的流感病毒核酸内切酶裂解带帽RNA，生成启动病毒RNA转录的引物。单元格。1981;23:847–858.[公共医学][谷歌学者] 22哥伦比亚特区普里特洛夫。未发布的数据。
23Pritlove D C，Poon L L M，Fodor E，Sharps J，Brownlee G G。从模型病毒RNA模板体外转录的流感病毒mRNA的多聚腺苷酸化：5′保守序列的要求。《维罗尔杂志》。1998;72:1280–1286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Robertson J S.流感病毒RNA基因组片段的5′和3′末端核苷酸序列。核酸研究。1979;6:3745–3757. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Robertson J S，Schubert M，Lazzarini R A.流感病毒信使核糖核酸的多腺苷酸化位点。《维罗尔杂志》。1981;38：157–163。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Seong B L，Brownlee G G。流感聚合酶和RNA重组的新方法在体外：cRNA和vRNA合成启动子元件的研究在体外和病毒救援体内.病毒学。1992;186:247–260.[公共医学][谷歌学者] 27Seong B L、Kobayashi M、Nagata K、Brownlee G G、Ishihama A在体外流感病毒的转录和复制。生物化学杂志。1992;111：496–499。[公共医学][谷歌学者] 28Shapiro G I，Krug R M.流感病毒RNA体外复制：在没有添加引物的情况下合成病毒模板RNA和病毒粒子RNA。《维罗尔杂志》。1988;62:2285–2290. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29夏普斯，J.和G.G.布朗利。未发布的数据。
30Tiley L S，Hagen M，Matthews J T，Krystal M。流感病毒RNA聚合酶与病毒RNA 5′端序列的序列特异性结合。《维罗尔杂志》。1994;68:5108–5116. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
