许多病毒和细胞蛋白被棕榈酰化和肉豆蔻酰化修饰。这一列表包括病毒膜蛋白、细胞受体和一些参与细胞信号或代谢调节的蛋白质(12,21,22). 肉豆蔻酰化是一种发生在氨基末端的共翻译修饰，而棕榈酰化发生在蛋白质通过高尔基体系统转运之前的翻译后。棕榈酰化涉及通过硫酯或酯键将16碳饱和脂肪酰基部分添加到半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基，与肉豆蔻酰化相反，它可能是可逆的(39). 虽然脂肪酸酰化的可能作用目前尚不清楚，但有人认为蛋白质棕榈酰化可能会改变蛋白质的构象和功能，如蛋白质靶向(5,11,16,18)，膜上的横向扩散(36)，蛋白质齐聚(1,26)或与跨膜蛋白膜相关的细胞质蛋白(38).
病毒蛋白的棕榈糖基化功能尚未被证实。有人认为这种翻译后修饰可能会影响流感病毒颗粒的传染性(46)或组织侵袭性(14). 对于Sindbis病毒，研究表明替换6K蛋白和E2糖蛋白的酰化半胱氨酸残基会影响病毒的组装和出芽(10,13). 流感病毒的一些研究人员报告了病毒蛋白在细胞融合活动中的棕榈酰化作用(23)水疱性口炎病毒（VSV）呈阴性(41)，流感病毒(24,27)和小鼠白血病病毒(45).
一些副粘病毒，如新城疫病毒(7,37)和猿猴病毒5，但不是仙台病毒(40)，具有棕榈糖基化膜糖蛋白。关于麻疹病毒蛋白质脂肪酰化的数据尚未报道。我们在这里表明，棕榈酸，而不是肉豆蔻酸，被纳入麻疹病毒（MV）蛋白质中。仅在F中发现棕榈酰化0前体和F1MV亚单位和犬瘟热病毒（CDV）。融合蛋白通过诱导膜融合，使病毒进入细胞并在细胞间传播。MV的F蛋白是一种三聚体或四聚体1型膜糖蛋白，其单体由疏水力结合，在内质网中合成为一种非活性前体F0.完全糖基化的F0被劈成F1和F2亚基，通过二硫键连接形成功能性F蛋白(30,43). 我们在此报告棕榈酸通过硫酯键并入F0和F1以及F基因的转染，经过定点突变以用丝氨酸取代半胱氨酸，表明大多数与MV F蛋白的Cys 506结合，在较小程度上与Cys 518和524结合。为了阐明这种修饰的可能功能，我们用MV H和突变的F基因共同转染细胞，并测量细胞融合的诱导。我们发现，F蛋白Cys 506和518对细胞融合活动很重要，可能通过其棕榈酰化作用。
材料和方法
细胞、病毒和质粒载体。
MOLT4和Dakiki细胞保存在添加谷氨酰胺、青霉素-链霉素和10%胎牛血清的RPMI培养基中。Edmonston株和最新MV分离物Ma93F的生长(32)按照前面的描述完成(8). 在添加2%胎牛血清、谷氨酰胺和庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中，在Vero细胞单层上生长CDV的Onderstepoort菌株。如Fuerst等人所述，重组痘苗病毒vTF7-3（表达T7 RNA聚合酶）在Vero细胞中生长(9). 构建了包含MV Edmonston株F蛋白基因（核苷酸[nt]537至2369）（3F21）和H蛋白基因（nt 1至1948）（3H18）的完整编码区的质粒。用带有限制性内切酶位点的引物通过逆转录-PCR获得的cDNA被克隆到载体pGEM4Z（Promega）的T7聚合酶启动子下游。
细胞的代谢标记和蛋白质的免疫沉淀。
细胞是[35S] 蛋氨酸-半胱氨酸标记5h，蛋白质如前所述进行免疫沉淀（放射免疫沉淀分析）(6)含20μCi TRAN35S-label（1200 Ci/mmol；ICN）/ml，在含有五分之一正常浓度Met和Cys的介质中。[三H] 棕榈酸标记2×106除非另有规定，否则使用[9,10的1 mCi进行MOLT4和Dakiki细胞培养5小时-三H] 含有1mM丙酮酸钠和1%非必需氨基酸的培养基中的棕榈酸（50 Ci/mmol；Amersham）。CDV感染的Vero细胞显示约70%的细胞病变，用1 mCi标记5小时[9,10-三H] 棕榈酸/5×106细胞在含有1 mM丙酮酸和1%非必需氨基酸的培养基中。
用于MV蛋白免疫沉淀的豚鼠抗MV抗体来自M.A.生物制品。抗F蛋白单克隆抗体（MAbs）（由法国里昂巴斯德研究所R.Buckland善意提供）Ost-2（来自荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学A.D.M.E.Osterhaus）和263-5(19)分别用于免疫沉淀和荧光激活细胞分选分析。
定点突变。
根据供应商的指示，使用Transformer突变试剂盒（Clontec）和选择引物5′-ATTCACACCGCCCATGGTGCACTC-3′从质粒pGEM-3F21（野生型）中衍生出突变F基因。27-nt低聚物（nt 2078至2104）5′-CTGATGCAGTGTCT公司CTTGGAGGGTTG-3′用于产生Cys 506突变体（特定突变密码子被强调）（F基因残基来自Radecke和Billeter的一致序列[28]). 37-nt低聚物（nt 2109至2145）5′-GGATCCCGCTTTAATATCT公司TGCTGCAGGGGGCGTG-3′用于产生Cys 518突变体。寡聚物（nt 2109至2145）5′-GGATCCCGCTTTAATATGTTCC（变矩器离合器）TGCAGGGGCGTG-3′用于产生Cys 519突变体。低聚物（nt 2109至2145）5′-GGATCCCGCTTTAATGTTGCTCC（变矩器离合器）AGGGGCGTTG-3′用于产生Cys 520突变体，以及23聚体（nt 2135至2157）5′-AGGGCGTTCT公司利用AACAAAAGGG产生Cys 524突变体。为了验证只存在单一的变化，通过脱氧核苷酸链终止测序对突变基因进行了整体测序(34)人工分析或使用自动DNA测序仪（型号ABI377-18；Perkin-Elmer）。为了验证突变蛋白的身份并检测其与抗F MAb Ost-2的反应性，利用转录-翻译耦合网织红细胞裂解物系统（TNT；Promega）在体外合成野生型和突变融合蛋白。
F蛋白突变体的瞬时表达。
融合基因通过重组痘苗病毒编码T7聚合酶系统表达(9). 基本上按照制造商的建议，使用脂蛋白（GIBCO-BRL）将质粒DNA转染MOLT4细胞。每2.5×105感染痘苗病毒vTF7-3的细胞，感染倍数为10 PFU/细胞，使用1-2μg DNA和5μg脂蛋白的混合物。转染后20小时，用60μCi的[三H] 棕榈酸或30μCi TRAN35S标签并按指示进行处理。
融合分析。
用MOLT4细胞进行融合分析。疫苗病毒vTF7-3感染MOLT4细胞后20小时产生的细胞病变效应非常有限，通过融合基因和血凝素基因共同转染形成的合胞体是可复制的。测试了几种浓度的F和H质粒DNA的融合效果，并选择1:1的比例作为融合分析的最佳比例。指数生长细胞（2.5×105)与表达F蛋白的质粒DNA和表达H蛋白的质粒DNA共转染0.5μg。为了流式细胞术分析表面F蛋白的表达，转染细胞与抗F MAb 263-5孵育，然后与异硫氰酸荧光素结合的山羊抗鼠免疫球蛋白G孵育以进行间接染色。
结果
麻疹病毒和CDV的融合蛋白被代谢标记为[三H] 棕榈酸。
我们将感染MV Edmonston株的MOLT4细胞或感染CDV Onderstepoort株的Vero细胞标记为[三H] 棕榈酸或[三H] 肉豆蔻酸在外源脂肪酸代谢很少的条件下。用抗MV豚鼠血清或抗MV F单克隆抗体免疫沉淀细胞提取物和细胞外病毒颗粒。在还原或非还原条件下，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫沉淀物。在MV感染的MOLT4细胞中，标记有[三H] 棕榈酸，放射性仅并入F蛋白（图。A） （另请参见图。). 该结果与Fabian Wild未发表的观察结果一致（引用于参考文献三). 我们检测到[三H] F中的棕榈酸1和F0来自细胞相关病毒和细胞外病毒。当感染细胞被标记为[三H] 肉豆蔻酸。当其他细胞系被标记时，如感染Edmonston或原代MV分离物的人类B Dakiki细胞或猴Vero细胞（未显示），放射性被纳入F蛋白的裂解和未裂解形式，即F1和F0蛋白质（图。). F蛋白棕榈酰化的化学计量不能通过代谢放射性标记来确定，因为细胞内池的比活性尚不清楚。为了进行比较，印第安纳州VSV株的G蛋白被单一棕榈酸部分修饰(33,35)，在受感染的Vero细胞中被平行标记。以下各项的相对比率[三H] 棕榈酸酯[35S] MV F中的蛋氨酸1与VSV G进行比较。校正每个蛋白质中蛋氨酸的数量后，我们的初步估计是F1蛋白质平均含有1.6个棕榈酸分子（数据未显示）。在感染CDV的Vero细胞中[三H] 棕榈酸也被并入F1蛋白质（图。B） ●●●●。
（A） 第PAGE页，共PAGE页[三H] 棕榈酸（车道1至3）-和[三H] Edmonston MV感染的MOLT4细胞中肉豆蔻酸（第4和第5通道）标记的多肽。标记细胞外（1道）和细胞内（2至5道）病毒蛋白15小时，用抗MV豚鼠血清免疫沉淀，并在还原（+）或非还原（-）条件下进行分析。显示了荧光图的25天曝光时间。分子质量（千道尔顿）在右边。（B） 成立[三H] 棕榈酸转化为CDV的F蛋白。[三H] 未感染（第2通道）和CDV感染（第1通道）Vero细胞和TRAN中棕榈酸标记的胞内多肽35图中显示了来自CDV感染Vero细胞（第3道）的S标记蛋白。CDV蛋白用抗MV豚鼠血清进行免疫沉淀，并在SDS–10%聚丙烯酰胺平板凝胶中进行分析。显示了30天的荧光图曝光。分子质量（千道尔顿）在左边。
成立[三H] 棕榈酸转化为Edmonston株和野生型FV的F蛋白。[三H] Edmonston（ED）和Ma93F（FV）病毒感染Dakiki细胞（2×10）中棕榈酸标记的胞内多肽6)用抗F单克隆抗体Ost-2（A）免疫沉淀，上清液用抗MV豚鼠血清（B）免疫沉淀。显示了20天的荧光图曝光。分子质量（千道尔顿）在右边。
MV酰化蛋白对羟胺的敏感性。用TRAN标记的MV Edmonston感染的MOLT4细胞的提取物35S标签（1）或[三H] 棕榈酸酯（2和3）与抗MV抗体免疫沉淀；免疫复合物在室温下用1M Tris-HCl（pH 8）或1M羟胺（pH 8）处理3小时，并通过SDS-PAGE和荧光图进行分析。分子质量（千道尔顿）在右边。
脂质部分的鉴定[三H] 棕榈酸标记的F蛋白。
由于脂肪酸可以代谢改变并相互转化为长链变体，因此有必要对蛋白质相关放射性进行化学表征。凝胶净化[三H] 将棕榈酸标记的F蛋白进行完全酸水解，并通过有机溶剂萃取和反相薄层色谱鉴定释放的脂肪酸。大多数合并放射性作为棕榈酸标准迁移，在距原点6 cm处出现峰值，而肉豆蔻酸标准迁移7.5 cm（图。). 在所采用的标记条件下，F蛋白中的大多数放射性物质仍然是棕榈酸。
从F蛋白中去除的脂肪酸鉴定为棕榈酸酯。水解脂肪酸的薄层色谱法[三H] 来自MV Edmonston感染的MOLT4细胞的棕榈酸标记F蛋白。罗丹明G浸渍后，在紫外光下检测棕榈酸（P）和肉豆蔻酸（M）标记物，并在β辐射计数器中估计放射性。
MV F蛋白的酰化通过半胱氨酸残基上的硫酯键发生。
为了研究脂肪酸与F蛋白的连接性质，研究了棕榈酸标记蛋白对羟胺或还原剂（如二硫苏糖醇（DTT））作用的敏感性。如果F蛋白通过硫代酯键在半胱氨酸残基上发生酰化，就像在其他病毒和细胞蛋白的情况下一样，该键很容易在中性pH下与羟胺发生裂解。相反，丝氨酸残基的酰化通过一个羟基酯键发生，而羟基酯键不受这种处理的影响。肉豆蔻酸通常通过酰胺键连接，也不易通过这种处理被切割。为了检测连锁的稳定性，MV蛋白标记有[三H] 棕榈酸或[35S] 蛋氨酸-半胱氨酸被免疫沉淀，免疫复合物被羟胺处理，并通过SDS-PAGE和荧光分析。或者，将材料置于平行凝胶中，固定后，在室温下用1 M羟胺（pH 8）或1 M Tris-HCl（pH 8。[三H] 棕榈酸标签被羟胺裂解，而[35S] 标签不受这种处理的影响（图。). 中性pH下对羟胺的敏感性表明，棕榈酸通过硫酯键与F蛋白相连。为了证实这一结果，我们研究了[三H] 棕榈酸标记为还原剂。放射自显影的密度追踪（图。)显示超过85%的[三H] 用0.2M DTT处理后，F蛋白释放出棕榈酸。考马斯蓝染色的F蛋白带显示，DTT处理后没有明显的蛋白质损失（未显示）。由于已知氧-酯键可以抵抗这种处理，这些结果强烈支持了半胱氨酸残基是MV F蛋白中棕榈酸连接位点的观点。
酰化F蛋白对DTT的敏感性。融合蛋白免疫复合物[三H] 用增加浓度的DTT处理棕榈酸标记的MV Edmonston感染的MOLT4细胞。将样品加热至95°C 5分钟，并进行SDS-PAGE和荧光照相。分子质量（千道尔顿）在右边。
位于MVF蛋白跨膜细胞质结构域的半胱氨酸506或518被丝氨酸取代，抑制棕榈酰化。
尽管发现的棕榈酰化位点数量不断增加，但似乎没有一致的基序来预测可能被酰化的候选半胱氨酸残基。据报道，对于几种病毒糖蛋白，棕榈酸附着在分子的跨膜锚和细胞质尾部之间的区域。为了鉴定MV F蛋白的棕榈酰化半胱氨酸残基，我们研究了棕榈酸盐掺入野生型和突变型F蛋白，其中位于跨膜胞质域（Cys 506、518、519、520和524）的半胱氨酸残留物突变为丝氨酸（图。). 在定点突变后，通过对整个突变的F基因进行测序来确认每个突变；图。显示了在体外转录和翻译的F突变体的突变密码子序列以及与特定F MAb的反应性。
MV Edmonston融合蛋白跨膜结构域引入的突变示意图。F蛋白显示为两个矩形，表示F2和F1亚基位于氨基和羧基结构域，由二硫键结合。列出了预测的跨膜结构域（TMD）周围的氨基酸序列；数字表示N端蛋氨酸残基的位置。对于突变体，只描述了突变残基。突变体的命名规定了所示位置的原始残基。
F基因质粒突变体分析。（A） 野生型（wt）质粒5′-AATAT（G）TT（G）CT（G）CAGGGGCGTT（G）AAC-3′和突变质粒Cys 524、Cys 520、Cys 519和Cys 518的序列阶梯。（B） 野生型质粒5′-TTGAGTGT（G）TCTT-3′和突变质粒Cys 506的序列阶梯。箭头表示碱基突变。（C） 用抗F单克隆抗体免疫沉淀后，在TNT系统（Promega）中由质粒DNA体外合成的蛋白质。Mw，分子量标记（左侧以千计）。
用克隆的F蛋白cDNA转染MOLT4细胞表达的F蛋白也可以用[三H] 棕榈酸（未显示），表明酰化不需要其他病毒蛋白。与H基因和控制或突变F基因共同转染的细胞被标记为[三H] 棕榈酸和[35S] 蛋氨酸加半胱氨酸监测F蛋白棕榈酰化水平和表达。免疫沉淀后，样品在还原条件下用SDS-10%PAGE进行分离；三在转移到聚偏二氟乙烯膜后，通过对切除带的闪烁计数来测量并入F蛋白带的H标记，并且35S放射性通过放射自显影和密度分析测量。由于表达水平存在显著差异[三H] 测定突变株和野生型F的棕榈酸掺入量、棕榈酸掺合量与蛋氨酸掺入量的比值（表). 图显示的荧光分析[三H] 棕榈酸和TRAN35S标签并入来自实验的突变体506、518和524中并行运行。在Cys 506处的突变以及在较小程度上在Cys 518处的突变抑制了[三H] 棕榈酸转化为F蛋白。此外，在Cys 524突变中观察到棕榈酸酯掺入量略有减少。保守半胱氨酸519和520的单独取代不影响F蛋白突变体的棕榈酰化。
表1
| F蛋白 | [三H] 棕榈酸一,b条（cpm） | [35S] Met和Cysb条,c（c）（相对光密度） | 三H（H）/35S（%） |
|---|
| 野生型 | 312 ± 78 | 1.65 ± 0.02 | 189 (100) |
| 赛斯506− | 52 ± 13 | 1.30 ± 0.03 | 40 (21) |
| 赛斯518− | 122 ± 30 | 0.88 ± 0.08 | 139 (73) |
| 赛斯519− | 237 ± 59 | 1.31 ± 0.04 | 182 (96) |
| 塞浦路斯520− | 244 ± 61 | 1.14 ± 0.03 | 214（113） |
| 赛斯524− | 263 ± 66 | 1.72 ± 0.02 | 153 (81) |
F突变体Cys 506、Cys 518和Cys 524的棕榈酰化。用H基因和野生型（wt）或突变型F质粒DNA共同转染的MOLT4细胞标记[三H] 棕榈酸（A）或TRAN35S标签（B）。用MAb免疫沉淀细胞裂解物以对抗F蛋白并进行SDS-PAGE，荧光图分别暴露30天和5天。在没有质粒DNA的情况下进行模拟转染。分子质量（千道尔顿）在左右两侧。
MV F蛋白跨膜胞质结构域Cys 506或Cys 518的突变抑制了合胞体形成的诱导。
转染MOLT4细胞的细胞表面F蛋白突变体的表达与野生型F细胞相似，Cys 518除外−突变体，如流式细胞术实验中观察到的，突变体有所减少（表). 然而，Cys 518的合胞体诱导明显减少−突变体和（在较小程度上）Cys 506和519突变体，如表所示和图。Cys 518的无能−导致融合的突变似乎不受F浓度的影响，因为将Cys 518质粒DNA的量从0.5μg增加到1.5μg不会增加合胞体诱导（数据未显示）。这些结果表明，这些跨膜胞质域的半胱氨酸参与了对MV细胞融合活动重要的结构。
表2
| DNA | F细胞表面荧光（%）一 | Syncytia（%）b条 |
|---|
| 野生型 | 49.8 (100) | 810 ± 54 (100) |
| 赛斯506− | 51.8 (104) | 366 ± 7 (45) |
| 赛斯518− | 37.4 (75) | 12 ± 4 (1.5) |
| 赛斯519− | 43.3 (86.8) | 513 ± 32 (63) |
| 赛昂520− | 48.0 (96.2) | 755 ± 15 (93) |
| 赛昂524− | 41.3 (83) | 785±5（97） |
野生型（wt）和突变F蛋白诱导的MOLT4细胞融合。感染后20小时，用荧光-FS（Leitz）倒置显微镜拍摄典型的培养区域，显微镜具有对比相位光学和放大倍数×200。
讨论
我们已经证明，MV原分离株和疫苗株的融合蛋白在B、T细胞和成纤维细胞感染期间发生了棕榈糖基化；CDV融合蛋白也是棕榈糖基化的。这些结果表明，这种酰化反应可能在麻疹病毒的感染周期中起作用。MV F蛋白通过硫酯键结合棕榈酸。F蛋白的C末端含有半胱氨酸残基，在麻疹病毒中高度保守(2,20)一个位于细胞质尾部（Cys 524代表MV），四个位于假定的跨膜结构域（Cys 506、518、519和520代表MV。通过定点突变，我们鉴定出跨膜细胞质结构域中的三个半胱氨酸残基为MV融合蛋白的酰化位点。MV融合蛋白的棕榈糖基化似乎主要发生在Cys 506，在较小程度上发生在Cys518和Cys524。残基Cys 519和520似乎未被棕榈酰化。虽然MV融合蛋白中二硫键的分配目前尚不清楚，但我们的研究结果表明这些不变残基可能参与这种结构。在任何情况下，棕榈酰化位点的分配和由特定突变确定的酰化总水平是相对的，因为酰化效率可能会因其中一个半胱氨酸残基的变化而改变(14,15,24).
众所周知，棕榈酸修饰一些细胞和病毒膜蛋白，但这种脂肪酸酰化的可能功能尚未确定。我们研究了棕榈酰化位点缺乏半胱氨酸的F突变体诱导细胞融合。由于在524位缺乏半胱氨酸的F突变蛋白可以诱导融合，因此该位置的棕榈酰化不太可能对融合起重要作用。518 F位点突变不会诱导融合，这表明该位点的棕榈糖基化可能是细胞融合所必需的。如果我们假设Cys 506在大多数分子上是棕榈糖基化的，那么Cys 518将只在少数分子上棕榈糖基。然而，Cys 518突变似乎对膜融合有重要影响。因此，Cys 518的棕榈糖基化似乎不太可能导致这种效应。或者，半胱氨酸518本身可能需要用于此功能。如果突变改变或破坏了蛋白质的整体构象，则可能会出现这种结果。事实上，通过免疫沉淀和表面免疫荧光检测到的突变Cys 518蛋白的细胞水平降低了约50%，可能是由于稳定性改变或抗原位点的修饰。突变基因浓度增加后，未能克服融合缺失，这有利于后一种选择。最后，506位的半胱氨酸残基显示出最高的棕榈酰化水平。当Cys 506被丝氨酸取代时，发现突变体在较低水平诱导融合，这表明506位的棕榈酰化并非融合的绝对必要条件，但它具有辅助作用。我们观察到，来自细胞外病毒的F蛋白也被棕榈酰化，这表明这种酰化作用可能影响细胞和病毒细胞膜的融合。
除了F1多肽氨基末端的融合序列外(25,31)其他序列，例如富含半胱氨酸的区域，似乎是与MV H蛋白相互作用的位点(42)亮氨酸拉链结构N端到跨膜区(4,44)，似乎在维持生物活性结构方面发挥着关键作用(17,43). 我们的结果表明，跨膜结构域的半胱氨酸Cys 506、518和519也在功能上参与促进细胞融合。相反，跨膜半胱氨酸520和细胞质内Cys 524似乎不是合胞体形成所特异性需要的。
由于F蛋白的棕榈糖基化可能参与病毒传播的细胞融合，因此评估亲本和非致病毒性MV变异体裂解和持续感染期间F蛋白棕榈糖基化合的化学计量学将是有意义的(8). 为了阐明棕榈糖基化的生物学意义，将F蛋白跨膜和细胞质域中的这些突变引入MV感染的克隆DNA中是很有意思的(29).
