疱疹病毒的包膜糖蛋白在病毒生命周期中起着多重关键作用,包括附着、渗透、细胞间传播以及新生病毒颗粒的包膜和成熟。为了了解这些复杂病毒的生命周期,有必要彻底了解包膜糖蛋白的结构和功能。人类巨细胞病毒(HCMV)病毒的生化研究表明,病毒包膜含有至少10种糖蛋白,其中许多糖蛋白被组织成三种主要的高分子量二硫键复合物,分别命名为gCI、gCII和gCIII(23). 考虑到早期分析的分辨率和HCMV的大编码容量(9),很可能病毒包膜中也存在其他蛋白质。然而,到目前为止,只有六种病毒包膜糖蛋白被定位到病毒基因组:gp48(UL4)(8),GCR33(UL33)(37),糖蛋白B(gB;UL55)(4,12,36),糖蛋白H(gH;UL75)(13,41,44),糖蛋白M(gM;UL100)(1,27,32)和糖蛋白L(gL;UL115)(24,28,33,50).
疱疹病毒(包括HCMV)的gH-gL复合物与病毒融合事件有关,包括病毒进入和细胞间传播(18——20,29,30,38,41,42,46,47). 为了了解HCMV gH-gL的特定分子功能,有必要定义这些糖蛋白在病毒中的结构组织。早期研究表明,240-kDa gCIII包膜复合体包含HCMV的gH和gL同源物(13,23,24,33,41,44). 然而,gH和gL在重组系统中的共表达并不能重建gCIII,这表明gCIII复合物含有不同于gH和gL的其他基因产物(24,33). gCIII的详细特征清楚地表明,来自HCMV感染细胞和纯化病毒的gCIII中存在125至145-kDa蛋白(23,24,33). 125-kDa蛋白在抗原和结构上均与gH或gL无关,这解释了gH和gL共表达导致gCIII重组缺失的原因,并表明复合物中含有第三种HCMV基因产物(24,33).
在本研究中,我们报告了125-kDa蛋白由HCMV UL74基因编码。125-kDa蛋白的生化特征表明它是一种糖蛋白,并建议UL74开放阅读框(ORF)可能是一个候选基因。纯化的125kDa糖蛋白的氨基酸微测序证实该糖蛋白是UL74基因的产物。此外,抗UL74抗体免疫沉淀240-kDa gCIII复合物,并特异性识别gCIII的125-kDa-糖蛋白成分。总之,这些数据证实了HCMV UL74基因产物,我们将其命名为糖蛋白O(gO),是gCIII复合物的第三个糖蛋白成分。有趣的是,HCMV gO基因在β疱疹病毒亚家族中具有位置同源性,对gO同源基因预测产物的比较揭示了一些共同的生化特征。
材料和方法
细胞、病毒和抗体。
如前所述,培养永生成纤维细胞(IF)(10). 如前所述,对HCMV的AD169菌株进行培养和滴度测定(10). 如前所述,分离出梯度纯化的病毒(11). 单克隆抗体14-4b(5)和AP865(51)由W.Britt慷慨提供,以及由A.Minson善意提供的多克隆抗体26388,如前所述(24).
免疫印迹和免疫沉淀。
免疫印迹和免疫沉淀基本上如前所述(24). 简言之,蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(有或无还原剂)分解,并电转移至硝化纤维素(Millipore)进行免疫印迹。用辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗鼠或抗兔抗体(Pierce)检测一级抗体。采用Renaissance Western blot化学发光试剂(NEN)检测过氧化物酶结合物。对于免疫沉淀,IF细胞用50μCi的[35S] 甲硫氨酸半胱氨酸(NEN)/ml持续16小时。放射免疫沉淀分析(RIPA)(24)用蛋白G(福尔马林灭活细胞悬浮液;Sigma)预处理细胞裂解物,并补充0.5%牛血清白蛋白。将沉淀抗体添加到裂解液中,并用固定化蛋白A(Pierce)回收抗体-抗原复合物。用RIPA裂解缓冲液对蛋白A颗粒进行广泛洗涤,并将其重新悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中(含或不含还原剂),以制备SDS-PAGE。将所得凝胶干燥并通过GS-525分子成像仪(Bio-Rad)成像。
N个-糖苷酶F生物素化蛋白质的消化。
IF细胞感染HCMV的多重感染率(MOI)为3。在感染后4天,用PBS-MC(磷酸盐缓冲盐[PBS]补充1 mM MgCl)清洗受感染的细胞单层2和0.1 mM CaCl2). 将PBS-MC中的EZ-link磺化-NHS-LC生物素(Pierce)(2 mg/ml)添加到细胞中,然后将其在37°C下孵育1 h。去除生物素溶液,并用PBS-MC广泛清洗细胞。为了淬灭生物素化反应,将PBS-MC中的10 mM甘氨酸添加到细胞,在37°C.下孵养10 min。去除甘氨酸溶液,并用PBS-MC广泛清洗细胞。N个-按照制造商的指示进行糖苷酶F(Boehringer Mannheim)消化。简单地说,在含有0.45%SDS和90 mMβ-巯基乙醇的PBS溶液中,将固定化蛋白A回收的免疫沉淀蛋白在95°C下加热3分钟。离心去除固定化蛋白A后,用PBS将变性蛋白溶液稀释两倍,在EDTA中制备50 mM,在Nonide P-40中制备1%。样品用10 U的N个-糖苷酶F在37°C下维持16小时。额外的3UN个-添加糖苷酶F,并将消化物再培养2小时。
从免疫亲和纯化的gCIII复合物中分离125-kDa蛋白。
7毫克抗体14-4b(5)按照制造商的指示,与1 ml CNBr活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)偶联。将100个含有IF细胞的近融合培养物的T150组织培养瓶以约3的MOI感染HCMV AD169。感染后5天,将受感染的细胞回收、造粒并重新悬浮在添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PIC)的RIPA缓冲液中(24)和10 mM碘乙酰胺在冰上放置30分钟;在43000×克将澄清的裂解液应用于14-4b柱,并通过蠕动泵连续循环16h。用30个柱体积的RIPA-PIC-碘乙酰胺清洗柱。用100 mM甘氨酸(pH 2.5)在含有1/10数量洗涤剂的RIPA-PIC-碘乙酰胺中洗脱结合蛋白,并通过添加1/10体积的1 M Tris(pH 8.5)立即中和。将含有gCIII复合物的组分(根据非还原性SDS-PAGE分析判断)合并,用Centricon过滤器(Amicon)浓缩,并进行非还原性的SDS-PAGE(6%凝胶)。为了尽量减少氧化剂和自由基的发生,这些自由基可能会阻塞蛋白质的N末端,所有制备的丙烯酰胺凝胶在使用前允许聚合24小时,并将0.1 mM巯基乙酸盐(Sigma)添加到这些制备凝胶的阴极运行缓冲液中。切除含有gCIII复合物的凝胶区域,并将其插入10%丙烯酰胺凝胶的孔中。如前所述,对凝胶切片进行二次还原SDS-PAGE(24). 将所得凝胶电转移至Immobilon-P平方25 mM(密理博)N个-乙基吗啉(pH至8.3,甲酸)–10%甲醇。通过在40%甲醇–10%乙酸中用0.1%氨基黑(Sigma)染色,然后在双蒸馏H中进行大量洗涤,可以在膜上观察到转移的蛋白质2O.然后干燥膜,在洛克菲勒大学蛋白质/DNA技术中心切除适当的切片进行N末端和内部微序列分析(16,17).
UL74特异性多克隆血清的生产。
HCMV UL74基因的一部分(对应于氨基酸32-466的密码子)通过PCR扩增Pfu公司HCMV AD169 DNA聚合酶(Stratagene),如前所述制备(24). 将UL74 PCR产物克隆到质粒pET28a(Novagen)中,该质粒将UL74基因置于六组氨酸标签编码序列的下游。pET28a-UL74转化为大肠杆菌BL21(DE3),并通过添加1 mM异丙基-β诱导产生重组UL74-His蛋白-d日-硫代吡喃半乳糖苷2 h。将含有重组UL74-His蛋白的不溶性包涵体溶解在6 M尿素中,并按照制造商(Novagen)的指示通过镍螯合色谱纯化。将纯化的UL74-His蛋白注射到新西兰白兔体内,以生产抗UL74多克隆血清。
蛋白质序列的计算机分析。
蛋白质序列的肽段和GAP分析是通过遗传计算机组(GCG)程序(GCG,Oxford Molecular Group,Inc.,Madison,Wis)进行的(15).
结果
识别编码gCIII 125-kDa成分的候选基因。
之前我们确定125-kDa蛋白在抗原上与gH和gL不同,很可能是HCMV基因的产物(24). SDS-PAGE中125-kDa蛋白的扩散带型表明它是一种糖蛋白。为了证实这一假设并促进125-kDa蛋白的遗传鉴定,我们对125-kDa蛋白进行了糖苷酶消化。为此,生物素化gCIII复合物被免疫沉淀并用N个-糖苷酶F去除高甘露糖和复合天冬酰胺(N)连接的低聚糖。当用链霉亲和素-HRP探测印迹以检测所有生物素化的蛋白质时,我们在来自感染细胞的未消化的免疫沉淀物中检测到两种125和90 kDa的蛋白质,它们分别代表125 kDa的蛋白质和gH(图。A) ●●●●。N个-糖苷酶F消化的蛋白质显示了65和84 kDa的两种蛋白质物种,可能对应于125-kDa蛋白质和gH的脱糖形式。为了确认90和84 kDa蛋白质物种是gH,图中的印迹。A被剥离并用gH-特异性抗体进行探测(图。B) ●●●●。因此,65-kDa蛋白物种代表缺乏N-连锁链的125-kDa-蛋白(未评估其他翻译后修饰,如O-连锁低聚糖的存在),证实了其带型,它是一种糖蛋白,在65 kDa或更少的肽骨架上含有约60 kDa的N-连接糖基化。这一生物化学特征与Li等人的发现相似,他们表明125kDa的蛋白质含有简单和复杂的N-连接糖,核心蛋白大小约为64kDa(33). 估计单个N-连接的寡糖链会使蛋白质的质量增加2至4 kDa,该分析表明,编码125-kDa糖蛋白的基因将包含15至30个N-连接的糖基化位点,一级序列约为590个氨基酸或更少。对HCMV基因组的检查显示只有两个ORF与这些特征相匹配。UL74基因预测了一个含有466个氨基酸和18个潜在N-糖基化位点的蛋白质,TRL/IRL12基因预测了416个氨基酸的蛋白质和23个潜在N-糖基化位点。这两个基因均被克隆并表达为重组蛋白,用作生产UL74(本报告)和TRL/IRL12特异性抗体的抗原(数据未显示)。
N个-125-kDa蛋白质的糖苷酶消化。用抗体14-4b对模型感染和HCMV感染的IF细胞进行表面生物素化和免疫沉淀。免疫沉淀蛋白在有或无N个-糖苷酶,经过还原SDS-PAGE,并用硝酸纤维素进行电印迹。(A) 用链霉亲和素HRP进行免疫印迹检测生物素化蛋白。(B) 将A组中的印迹剥离,然后用抗gH抗体和HRP结合的山羊抗鼠抗体进行复制。免疫沉淀抗体的免疫球蛋白重链。
125-kDa糖蛋白的纯化和微序列测定。
为了获得分离的125-kDa糖蛋白,通过单克隆抗体亲和层析从HCMV感染的成纤维细胞中纯化gCIII复合物。在非还原性SDS-PAGE后,将从柱上洗脱的gCIII复合物从凝胶中取出,进行第二次还原性SDS-PAGE,然后转移到Immobilon膜上,为微序列分析做准备。该程序导致三种复杂成分的纯化和分离(数据未显示)。为了确保我们已经分离出gCIII复合物,并且我们的纯化方法不会对随后的微序列分析造成固有的损害,最初对含有对应于gH的蛋白质的膜部分进行N-末端微测序(17). 对该样品进行微测序,得到氨基酸序列XXEALDPHAFHLLN,对应于gH的氨基酸32(E)到44(N)。该序列约为NH下游的14个氨基酸三信号肽(氨基酸1至18)裂解后预测的末端(13). 这一结果表明,实际的信号肽比预测的长,或者gH的N末端是翻译后蛋白质水解处理的。对125-kDa糖蛋白的类似分析表明,它被N末端阻断。为了对一种内源性肽进行微量测序,用内蛋白酶Lys-C消化125-kDa糖蛋白,并用高压液相色谱纯化得到的肽(16). 单个纯化肽的序列产生了明确的氨基酸序列LYVGPTK。利用该肽序列进行的FASTA数据库搜索显示,与HCMV UL74基因预测产物的189到195个氨基酸完全匹配(9)(图。B) ,通过125-kDa糖蛋白糖苷酶分析确定的候选基因之一。
(A) HCMV UL74基因预测产物的氨基酸序列。与源自125-kDa糖蛋白的内部肽序列相匹配的序列用黑色方框包装。疏水结构域被装箱,并强调了潜在的N-连接糖基化位点。两个潜在的肝素结合序列用虚线划线。右边的数字表示氨基酸残基。(B) UL74氨基酸序列的Kyte Doolittle水病分析。线条上方和下方的区域分别表示亲水和疏水区域。线条图上方的刻度表示氨基酸残基。
HCMV UL74基因产物的预测特征。
UL74基因编码一个466氨基酸蛋白,其计算多肽骨架为54.2 kDa(图。a) ●●●●。Kyte Doolittle水病分析(31)(图。B) 揭示了N末端附近的一个疏水序列(氨基酸14到30),可能是一个信号序列。没有检测到其他可能作为跨膜结构域的重要疏水序列。因此,UL74糖蛋白通过与gH的相互作用是可溶的和膜相关的,或者是一种II型跨膜蛋白,因为疏水结构域从引发剂蛋氨酸中插入14个氨基酸。这些可能性正在调查中。一级氨基酸序列包含18个潜在的N-连接糖基化位点。UL74一级序列中有两个额外的潜在N-连接糖基化位点,但这些位点之后是脯氨酸残基,因此不能作为低聚糖添加的位点(三). 氨基酸271和337之间也存在丝氨酸和苏氨酸残基的聚集,表明可能存在O-连接的糖基化。根据GCG软件包中的Peptidesort计算的等电点10.3,UL74基因产物被预测为基本蛋白质(15). 有趣的是,UL74序列中存在的许多碱性赖氨酸和精氨酸残基浓缩为两段氨基酸(残基245和270之间),这与常见的肝素结合序列类似(6)(图。B) ●●●●。UL74序列还包含六个半胱氨酸残基(其中一个位于预测的疏水序列中),它们可能对二硫键很重要。六个半胱氨酸残基中的五个位于序列的N末端。
HCMV基因产品命名于1993年(49). 编码糖蛋白的基因被指定为“gp”以及相应的ORF;因此,UL74基因产物将被命名为gpUL74。为了与其他疱疹病毒包膜糖蛋白的命名保持一致,我们还选择在大写字母前用“g”表示该蛋白。由于最后一个被命名的疱疹病毒糖蛋白是gN(2,26),我们将UL74糖蛋白指定为糖蛋白O(gO)。
HCMV感染IF细胞中gO的特征。
在HCMV感染的细胞裂解物的免疫印迹分析中,对重组形式UL74(gO)产生的抗体进行了分析(图。A) ●●●●。gO抗体与广泛迁移于100-125kDa之间的蛋白质物种特异性反应;本种显然包含几种可能归因于加工中间体或替代物的成分。需要进行脉冲相位实验来确定各种形式之间的关系(25). gO-免疫反应性物种在感染后48小时开始出现,在感染后72至96小时达到最高水平(图。A) ●●●●。此外,其他gCIII糖蛋白组分gH和gL的表达动力学与gO相似(图。B和C)。gO、gH和gL表达的这个时间过程与病毒结构蛋白的表达一致,病毒结构蛋白通常在感染后期以最高水平表达。
gO、gH和gL表达的时间进程。IF细胞感染HCMV(MOI为3)或模拟感染,然后在感染后每隔24小时进行裂解,如图所示。裂解产物通过还原SDS-PAGE和电转移进行溶解,印迹与抗gO抗体(A)、抗gH抗体AP865(B)或抗gL抗体26388(C)反应。
gO存在于纯化的HCMV病毒中。
由于125-kDa糖蛋白是在病毒粒子中发现的成熟gCIII复合物的一部分,因此预测gO存在于纯化的带状病毒颗粒中。通过用gO抗体进行免疫印迹纯化的HCMV病毒粒子来验证成熟病毒颗粒中gO的存在。图表明gO抗体与125-kDa物种特异性反应,其大小和迁移模式与gCIII的125-kDa糖蛋白组分一致。gO抗体还与大约100-kDa的物种发生反应,该物种的大小与感染细胞中存在的100-kDa形式的gO相似(25). 这一结果表明,成熟病毒中可能存在交替处理的gO形式;检验这种可能性的实验正在进行中。
纯化HCMV病毒的免疫印迹。梯度纯化的病毒在还原性SDS-PAGE样品缓冲液中溶解,用SDS-PACE溶解,然后电转移到硝化纤维素。用免疫前血清(作为对照)或抗-gO抗体(ab)检测印迹。
gO抗体免疫沉淀240-kDa-gCIII复合物并识别gCIII的125-kDa糖蛋白成分。
为了确认gO是gCIII复合物的125-kDa第三组分,将gO抗体用于免疫沉淀放射性标记HCMV感染的IF细胞的裂解物。如图所示。A、 gO抗体免疫沉淀出一种240kDa的物种,与真正的gCIII复合物结合(24). 为了验证由gO抗体免疫沉淀的240-kDa物种是gCIII复合物,对含有240-kDa物种的干凝胶切片进行切除、还原并进行后续SDS-PAGE;作为对照,抗体14-4b免疫沉淀的240-kDa gCIII复合物也被切除并减少。图B显示,由gO抗体免疫沉淀的240-kDa物种减少产生三种蛋白质,一种约为125kDa,一种为90kDa和一种约36kDa的双链蛋白,分别代表gO、gH和gL。抗体14-4b免疫沉淀的gCIII复合物减少后,观察到相同的情况(图。B) ●●●●。为了进一步证实125-kDa糖蛋白代表gO,图。用gO抗体或gH抗体免疫印迹B。图C表明从任一免疫沉淀物衍生的125-kDa糖蛋白被gO抗体检测到。类似地,用来自两种免疫沉淀物的抗gH抗体检测到90kDa gH蛋白。这些数据证明存在于gCIII包膜复合体中的125-kDa糖蛋白(我们称之为gO)是由UL74基因编码的。
通过gO抗体免疫沉淀gCIII复合物。HCMV感染的细胞被代谢标记为[35S] Met-Cys,用抗gO抗体或抗gH/gCIII抗体14-4b进行裂解和免疫沉淀。(A) 用所示抗体免疫沉淀的蛋白质通过非还原性SDS-PAGE溶解。(B) 通过抗-gO或抗-gH免疫沉淀沉淀的~240-kDa物种从干燥凝胶中去除,还原,并通过第二还原SDS-PAGE溶解。(C) 将面板B中的重复凝胶电转移到硝酸纤维素上,并用抗gO抗体或抗gH抗体AP865进行探测。
HCMV gO基因在其他β-疱疹病毒中具有位置同源性。
我们检测了其他疱疹病毒的基因组中HCMV UL74基因的同源物。有趣的是,UL74基因位于HCMV基因组中所有疱疹病毒中保守的两个基因块之间(9,39)(图。A) ●●●●。UL74基因上游的保守基因阻断包括UL69到UL73(gN同源)ORF,UL74基因下游的保守基因阻滞包括UL75(gH)到UL79 ORF(9,39)(图。A) ●●●●。密切相关的β-疱疹病毒,包括小鼠巨细胞病毒(MCMV)的基因组检查(45),人类疱疹病毒6A(HHV-6A)(21,22),HHV-6B型(14,35),和HHV-7(40)显示了与HCMV中相同的基因组织,gO位置同源基因两侧是gN基因块和gH基因块(图。B) ●●●●。在α疱疹病毒单纯疱疹病毒1型和水痘带状疱疹病毒中,以及在γ疱疹病毒EB病毒和HHV-8中,这两个保守基因块的基因组结构与HCMV中的不同(9,39,48). 如果这四种疱疹病毒中存在gO位置同源基因,则gO同源基因应与gH基因或gN同源基因相邻。然而,在这四种疱疹病毒中,与gH和gN基因相邻的基因中没有一个编码具有N端信号序列和预测的基本等电点的高度糖基化蛋白(数据未显示)。因此,虽然这些疱疹病毒可能编码在结构或功能上类似于gO的糖蛋白,但在α-或γ-疱疹病毒中似乎没有gO位置同源基因。事实上,EBV BZLF2基因(不是HCMV UL74基因的位置同源物)编码一种糖蛋白gp42,它是EBV gH-gL复合物的第三组分,这一点已经得到了很好的证实(34).
β疱疹病毒基因组示意图显示了gO基因的位置同源性。开盒代表基因组的末端和内部重复区域;条纹框代表包括gN同源物在内的保守基因块;黑盒子代表gO基因;带阴影的盒子代表包括gH基因在内的保守基因块。(A) HCMV基因组;(B) MCMV、HHV-6A、HHV-6 B和HHV-7基因组。
对HHV-6A、HHV-6B、HHV-7和MCMV gO位置同源基因的氨基酸序列分析表明,GCG软件包中的GAP分析表明,在氨基酸水平上,与HCMV g0平均有40%的相似性和20%的一致性(15)(表). 这种相对较低的同源性并不奇怪,因为疱疹病毒糖蛋白同源物之间的氨基酸同源性通常较低。例如,根据GAP分析确定,HCMV gH和HCMV gL与其他β-疱疹病毒gH和gL同源物的氨基酸同源性分别约为27%和28%(15)(未显示数据)。对gO同源氨基酸序列进行比对分析以确定相似区域,没有发现任何明显的保守结构域(数据未显示)。然而,gO位置同源基因的预测产物确实具有许多生物化学特征(表). 据预测,gO同源物是高度糖基化的蛋白质,包含7到23个潜在的N-连接糖基化位点(表). gO同源氨基酸序列还包含丝氨酸和苏氨酸残基簇,表明可能存在O-连接的糖基化,以及5到6个半胱氨酸残基,这些残基几乎只存在于预测蛋白质的N末端一半(数据未显示)。此外,gO同源物似乎是基本蛋白质,根据GCG软件包中的Peptidesort估计,计算出大约10个等电点(15)(表).
表1
病毒 | 基因命名 | 氨基酸数量 | NXT/S站点数量 | 圆周率一 | 半胱氨酸残基数量 | %氨基酸相似性b条/%氨基酸同一性b条至HCMV UL74 |
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HCMV公司 | UL74型 | 466 | 18 | 10.3 | 6 | 不适用c(c) |
HHV-6A型 | U47型 | 651 | 18 | 10.3 | 5 | 39.1/19.4 |
HHV-6B型 | KA8L公司 | 738 | 23 | 9.4 | 5 | 36.1/19.4 |
HHV-7型 | U47型 | 313 | 11 | 10.3 | 6 | 42.7/22.5 |
MCMV公司 | 74米 | 438 | 7 | 9.8 | 6 | 43.4/22.0 |
讨论
在这篇报道中,我们报道了一种125-kDa HCMV包膜糖蛋白的遗传特性,该糖蛋白与gH和gL结合形成病毒gCIII包膜复合物。通过多行证据,我们证明了这种125-kDa糖蛋白成分是HCMV UL74基因的产物。首先,125-kDa糖蛋白的生化特性表明HCMV UL74基因是潜在的候选基因。其次,来自纯化125-kDa糖蛋白的肽的氨基酸微序列与UL74基因预测产物中的序列相匹配。第三,针对UL74的抗体免疫沉淀gCIII复合物并识别gCIII的125-kDa糖蛋白成分。我们将HCMV UL74糖蛋白指定为gO,与疱疹病毒糖蛋白的命名一致。
HCMV gO基因具有与预测的生化特征相同的位置同源物,这一发现表明其他疱疹病毒在其各自的gH-gL复合物中含有第三种糖蛋白成分。有趣的是,这些gO位置同源物似乎只存在于其他β-疱疹病毒中,这表明gO同源物代表了首次描述的β-肝炎病毒特异性包膜糖蛋白同源物。α疱疹病毒是否编码类似于gO的蛋白质尚待确定。然而,已经很好地证实了EBV糖蛋白gp42是EBV gH-gL复合物的第三种成分(34). gp42与gO的比较没有发现任何明显的相似之处。gp42要小得多(42 kDa对125 kDa),含有的碳水化合物也少得多(10 kDa的N-连接糖基化对至少60 kDa而言),并且与EBV gH和gL结合不需要二硫键(34). 对gp42氨基酸序列的检查并没有发现它是一种基本蛋白质(计算的等电点为8.6[数据未显示])。gp42和gO之间唯一明显的生化相似性是两者都被预测为II型跨膜蛋白(34). 最有可能的是,比较gp42和gO的功能将表明这两种糖蛋白的真正相关性。
gO在HCMV感染中起什么作用?由于没有为gO指定分子功能,我们只能推测gO的潜在功能。由于gO与gH-gL复合物相关,是病毒融合机制的关键参与者(29,30,41)gO的一个明显功能可能是促进感染的进入和/或细胞间传播。特别是,在进入某些特定的细胞类型时,可能会严格要求gO。已发现HCMV与体内多种不同的细胞类型相关,很可能病毒可以采用不同的进入方式进入这些不同的细胞。gO的这种作用将反映EBV gp42的功能,已证明病毒进入一种允许的细胞类型(B细胞)而不是另一种允许细胞类型(上皮细胞)所需的功能(34,52). 或者,如初级序列分析预测的那样,证明gO具有肝素结合能力,可能意味着在融合前病毒的附着或稳定中发挥作用。目前正在努力分析gO和gH-gO-gL复合物在HCMV感染中的特定分子功能。
本研究强调了HCMV研究的一个重要局限性。常用的实验室菌株AD169中有57种潜在的糖蛋白(9)临床分离株中多达70个糖蛋白ORF(7). 这种无与伦比的糖蛋白编码能力支持了HCMV具有功能补偿和功能冗余的潜力的假设,这是疱疹病毒包膜蛋白的一种现象,但这意味着HCMV还具有针对HCMV感染生物学中的复制和致病特征定制的特殊功能角色的能力。因此,值得注意的是,很少有基因产物具有感染细胞内生物合成和并入病毒的特征。与数量未知的单个糖蛋白结合,有三种主要的二硫键连接的包膜复合物,每种复合物在感染的进入和传播中都具有相关的功能作用。在本报告之前,只有gCI复合物含有与细胞膜联蛋白II相关的gB二聚体(4,23,43)从结构和基因上进行了定义。这里我们报告了gCIII的完整遗传组成。gCII复合物在肝素结合中具有建议的作用,它至少有三种蛋白质成分,其中只有一种被映射到病毒基因组(1,27,32). 因此,在充分阐明病毒进入和传播的机制之前,无论是在模型、容许性成纤维细胞还是生物靶向细胞类型(如单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞)中,必须确定包膜的组成,并确定编码蛋白质的基因。