与绝大多数核复制DNA病毒一样，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）基因表达可以很容易地分为两组：早期基因在病毒基因组复制开始之前表达，晚期基因在这一事件之后表达最大。病毒早期蛋白的转录调控在病毒基因差异表达中起着重要作用。虽然HSV启动子在结构上与细胞启动子相似，但其调节转录受到涉及病毒和细胞蛋白的复杂调控层次的影响（参考文献综述41和42).
主要HSV-1调节蛋白ICP4在激活所有动力学类启动子的基因表达中起着重要作用，可能是通过转录活性启动子上的TFIID稳定起始前复合物的形成(4). ICP0也明显参与晚期基因表达，尽管它在高感染多样性中是不必要的(三). 第三种即时早期调节蛋白ICP27也参与早期/晚期转换。一个主要功能似乎是通过细胞转录物剪接的干扰和非剪接mRNA的选择性转运在转录后水平上(15,16,37).
在基因组复制之前，通过直接的DNA-蛋白质相互作用对晚期启动子的主动抑制似乎在从早期基因表达转换到晚期基因表达中没有主要作用。相反，HSV启动子内调节转录的特定蛋白与其同源识别位点之间的相互作用决定了启动子强度。这一观点的最有力证据是，虽然严格的晚期启动子和泄漏晚期启动子仅在复制时在病毒基因组背景下以最大速率激活，但当通过转染或通过体外转录检测引入细胞时，这些启动子基本上与早期启动子一样活跃。此外，当在重组病毒感染或使用未感染的核提取物进行体外转录时测量转录水平时，导致晚期启动子活性丧失的突变表现出同等的缺陷(13,18).
病毒DNA复制的开始对于阻断早期基因表达和启动晚期基因表达非常重要(41). 含有PML蛋白的未知细胞功能的核结构（核结构域10[ND10]）可能在感染早期起转录中心的作用(25). 病毒调节蛋白在感染后约4小时通过ICP0介导扩散之前定位于这些区域(24). 病毒DNA合成和后期转录发生在受感染细胞的细胞核内，其形成也由病毒功能介导(29). 核区隔化的改变可能在基因表达从早期到晚期的转换中起着重要作用。
我们的实验室致力于使用插入病毒基因组中非必需位点的修饰启动子作为识别病毒启动子共同结构特征的手段，目的是定义各种动力学类别的原型(39). 我们目前的病毒转录程序随着感染的进行而发生变化的图片设想，所有病毒启动子在一般转录环境中都是等效的。在这种情况下，细胞转录因子可用性的改变，病毒调节蛋白的无数活动，核结构的改变，以及病毒DNA复制后转录活性模板的指数增加，都是在理解不同动力学类别的病毒启动子的差异时间表达的基础时需要考虑的因素。
我们实验室和其他实验室以前的工作已经确定了重要的顺式-一组结构相关的严格晚期（γ）启动子中的作用元件(12——14,20,43). 这类晚期启动子，其中控制UL（左）38，美国S公司11、gC和UL（左）49.5是一个例子，在病毒基因组的背景下，野生型基因表达需要三个元素。这些是位于约−30的TATA盒、转录起始位点的一致性哺乳动物启动子（Inr）元件以及位于+20到+30的下游激活序列（DAS）。该启动子结构表明了晚期转录激活的共同机制，并且与细胞启动子的核心特征类似，例如热休克蛋白70(35)，c-金属氧化物半导体(33)和编码胶质纤维酸蛋白的基因(31).
U环境下DAS的关键突变L（左）38启动子可以将转录降低到野生型水平的10%以下，而不会影响通过组织培养细胞的重组病毒感染测量的表达动力学(13). 如前所述，我们确定了DAS的核心碱基，并通过电泳迁移率变化分析检测了DAS和细胞蛋白（DAS结合因子[DBF]）之间的特定DNA蛋白相互作用(13). 在本次交流中，我们进一步探讨了DAS在晚期基因表达中的功能，并表征了DAS与该蛋白的相互作用，我们证明它是DNA-dependent protein kinase（DNA-PK）的DNA结合成分（Ku异二聚体）。
材料和方法
病毒和细胞。
细胞和病毒的繁殖和维持如前所述(10,14). HeLa S3纺纱机培养物由国家细胞培养中心（明尼阿波利斯，明尼苏达州）提供。
发起人UL（左）38Δ+9/DAS和UL（左）38Δ+9/das3之前已进行了描述（其结构如图所示。A）(13). DAS中心四个碱基的突变导致UL（左）38Δ+9/das3质粒，广泛降低了DBF的结合能力。报告质粒或重组病毒中的这种突变表现出低于野生型水平10%的表达水平。
在U的背景下用NRE1替换DASL（左）38.（A）所用促进剂示意图。U的野生型表达所需的三个元素L（左）图中显示了38个。相对于DAS更改的基数用小写字母表示。（B） 使用U或U的体外转录反应L（左）38Δ+9/DAS（DAS），UL（左）38Δ+9/NRE1（NRE1），UL（左）38Δ+9/das3（das3）或Ad MLP/β-gal（MLP）。以500 ng的浓度使用超冷却质粒，并使用β-半乳糖苷酶特异性引物通过引物延伸分析转录物。（C） 重组病毒的结构。U型L（左）将38个控制β-半乳糖苷酶的启动子结构（暗矩形）插入U的gC位点L（左）在病毒基因组中。（D） 在指定的时间（感染后2或7小时），从感染过任一U的细胞中收获RNAL（左）38Δ+9/DAS，UL（左）38Δ+9/NRE1或UL（左）38Δ+9/das3或未感染（模拟），并使用β-半乳糖苷酶（β-gal）特异引物或VP16特异引物进行引物延伸分析。
U型L（左）通过将双链寡核苷酸（5′-GATCTCCCGGCCGGAAAGAGAGCCTCCC-3′和5′-CCGGGGGGAGGCTCTTCTCCGGCGCGCGC-3′）克隆到Bgl公司二/Sma公司U的I站点L（左）pGEM3中的38Δ+9/DAS（Promega）。为了产生重组病毒，用Xba公司我/天冬氨酸718，启动子片段被克隆到gC重组盒中，然后转染到带有感染性DNA的细胞中，并按照前面所述进行筛选(10,14). 通过PCR评估病毒的纯度，并通过二脱氧测序确认启动子序列(14).
蛋白质纯化。
通过修改Dignam等人的方法，从HeLa S3细胞的纺纱培养物中生成核提取物(5). 色谱步骤（图。A） 包括P11磷酸纤维素（Whatman）、Q Sepharose（Pharmacia）和肝素-脑葡萄糖（Pharmachia）。使用前面描述的条件，通过凝胶位移分析组分的活性(13)，并使用商业蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）测量蛋白质浓度。最后一步是使用制备凝胶转移，类似于Gander等人所述的方法(7). 在含有SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳之前，从凝胶中取出DBF对应的材料，进行电洗脱，丙酮沉淀，并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液中重新悬浮。除含有DBF-DAS复合物的制备凝胶片在D缓冲液（20 mM HEPES[pH7.9]、0.2 mM EDTA、20%甘油、0.1 M KCl、0.5 mM二硫苏糖醇、0.5 mM-苯甲基磺酰基氟化物）中培养外，天然洗脱DBF的制备方法如上所述含有0.05%Nonide P-40，在4°C下摇晃过夜，并通过肝素-脑葡萄糖色谱和超滤进行浓缩。
DBF作为DNA-PK的DNA结合成分的纯化和鉴定。（A）从未感染HeLa核提取物（NE）中纯化DBF的策略。表明TFIID从P11磷酸纤维素（1.0 M KCl）中洗脱。如图所示，DBF的存在是通过竞争性凝胶位移分析确定的。.（B）制备凝胶转移。用凝胶转移结合缓冲液（10 mM HEPES[pH 7.9]，10%甘油，25 mM KCl，0.5 mM EDTA，2.5 mM磷酸盐缓冲液[pH 7.9]，0.1%Nonide P-40，2.5 mM-二硫苏糖醇，0.5 mM-苯甲基磺酰基氟化物）透析肝素-脑糖色谱（0.5 M KCl洗脱）后含有DBF的馏分用于凝胶转移反应，放大约250倍。仅显示DBF-DAS复合物，因为未结合探针从凝胶中流出。（C） DAS亲和纯化DBF的12%变性聚丙烯酰胺蛋白凝胶。图B所示的DBF-DAS复合物以及无DNA对照凝胶转移反应的相应区域被分离出来，并在含有SDS的12%聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后进行考马斯蓝染色。获得了约33 kDa的非特异性蛋白质带（在无DNA和有DAS DNA的反应中发现），以及约70和86 kDa DAS DNA特有的两条带。MW，分子量标准（位置显示为左侧以千为单位的数字）。（D） 含DBF蛋白质组分的免疫印迹分析。在含有SDS的10%（Ku）或7%（DNA-PKcs）聚丙烯酰胺凝胶上电泳并转移至硝化纤维素后，通过凝胶位移法测定具有DBF活性的组分通过Western blotting进行分析。所用的一级抗体浓度为1:2000的抗Ku-p86和1:50000的抗DNA-PKcs。辣根过氧化物酶偶联的第二抗体，驴抗山羊（Ku）和山羊抗兔，以1:2500的稀释度使用。蛋白质提取物负载：通道1，P11磷酸纤维素（PC）0.3 M洗脱；通道2，Q Sepharose（Q）0.3 M洗脱；通道3，肝素-脑葡萄糖（H）0.5 M洗脱；通道4，制备凝胶纯化DBF（Prep）；通道5，乙酰肝素酶0.5 M洗脱；通道6，制备凝胶纯化DBF。
蛋白质序列分析。
在上述制备凝胶转移和蛋白质洗脱后，在含有SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶上运行DBF，并通过考马斯蓝R-250染色进行可视化。耶鲁大学凯克基金会切除含有纯化DBF的凝胶区域（约200 pmol）并测序。用胰蛋白酶原位消化单个多肽，并用高压液相色谱（HPLC）纯化多肽。通过液相色谱-质谱法对单个肽进行分析，随后的质量用于使用SeQuest搜索OWL数据库(44).
RNA分离和分析。
在感染后2和7 h使用Trizol（Gibco BRL）分离总细胞RNA。使用10μg RNA和50 fmol a的引物延伸反应32P-标记的β-半乳糖苷酶引物（5′-GTGTCGAGGGGAAAAATAGGTGCGCGAG-3′）或32如前所述，在含有8M尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶上分析P标记的VP16引物（5′-TTAGAGGACCGGACCTTTAT-3′）(13). U的预期产物大小为90个核苷酸L（左）VP16的38和65个核苷酸。
体外转录。
根据制造商（Qiagen）提供的协议制备过冷质粒DNA。所有质粒均利用载体pGEM3。腺病毒主要晚期启动子（Ad-MLP）与β-半乳糖苷酶报告基因（Ad-MLP/β-gal）组成的构建物用作对照，是T.Osborne的礼物。DNA定量通过紫外吸收进行，并通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。如前所述，使用β-半乳糖苷酶特异性引物进行体外转录反应并通过引物延伸进行分析(13,18). 对于热处理实验，如其他地方所述，在使用核提取物之前，将其加热至47°C 15分钟(30,34). 重组人TATA结合蛋白（rhTBP）购自Upstate Biotechnology，人DNA-PK购自Promega。使用的模板和蛋白质浓度如图图例所示。U的预期产物大小为90个核苷酸L（左）38个启动子转录本和81个核苷酸用于Ad MLP/β-gal转录本。对于转录物丰度定量，使用了荧光成像仪（分子动力学），并使用IPLab Gel软件对结果图像进行分析。
免疫印迹（Western blot）分析。
将含有约等量DBF（通过凝胶转移活性估计）的组分加载到含有7%SDS的聚丙烯酰胺凝胶上，用于与DNA-PK催化亚基（DNA-PKcs）特异性抗体进行免疫印迹，或将含有10%SDS的聚丙烯酰胺凝胶加载到含有Ku特异性抗体的免疫印迹。在SDS-PAGE和转移到硝化纤维素后，用增强化学发光法（Amersham）进行蛋白质印迹。使用的抗体包括1:50000稀释度的抗DNA-PKcs（Ab145；布鲁克海文国家实验室C.Anderson赠送）和1:2000稀释度的抗Ku p86（圣克鲁斯生物技术）。二级抗体是针对DNA-PKcs的辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体和针对Ku的辣根过氧化物酶驴抗山羊抗体，两者的稀释度均为1:2500。
紫外线交联。
除使用亲合力纯化的DBF外，UV交联实验如前所述进行(13). 对于竞争实验，同时添加竞争DNA和探针。
缺少联系人足迹。
与DAS上链或下链对应的寡核苷酸(13)末端标记有[γ-32P] 与互补链退火前的ATP。这些单端标记探针在腺嘌呤和鸟嘌呤残基上用甲酸进行有限修饰，在胸腺嘧啶和胞嘧啶残基上则用肼进行有限修饰(26). 该探针随后用于与纯化DBF的凝胶转移反应。在4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，分离出与DBF-DAS复合物和DAS单独对应的凝胶区域，并进行电洗脱，然后进行哌啶裂解。在含有8 M尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶上分解裂解产物。
结果
DBF是一种不同于TFIID的细胞蛋白。
如引言所述，我们之前描述了HSV-1 U内的三个调节元件L（左）38启动子：TATA盒（Inr元件）和DAS（相对于转录起始位点位于+20和+33之间的下游调控序列）。DAS内特定碱基的突变将转录降低到野生型水平的10%以下，如通过体内重组病毒感染或通过使用未感染的HeLa细胞核提取物的体外转录反应所测定的。我们之前鉴定了DBF，这是一种在未感染和感染的细胞核提取物中发现的细胞蛋白或蛋白质复合物，通过竞争性凝胶位移分析测定其与DAS特异结合(13).
通过足迹实验表明，与DAS序列不相似的几个下游元素与TFIID组分相互作用(1,2,30,35,45). 因此，我们最初怀疑TFIID可能与DAS相互作用。我们通过P11磷酸纤维素色谱分离HeLa核提取物，该色谱使用TFIID在1.0 M KCl洗脱将基础转录因子分离为不同的组分(5). 通过凝胶位移分析分析纯化步骤中产生的组分与DAS的结合能力。如图所示。A、 0.3 M KCl组分含有蛋白质，当与标记的DAS探针孵育时，蛋白质会形成典型的DAS-DBF凝胶移位复合物。
在0.3 M P11磷酸纤维素组分中检测到一种特定DAS-DBF复合物，该复合物与TFIID和其他基础转录因子不同。（A） P11磷酸纤维素分馏HeLa核提取物的凝胶位移分析。HeLa核提取物在P11磷酸纤维素柱上分馏，所得部分的等分（1至2μl）用0.5 ng32P标记的DAS探针和每次反应250 ng聚（dI-dC）。反应条件如参考文献所述13。只分析了含有蛋白质的组分。缩写：L，载荷；FT，流动（未与柱结合的材料）。（B） 利用0.3M KCl P11磷酸纤维素组分进行竞争性凝胶位移分析。同时添加竞争对手（对应于野生型DAS或das3突变的未标记DNA）和探针。使用的竞争对手数量：1号车道，无；2号车道，10×DAS；3号车道，50×DAS；4号车道，100×DAS；5号车道，200×DAS；车道6，10×das3；车道7，50×das3；车道8，100×das3；车道9200×das3。
增加未标记的DAS DNA的量有效地减少了DNA结合物种中标记的探针的量。相比之下，由于添加了未标记的das3 DNA（图。B类；将车道3与车道6进行比较，将车道4与车道7进行比较）。das3序列的DAS核心从GAGCGGTAG突变为GA美国汽车协会标签。只有当竞争对手的水平比DAS探针的数量大200倍时，DBF-DAS复合体才会因与das3序列的竞争而大幅减少（第9车道）。这一结果得到了一致的观察，并且与das3部分替代野生型序列的能力相一致。
尽管一种对转录激活物无反应的TFIID（B-TFIID）被证明可以用0.3M KCl洗脱，但它不能直接与基本启动子结合，如Ad-MLP(40). 此外，我们仅在1.0M洗脱液中通过Western blot分析检测到TBP（数据未显示）。由此，我们得出结论，我们在凝胶位移中检测到的蛋白质不是holo-TFIID的成分。
DBF的纯化和鉴定为DNA-PK。
接下来，我们继续通过图中所示的色谱步骤纯化包含DBF的蛋白质。A.通过使用与图中所示DAS和das3 DNA序列相同的竞争性DNA凝胶位移分析，在每个步骤中确认适当部分中存在DBF。B。
作为最后的纯化步骤，我们进行了制备凝胶转移（图。B） 然后在12%凝胶上进行电洗脱、沉淀和SDS-PAGE。如图所示。C、 在蛋白凝胶上获得了约70和86 kDa的两条显著条带。一条约33kDa的条带也与DBF共纯化，但该蛋白似乎是非特异性的，因为在没有DAS DNA的对照制备凝胶中也发现了该蛋白。
分别从蛋白凝胶中切下70和86 kDa蛋白，并用胰蛋白酶原位消化。凯克基金会（Keck Foundation）的工作人员通过HPLC对每种蛋白质的肽进行了单独纯化，并通过质谱分析（数据未显示）。结果肽块用于搜索蛋白质数据库。70-kDa蛋白被鉴定为70-kDa亚基，86-kDa-蛋白被鉴定为由DNA-依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的DNA结合成分组成的Ku的86-kDa亚基。
DNA-PK由三种蛋白质组成，Ku的70和86 kDa亚基以及350-kDa DNA-PKcs(6). 为了确认DBF作为DNA-PK的鉴定，我们使用Ku和350-kDa催化亚单位抗体对纯化路线的各种活性部分进行了Western blotting；图中显示了一些有代表性的数据。D.磷酸纤维素、Q Sepharose、乙酰肝素酶和制备凝胶位移中的DAS结合部分均与这两种抗体反应（使用DNA-PKcs抗体进行免疫印迹分析时，仅显示乙酰肝素酶和制性凝胶位移部分）。这一结果表明，是整个DNA-PK蛋白复合物在功能上等同于DBF。
将凝胶纯化的DBF或DNA-PK添加到HeLa核提取物中可以特异性地增加UL（左）38
因为DAS在U环境中工作L（左）38启动子-当用未感染的细胞核提取物进行体外转录分析时，我们进行了一系列体外转录实验，以确认DNA-PK被鉴定为DBF，并开始表征其作用模式。我们利用了Nakajima等人的观察结果(30)核提取物的热处理通过TBP变性导致TFIID解离，以研究DBF和DAS在转录起始中的作用。
用未经处理或加热至47°C 15分钟的提取物进行体外转录反应（图。A） ●●●●。我们证实，向热处理的HeLa细胞提取物中添加rhTBP能够完全恢复Ad-MLP的转录，而Ad-MLP不包含类似于DAS的下游元素。
U的转录激活L（左）（A）向热处理的核提取物中添加rhTBP能够恢复UL（左）含有野生型或突变DAS的38个启动子。含有U的超冷却DNA模板（500 ng）L（左）38Δ+9/DAS，UL（左）38Δ+9/das3或Ad MLP/β-gal通过使用未经处理的核提取物、使用前加热至47°C 15分钟的核提取物或添加100 ng TBP的加热提取物进行体外转录。使用β-半乳糖苷酶特异性引物通过引物延伸分析所得转录物。（B） 在热处理的核提取物中添加rhTBP和亲合纯化DBF能够刺激UL（左）38Δ+9/DAS转录。体外转录反应（100 ng UL（左）38Δ+9/DAS）进行比较，比较未处理的核提取物与热处理的核萃取物，热处理的核萃取物补充天然洗脱DBF单独、TBP单独或DBF和TBP。补充TBP的反应使用25ng的重组TBP。补充DBF的反应含有大约100 nmol亲和纯化的DBF，这些DBF已在D缓冲液中透析。（C） 向核提取物中添加外源DNA-PK能够特异性刺激UL（左）38.使用HeLa核提取物和100 ng指定模板进行体外转录反应。在添加三磷酸核苷之前，添加更多纯化的DNA-PK。通过磷成像仪分析测量转录物的数量来确定折叠激活，并将这些值与包含相同数量DNA-PK的相应Ad-MLP反应的值进行标准化。
热处理几乎完全消除了UL38Δ+9/DAS的转录，但添加100 ng rhTBP后，加热提取物中的转录增加到高于未处理提取物的水平。在其他未显示的实验中，少量rhTBP对反应的刺激程度较小；加入25ng后，刺激反应的水平基本上与未经处理的提取物相当。
U的转录L（左）38Δ+9/das3，包含DAS内的突变，该突变将启动子活性降低至野生型活性的10%以下(13)，在整个系统中是不活跃的，热处理对检测到的转录水平几乎没有影响。有趣的是，在相同条件下，添加rhTBP可将转录水平提高到含DAS启动子增强水平的30%至50%，并且比该启动子未经处理提取物的转录水平高出两倍。这些结果表明，高水平的TBP可能部分消除DAS在稳定启动前转录复合物中的需求。
然后，我们使用相同的热处理提取物表明，添加通过制备凝胶转移纯化的DBF能够刺激UL（左）38Δ+9/DAS（图。B） ●●●●。在这些实验中，制备凝胶纯化的DBF在非变性条件下洗脱，并通过色谱和超滤进行浓缩。如图所示。B、 将凝胶纯化的DBF添加到热处理的核提取物中，能够将转录增加到与添加限量TBP（25 ng）的加热提取物大致相同的水平。TBP和DBF的添加刺激了未经处理提取物的转录水平。这个结果与我们对图。A、 也就是说，DAS及其相互作用蛋白的功能可能是稳定启动前转录复合物的结合。
接下来，我们进行了一个滴定实验，将越来越多的纯化DNA-PK添加到体外转录反应混合物中。图C显示了一个典型实验的结果，其中UL（左）38Δ+9/DAS和UL（左）以Ad MLP/β-gal作为对照，测试38Δ+9/das3。转录物丰度随着U的DNA-PK数量的增加而增加L（左）38Δ+9/DAS。U没有观察到这种刺激L（左）38Δ+9/das3，Ad MLP/β-gal的转录仅略有增加。
A类顺式-在组织培养细胞的体外转录和重组病毒感染中，特异性结合Ku的作用元件能够在功能上替代DAS。
上述结果与我们的结论完全一致，即DBF与完整的DNA-PK或DNA-PK的DNA结合部分相同。然而，从其他实验室的观察来看，这种解释很复杂，因为该蛋白的DNA-结合异二聚体可以非特异性地结合到DNA末端或DNA缺口(11). 尽管我们的转录分析是使用小型超螺旋DNA模板进行的，但添加的DNA-PK的主要作用仍有可能是通过与刻痕DNA模板结合，然后通过转录因子磷酸化非特异性刺激预引发复合物的形成。对于具有HSV-1U功能结构的启动子，这种影响可能更加明显L（左）38和相关启动子，但也可以解释使用Ad-MLP向体外转录反应中添加DNA-PK时出现的轻微转录激活。
我们通过产生一种重组病毒来研究这种可能性，在这种病毒中，已知与Ku相互作用的DNA结合序列取代了U中的DASL（左）38启动子，并检测其在培养细胞生产性感染过程中对转录的影响。我们选择了糖皮质激素应答的小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列的NRE1，它能够通过Ku的直接结合抑制糖皮质激素诱导的转录(27). 虽然NRE1（−394至−381）的位置与DAS（+20至+33）的位置不同，但存在一些序列相似性（GAGCGGT公司DAS的AG；GAG公司AAAG公司AG代表NRE1）。
我们构建了一个嵌合UL（左）38个启动子，其中NRE1序列插入位置+20和+33之间的DAS；该启动子U的结构L（左）38Δ+9/NRE1，如图所示。A和U的L（左）38Δ+9/DAS和UL（左）38Δ+9/das3启动子。我们进行了体外转录反应以比较该启动子和其他两个UL（左）基于38的启动子和典型数据，如图所示。B证明该元素能够在体外转录中替代DAS。
然后我们产生了一种重组病毒，其中UL（左）将控制细菌β-半乳糖苷酶基因表达的38Δ+9/NRE1启动子插入非必需的gC位点。如许多出版物所述，这是我们分析所感兴趣的启动子的定义修饰影响的标准位置，将野生型启动子插入该区域导致其表达的动力学和水平与其野生型对应物相同(10,14,17). 当前重组病毒和控制病毒的结构如图所示。C、。
Vero细胞的复制培养物分别感染感兴趣的病毒；在感染后2或7小时提取总RNA，并进行引物延伸分析。图中显示了一个具有代表性的实验。D.很明显，NRE1替代DAS不会改变表达动力学，尽管转录水平略高于野生型水平，其效果与体外转录相似。
NRE1和DAS之间保守的核心碱基在Ku与DAS的体外结合中很重要。
NRE1功能替代DAS的能力，而das3突变不能表明DAS和NRE1之间保守的碱基在DBF（DNA-PK）与U的功能结合中很重要L（左）38启动子。为了确定被鉴定为DAS转录功能关键的碱基是否在Ku与DAS的结合中也很重要，我们用部分纯化的DNA-PK进行了缺失接触印迹。
如图所示。A、 在DAS核心内的DNA-PK体外结合中，在上链和下链上发现的几个碱基非常重要。图B总结了这些结果，并列出了先前通过定点突变显示在转录中起作用的碱基变化(13). 通过体外结合DNA-PK测定的DAS结合中重要的碱基（最显著的是+25的鸟嘌呤残基）在组织培养细胞重组病毒感染中DAS介导的转录激活中也很重要。
用亲和纯化DBF（DNA-PK）对DAS进行缺失-压缩足迹分析。（A） 在限制条件下，用甲酸（G+A反应）或肼（T+C反应）对单标记探针Upper（正）或Lower（反）进行修饰，并用于凝胶转移反应。分离与DBF-结合（B）DAS或游离（F）DAS探针对应的凝胶区域，用哌啶切割，并在12%测序凝胶上进行分析。修饰后不能支持DNA-PK结合的碱（•）和修饰后显示DNA-PK-结合有所减少的碱（○）。（B） A组缺失的对照数据摘要。DAS中的突变已被证明影响UL（左）38还显示了组织培养细胞的重组病毒感染中的转录。
Ku的70-kDa亚单位与DAS结合。
虽然holo-DNA-PKcs的大小使其无法包含在用于表征DBF的含SDS的聚丙烯酰胺凝胶上，但DNA-结合Ku异二聚体的两个亚单位通常以近似相等的浓度进行纯化（图。C） ●●●●。用DAS亲和纯化的DBF（DNA-PK）进行UV交联实验，以阐明与DAS结合的亚单位。如图所示。A、 与70-kDa亚基相对应的条带明显，代表Ku的70-kDa亚基。由于与少量未标记的DAS DNA竞争，这种结合似乎是动态的（图。B） 能够有效减少交联蛋白的数量。
Ku的70-kDa亚单位与DAS结合并以可逆方式结合。（A） 亲和纯化DBF与DAS的UV交联。分子质量标记的大小以千道尔顿表示。（B） Ku p70与DAS的结合是可逆的。DAS亲和纯化的DNA-PK在存在越来越多未标记DAS DNA的情况下进行UV交联。竞争对手与标记的DAS探针（1 ng）同时添加。如文中所述，低带（约35kDa）是Ku的70-kDa亚基的分解产物。
虽然我们在本次交流中报告的DBF是DNA-PK的证明与我们早期关于UL（左）38启动子、DAS和DBF，有一个不一致。我们之前报道了用普通提取物进行的紫外线交联研究，表明DBF的DNA结合成分是一种35-kDa细胞蛋白，而我们目前的结论是Ku的70-kDa-亚基起到了这一作用(13). 为了调和这些观察结果，我们在交联研究中调查了提取物的年龄对结合产物大小的作用。我们一致发现，制备凝胶纯化的DNA-PK的反复冻融导致出现35-kDa条带（图。B） ●●●●。当使用在−70°C下储存相对较长时间的核提取物时，该条带的相对数量显著增加。我们认为这些观察结果反映了Ku的70-kDa亚基的初始分解产物；需要注意的是，该产物的结合对DAS也具有特异性，因为增加未标记的DAS寡核苷酸的数量可以有效降低交联产物中的放射性量。
讨论
严格的晚UL（左）38启动子是三部分的：一个位于−31的TATA盒、一个一致的Inr元件和位于+20到+33的DAS都是野生型转录水平所必需的。由于其独特的位置和在其他几个严格的HSV-1晚期启动子中的明显保守性，DAS似乎是一类晚期启动子的重要特征。在这里，我们试图进一步表征DAS和细胞蛋白之间的相互作用，我们之前报道过这些相互作用，统称为DBF。同样，我们之前已经表明，DBF与DAS的序列特异性结合靶向相同的核苷酸，这些核苷酸被证明是通过特异性诱变进行转录激活的关键(13).
DBF标识为DNA-PK，而不是TFIID的成分。
我们最初推测DAS可能通过TBP-相关因子（TAF）的一种或另一种结合与TFIID直接相互作用。这个想法是基于DAS相对于转录起始点的位置，因为TFIID复合体在几个启动子上的足迹约为+30(35,45). 直接相互作用的可能性也由几个果蝇属TATA-less启动子，包含与DAS位置类似的保守下游启动子元件（DPE）(1,2). 众所周知，DPE与多个果蝇属TAF，包括dTAF二60; 然而，其序列与U序列几乎没有相似之处L（左）38 DAS（DPE核心序列，[G/A]G[A/T]CGTG；DAS核心序列，GAGCGGTAG）。
尽管这些例子通过TFIID与转录起始位点下游的序列相互作用为转录激活提供了充分的优先权，但本文报道的数据表明，DBF不是TFIID的成分或基础转录因子；相反，它是DNA-PK。最初，我们通过P11磷酸纤维素色谱分离HeLa核提取物（图。)，这是将基础转录因子分离为不同组分的标准方法(5). DBF活性在0.3 M KCl下持续分馏(5).
一旦确定DBF是一种不同于基础转录因子的蛋白质，我们就开始使用常规色谱和DAS DNA亲和技术对其进行纯化。我们的最终结论是，DBF是DNA-PK，这是基于纯化DBF的胰蛋白酶肽图谱，该图谱鉴定了DNA-PK-的DNA结合成分，也称为Ku，以及DNA-PK抗体与DBF特异反应的证明。
对于DBF的净化，如图所示。，我们使用竞争性凝胶位移分析（图。). 为了在此类分析中选择竞争对手，我们利用了UL（左）含有das3突变转化（−18）CCGGA的38启动子GCGG公司TAGCC（−31）至（−18）CCGGA美国汽车协会TAGCC（−31）的转录活性约为野生型的10倍。此外，在凝胶转移实验中，含有das3突变的DNA无法有效竞争与DAS结合的蛋白质。
DNA-PK能够刺激UL（左）38体内外转录。
Ku经常被误认为是序列特异性DNA结合蛋白(8,28,36)由于其对DNA末端的高度亲和力以及将DNA转移到内部停顿位点的能力(21). 如图所示。和，Ku对U的绑定L（左）38Δ+9/DAS是动态的，因为添加了越来越多的未标记的相同序列，即使存在大量（5000倍）过量的非特异性DNA，也会降低可检测的DNA-蛋白质复合物。此外，图中显示了遗漏-压缩足迹实验的结果。证明Ku与我们之前报道的转录数据相关的碱基特异性接触(13).
这里报告的数据清楚地表明，DNA-PK特异性激活UL（左）38启动子通过DAS介导的效应。我们在体外转录反应中使用超螺旋DNA模板的实验表明，在热处理和未处理的核提取物中添加DNA-PK会导致UL（左）产生了38个转录物。正如预期的转录激活物（如图。)，增加DNA-PK的数量会导致生成的转录物数量增加。这种激活依赖于DAS的存在，因为含有das3突变的启动子和另一个缺乏DAS的启动子（Ad MLP）对添加DNA-PK没有类似的反应（图。C） ●●●●。
修饰U的研究证实了DNA-PK转录激活的特异性L（左）体内有38个启动子。糖皮质激素应答的小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列包含上游顺式-作用元件NRE1，与DAS具有显著的序列相似性，能够在糖皮质激素诱导下抑制转录(27). 使用含有NRE1的闭合环状DNA的实验证明Ku直接与该元素结合(9). 如图所示。，NRE1有效替代U中的DASL（左）38启动子。
DNA-PK介导的U转录激活模型L（左）38
DNA-PK具有无数明确的细胞功能，包括在DNA修复、细胞周期调节、重组和转录中的作用(21). 它在转录调控中的作用发生在几个层次。激活后，需要Ku与DNA结合，DNA-PK会自动磷酸化，导致DNA-PKcs与Ku分离。催化亚单位随后能够磷酸化目标蛋白，包括范围广泛的转录因子，如Sp1和p53，以调节其活性(19,38). 在这一激活事件之后，Ku仍然与DNA结合，以与其他DNA-PKcs分子相互作用或发挥其他功能。例如，已知它与RNA聚合酶II复合物有关，并可能参与聚合酶启动转录(23). 除了DNA结合外，Ku的70-kDa亚单位还具有解旋酶活性，DNA以ATP依赖的方式进行的局部解链可能有助于转录的启动(32).
基于我们提供的实验证据，可以提出几个关于DNA-PK在激活含DAS的HSV启动子中的作用的非独占模型：（i）Ku对DAS的直接识别可能导致DNA的局部解旋，通过Ku的70-kDa亚单位的活性促进转录的启动；（ii）Ku对DAS的直接识别可以通过蛋白质相互作用稳定TFIID等基础转录因子的结合；（iii）DNA-PK对细胞转录机制和转录因子的磷酸化可以激活UL（左）38转录。虽然我们的结果最有力地支持前两个模型，但我们不能排除DNA-PK的一种转录效应是通过磷酸化事件的可能性。我们不赞成这种模型，因为其他人的实验观察表明，DNA-PK磷酸化抑制转录因子的作用(21).
无论DNA-PK在HSV晚期转录中的确切作用如何，该细胞蛋白在HSV感染组织培养细胞期间被修饰是非常重要的。在生产性感染期间，由于病毒DNA复制前ICP0介导的作用，激酶活性和DNA-PKcs的丰度都大大降低，而Ku水平保持不变(22). 这一作用可能与ICP0早期定位于离散核结构（ND10）有关，其扩散发生在DNA-PK活性下调的同时。这种早期定位可能会影响这种即时早期蛋白增强晚期转录功能的时间。显然需要进一步研究，以阐明这些观察在HSV-1复制周期中的重要性。
虽然很容易推测DNA-PKcs活性的丧失在从早期基因表达转换到晚期基因表达中很重要，我们使用未感染的核提取物进行的体外转录实验以及我们在核提取物中添加外源DNA-PK的实验表明，整个蛋白复合物的存在会激活转录。这一观察结果可能与以下事实有关：HSV生命周期中的ICP0并非绝对必需，但可以通过高多重感染和在某些细胞生长条件下消除(三). 我们目前正在探索DNA-PK异二聚体的Ku部分是否能够单独支持U的转录激活L（左）38
