乳头状瘤病毒是一种小型环状双链DNA病毒，可引起上皮损伤。在已知的70多种人类乳头瘤病毒（HPV）中，与肛门生殖器病变相关的HPV根据其相关病变保持发育不良但良性的相对趋势被分为两大类（称为低风险HPV）或进展为高度上皮内瘤变和侵袭性恶性肿瘤（高危HPV）。至少90%的人类宫颈癌包含高危HPV亚型（即HPV-16、HPV-18、HPV-31或HPV-33）的病毒序列。在高危HPV中，HPV-16是主要的亚型，在50-70%的人类宫颈癌中发现(48). 我们的实验室将HPV-16作为研究乳头瘤病毒致癌和病毒发病机制相关功能的一个特别重要的靶点。
乳头瘤病毒，如猿病毒40（SV40），已成为研究哺乳动物DNA复制的模型系统。体外复制研究表明，乳头瘤病毒和SV40在利用包括DNA聚合酶α引物酶在内的许多细胞复制蛋白方面彼此相似(4,30)、DNA聚合酶δ、RPA、PCNA和拓扑异构酶(18,26,29,43)虽然乳头瘤病毒DNA复制可能还需要一些额外的细胞因子(26). 启动乳头瘤病毒DNA复制需要两种病毒编码蛋白E1和E2(40). 乳头瘤病毒E1蛋白是启动病毒DNA复制的复制酶。各种乳头瘤病毒编码的E1蛋白具有很好的保守性，并且与SV40的大T抗原复制蛋白具有显著的同源性(8,23). 乳头瘤病毒E1蛋白和SV40大T抗原在各自的复制来源中都与二元对称区域结合(14,15,27,41)并具有ATP依赖的DNA解旋酶活性(16,17,36,37,44). 然而，与T抗原依赖性SV40复制相比，对乳头瘤病毒复制中涉及的生化事件和细胞活动知之甚少。
与SV40大T抗原不同，E1不会自主结合病毒复制源。相反，乳头瘤病毒E2蛋白需要作为E1与来源结合的辅因子(三,28,32). 乳头瘤病毒E2蛋白由两个功能域组成：氨基末端转录激活域和作为二聚体结合到ACCN的羧基末端DNA结合域6GGT识别序列(2,24,25). E2的这些结构域被一个不太保守、不必要的铰链区域分隔开。E2的氨基末端结构域在病毒生命周期中具有两种功能，既作为病毒基因表达的转录调节因子，又作为E1相互作用结构域，该结构域是将E1复制蛋白募集到乳头瘤病毒复制起源所需的。E2结合位点位于复制起点的侧面。E2通过与这些位点结合并与E1相互作用，将E1导向乳头瘤病毒复制源(11,21,22,34–36,39,43). 这种相互作用被认为有助于E1识别病毒复制起源，随后组装复制起始复合物，包括DNA聚合酶α启动酶的招募(4,30)，对瞬时转染分析中病毒DNA的高效复制至关重要(31,32).
这里的结果表明，我们已经实现了HPV-16 DNA的体外复制。这种复制模拟了瞬时体内复制试验中的情况，因为它需要E2与E1的相互作用(31,32). 此外，我们证明了来源于HPV-16 E2氨基末端的23或15氨基酸肽能够破坏E1和E2之间的相互作用以及体外乳头瘤病毒DNA复制。在这些分析中，这种肽作为功能抑制剂的活性有几个含义：（i）它识别了E2的一个离散区域，该区域对于与E1的特定相互作用是必要的和充分的，（ii）它证明了一个相对较小的分子可以用来抑制E1-E2相互作用和乳头瘤病毒DNA复制的概念，（iii）它为设计或发现能够抑制乳头瘤病毒DNA复制的生物活性分子提供了起点，以及（iv）它提供了一种试剂，可以促进对导致乳头瘤病毒DNA复制起始复合物逐步组装的动态过程的功能性切割。这些观察结果可能有助于识别抑制HPV DNA复制的有效生物活性抗病毒化合物。
材料和方法
HPV E1和E2蛋白的杆状病毒表达。
安Nco公司我-Sma公司pUC-E1的I片段16(9)使用T4聚合酶使含有HPV-16E1蛋白编码区的细胞变钝，并插入钝端巴姆pBS-EE的HI位点产生pBS-EE-E116.[pBS-EE是通过克隆Xba公司我-巴姆编码多瘤病毒中间T抗原EE表位的HI片段(18)从pUC-EE到pBluescript-SK（+）（Stratagene）。]这个生态RI公司-不是pBS-EE-E1的I片段16重新加入pVL1392杆状病毒转移载体（Pharmingen）。HPV-16 E2和HPV-16 E_2 E39A被克隆为巴姆HI（高）-生态RI片段进入pVL1392。
表达HPV-11 EE-E1和HPV-11 E2的重组杆状病毒由Louise Chow慷慨提供。以每细胞5到10个PFU的倍数感染Hi-F5细胞，并在27°C下培养48小时。将细胞刮入冰镇磷酸盐缓冲液中，在Sorval RT6000D台式离心机中以1000 rpm离心造粒5分钟，在冰镇磷酸盐盐水中清洗一次，然后将其排净。然后将细胞颗粒重新悬浮在含有10 mM HEPES-K的低渗缓冲液（缓冲液A）中+（pH值7.5），10 mM KCl，1.5 mM MgCl2、0.5 mM二硫苏糖醇（DTT）和蛋白酶抑制剂混合物（PIC；1 mM苯甲基磺酰氟、10-μg/ml抑肽酶、10-µg/ml亮氨酸肽、10-¦Μg/ml胃蛋白酶抑制素A、10-Μg/ml菲咯啉、16-¦¦¤g/ml苯甲脒）。如前所述将细胞沉淀，重悬于含有0.5%Nonidet P-40（NP-40）的缓冲液A中，并在冰上孵育10分钟。然后在Sorvall台式微型离心机（3000rpm）中在4°C下旋转裂解物。去除细胞质提取物上清液，并添加等量的50%（vol/vol）甘油。裂解液在干冰上快速冷冻，并在使用前储存在−70°C。将核芯块在不含NP-40的缓冲液A中清洗一次，再悬浮在缓冲液C（20 mM HEPES-K）中+[pH值7.9]，429 mM氯化钠，1.5 mM氯化镁2，0.2 mM EDTA，25%[vol/vol]甘油，含PIC的0.5 mM DTT），在冰上培养30至40分钟，间歇涡流。在4°C下，在索瓦尔微型离心机中全速离心澄清10分钟后，将核提取物快速冷冻在干冰上，并在−70°C下储存，直至使用。
体外HPV E1-E2结合试验。
将来自表达HPV-16或HPV-11 EE-E1的重组杆状病毒感染的细胞核提取物的蛋白质（300至500 ng）和来自表达HPV E2杆状病毒的细胞核萃取物的80至120 ng蛋白质在500μl NET-gel缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.5]，150 mM NaCl，0.1%NP-40，1 mM EDTA，0.25%明胶）中在4°C下培养1 h。添加抗-EE单克隆抗体（1至2μg），将混合物在4°C下摇晃培养1 h。用蛋白g-琼脂糖珠沉淀免疫复合物，并用冰镇NET-gel缓冲液洗涤两次30 min。用适当的一级抗体和抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶或抗小鼠免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶（Amersham）通过蛋白质印迹检测沉淀的蛋白质。在含有4%（wt/vol）干乳的TNET（10 mM Tris[PH7.5]，2.5 mM EDTA，50 mM NaCl，0.1%吐温20）中封闭膜1小时。在TNET中进行洗涤和抗体反应，通过化学发光（Renaissance ECL；NEN）和放射自显影术观察蛋白质。使用NIH图像程序对色带进行量化。
HPV EE-E1和E2蛋白的纯化。
将含有EE-E1的杆状病毒感染细胞核提取物（总蛋白3-5 mg）（含1%NP-40）通过单Q柱（Econo-Pac Q筒，Bio-Read编号732-0025）。用200μl抗EE单克隆抗体在4°C下孵育流动性1小时，该单克隆抗体已共价交联到蛋白G-Sepharose珠。通过离心法造粒小球，并用800μl（1%）NP-40裂解缓冲液和PIC洗涤一次。然后用800μl高盐缓冲液（20 mM Tris[pH7.0]，0.5 M NaCl，0.5 mM DTT，0.1%NP-40，PIC）在4°C下清洗珠子三次，每次10分钟，然后用800微升磷酸钠缓冲液（10 mM NaPO）清洗三次10分钟4【pH 8.0】，0.5 mM DTT，0.1%NP-40，PIC）。在100 mM三乙胺（pH 11.5）中从丸粒中洗脱EE-E1。在4°C下通过离心将珠粒化，并在4°C下将上清液与1升透析缓冲液（HEPES-K）透析3小时+[pH值7.5]，1 mM DTT，10%甘油，150 mM NaCl）。然后更换透析缓冲液，并在4°C下持续透析过夜。该程序每μl产生约100至150 ng EE-E1（纯度>95%）。将20微升的纯化EE-E1等分试样在干冰上快速冷冻，并在−70°C下储存直至使用。
将缓冲液C（3 mg/ml）中含有E2的杆状病毒感染细胞核提取物在4°C下应用于Econo-Pac肝素柱滤筒（生物试剂号732-0075）。在用含有PIC的5个柱体积的缓冲液C以1 ml/min的流速洗涤后，E2在含有0.7 M NaCl的5个柱子体积的缓冲溶液C中洗脱，并收集0.5 ml的柱馏分。含有E2的组分通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的考马斯染色法测定，电泳凝胶中装载了等分洗脱组分。该程序产生每微升300至500纳克E2，在使用前储存在−70°C。
体外复制反应。
体外复制反应的制备基本上如Kuo等人所述(18)，在37°C的25μl反应混合物中放置不同时间。标准反应持续2小时，并通过添加200μl停止溶液（20 mM Tris-HCl[pH7.5]，10 mM EDTA，0.1%十二烷基硫酸钠，20μg/ml RNase A）终止。在37°C下孵育15分钟后，添加蛋白酶K（200μg/ml）并继续孵育30分钟。用250μl酚氯异戊醇（25:24:1）提取样品，乙醇沉淀，用70%乙醇洗涤，干燥，再悬浮在20至30μl TE（10 mM Tris[PH8.0]，1 mM EDTA）中，并在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。琼脂糖凝胶在Hybond N上干燥+通过放射自显影术观察细胞膜（Amersham）和复制的DNA。通过PhosphorImager分析对谱带进行定量。复制模板为pKS7838-7905（核苷酸7838至7905和1至130），其中包含HPV-16复制源，pUC7874-99中包含HPV-11复制源（核苷酸7874至7933和1至99）。pUC7874-99由Louise Chow慷慨提供。
结果
HPV-16 DNA的体外复制。
瞬时复制试验表明，HPV-16 E1和E2之间的相互作用是在体内高效复制源依赖性乳头状瘤病毒所必需的(31). E2刺激牛乳头瘤病毒（BPV）和HPV-11复制在体内已被证实(9,19,38,40)和体外试验(18,19,43). 我们试图建立一个体外研究HPV-16 DNA复制的系统，并确定HPV-16 E1和E2之间的特异性相互作用是否是该系统中HPV-16基因复制所必需的。图。A显示了使用293细胞提取物、部分纯化的HPV-16 E2和增加亲和纯化的HPV-16 EE-E1在体外复制HPV-16原始质粒。如其他乳头瘤病毒E1蛋白的文献所述，当在没有E2的情况下使用相对大量的E1时，观察到一些复制现象（通道2至7）(5,6,16,22,33,40,48). 添加6ng E2极大地刺激了体外复制（泳道8-13），而在没有EE-E1的情况下没有观察到复制（泳道1）。该试验中的复制依赖于来源，因为在高浓度EE-E1中检测到缺乏HPV-16来源的pKS质粒的少量复制（图。B、 车道1至6）没有受到E2的刺激（图。B、 车道7至12）。这些结果的定量如图所示。C、。
E2在体外刺激HPV-16的复制。（A） 通过使用293细胞提取物和在存在或不存在HPV-16 E2的情况下增加EE-16E1（10至50 ng）的数量，复制HPV-16原始质粒p16ori，即含有HPV-16基因组序列（7838-139）的Bluescript KS+质粒。车道1中的反应混合物不含HPV-16 E1或E2。复制中间产物（R.I.）和I型和II型DNA的位置与Kuo等人观察到的类似(18)显示。（B） 体外HPV-16 DNA复制依赖于来源。显示了在与面板A所述条件相同的条件下，不包含HPV-16起源序列的Bluescript KS+的复制。（C） 面板A和B中显示的复制实验的磷光成像仪定量。
E1相互作用是体外E2刺激HPV-16复制所必需的。
我们之前已经证明，用丙氨酸替代HPV-16 E2（E39A）氨基酸残基39处的保守谷氨酸残基，会在瞬时共转染分析中破坏HPV-16 E1相互作用和瞬时HPV-16 DNA复制。然而，E39A完全可以作为转录激活物(31). 为了测试这种突变E2蛋白支持HPV-16 DNA体外复制的能力，在20 ng EE-E1存在下，测试了增加数量的野生型HPV-16 E2或E39A HPV-16 E_2突变蛋白的体外复制活性（图。A） ●●●●。野生型E2以剂量反应的方式极大地刺激了体外复制，而HPV-16 E2的E39A突变株（不与E1相互作用）即使在相对较高的浓度下也只有轻微的刺激作用。这一结果证明了E2氨基末端介导的与E1相互作用在体外复制中的依赖性。这些结果的定量如图所示。B。
E2氨基末端与E1的相互作用是HPV-16 DNA体外复制所必需的。（A） p16ori（40 ng）的复制是在293细胞提取物、20 ng EE-E1和野生型HPV-16 E2（2至9道）或E1相互作用缺陷型E39A HPV-16 E_2（10至16道）数量增加的情况下测定的。（B） 磷光成像仪定量复制实验如面板A所示。
体外抑制HPV-16 E1和E2之间的相互作用。
上述结果表明，HPV-16 E2的包括E39残基的区域可能包含足以与E1相互作用的结构域。因此，我们推断，包含HPV-16 E2这一结构域的肽可能会抑制HPV-16 E1和E2之间的相互作用，从而抑制HPV-16DNA复制（图。). 为了测试这种可能性，使用杆状病毒载体分别表达了HPV-16 E2和表位标记的全长HPV-16 E1（EE16-E1）蛋白。使用抗EE表位单克隆抗体免疫沉淀EE-E1和相关E2蛋白。用HPV-16 E2 DNA结合域的多克隆抗血清进行Western blotting检测沉淀E2(35). 如图的车道2所示。A、 E2与EE16-E1共免疫沉淀，但在不存在EE16-E的情况下没有被EE表位抗体沉淀（通道1）。然后，测试包含HPV-16 E2氨基酸29至51（E2N-WP23）或HPV-16 E_2残基33至47（E2N-WP15）的肽是否抑制E1-E2相互作用。这些肽序列源自HPV-16 E2序列，基于乳头瘤病毒E2蛋白中保守的氨基末端残基的比对（图。). 图3至9车道。A（顶部）显示E2N-WP23肽浓度增加的抑制作用。较小的E2N-WP15肽对E1-E2相互作用表现出类似的抑制作用（图。A、 底部，车道3至9）。由于E39A复制缺陷型HPV-16 E2突变体仅与EE16-E1轻微结合（第14道），因此HPV-16 E_2蛋白本身和E2衍生肽在这些分析中都具有特异性。此外，含有类似于HPV-16 E2 E39A突变体的氨基酸取代的23-mer和15-mer肽在野生型肽能够抑制E1-E2相互作用的浓度下（通道10至13）没有抑制E1-E1相互作用。这些肽分别命名为E2N-MP23和E2N-MP15（图。). 这些结果的定量如图所示。B.50%抑制浓度（IC50)E2N-WP23和E2N-WP15对E1-E2相互作用的抑制作用分别为5和7.5μM。此外，当将肽对E1-E2相互作用的抑制绘制为底物浓度的函数时，该分析表明E2N-WP23和E2N-WP15肽通过竞争抑制发挥作用（数据未显示）。我们之前已经证明，HPV-16 E1羧基末端的跨氨基酸421-647的结构域对于E2相互作用是必要的和充分的(45). 在类似实验中也观察到E1-E2相互作用的特异性和可比性抑制，该实验检测了这些肽抑制HPV-16 E2蛋白和表位标记的HPV-16 E1 C末端（氨基酸421-647；数据未显示）之间相互作用的能力。
基于E2氨基末端保守残基衍生候选HPV-16 E1-E1相互作用抑制肽。突变研究确定HPV-16 E2的残基E39对与E1的相互作用至关重要。（A） 其他乳头瘤病毒E2蛋白保守近端序列的比对。下文A组（B组）显示了从HPV-16 E2的这一部分衍生的合成肽的推导一致序列。WP肽在与HPV-16 E2的E39类似的位置保留保守的谷氨酸，而MP肽在该位置包含取代的丙氨酸。
来自HPV-16 E2氨基末端的肽抑制HPV-16 E1和E2之间的体外相互作用。（A） 表位标记的HPV-16 E1（EE-E1）和HPV-16 E2在NET-gel缓冲液中孵育，23-mer（E2N-WP23；顶部，第2至9道）和15-mer（E2N-WP15；底部，第2到9道）的浓度增加。用抗EE表位单克隆抗体免疫沉淀法测定EE-E1与E2的结合，用抗HPV-16 E2C血清检测E2(31). 通过用识别HPV-16 E1的多克隆抗血清检测相同的印迹，确认每个反应中E1的沉淀。增加E2N-MP23（顶部）和E2N-MP15（底部）肽在第10至13条通道中的使用量。通道14代表HPV-16 E39A突变蛋白和EE-E1之间观察到的相互作用水平。输入野生型HPV-16 E2和E39A突变体HPV-16 E2蛋白显示在泳道15和16中。（B） 磷光成像仪定量面板A所示实验中的E2反应带。
由于E2N-WP23和E2N-WP15肽可以抑制HPV-6 E1和E2之间的相互作用，因此还测试了它们抑制体外HPV-16 DNA复制的能力（图。A和B）。图C显示了几个独立实验的汇编定量结果。野生型肽的23-mer和15-mer形式都能有效抑制体外复制。E2N-MP23和E2N-MP15的抑制作用也作为特异性对照进行了测试。每种野生型肽都比各自的E39A取代的类似物更有效地抑制复制，这一结果与HPV-16 E2的E39残基在E1相互作用中的重要性一致。肽的复制抑制效应是E1-E2相互作用抑制的结果，因为肽对仅用E1观察到的低水平复制没有影响（数据未显示）。来自E2N-WP15内序列的较小肽在体外并未抑制HPV-16 E1-E2的相互作用或复制（数据未显示）。
来自HPV-16 E2氨基末端的肽在体外抑制HPV-16的复制。（A和B）在E2N-WP23（A）或E2N-WP15（B）含量增加的情况下，使用40 ng EE-E1和6 ng HPV-16 E2测定HPV-16 DNA复制的体外抑制。阴性对照组包括仅含有293个细胞提取物和p16ori的反应混合物（面板A和B中的1号通道）、不含E2的EE-E1（面板A与B中的2号通道），或含有增加浓度的E2N-WP23和E2N-WP15的完整复制反应混合物（板A和B，11至14号通道）。（C） 磷光成像仪对面板A和B中显示的复制实验进行定量。在没有抑制肽的情况下，相对于通道3中的复制量，复制量以对数形式绘制，作为肽浓度的函数。
肽对体外E1-E2相互作用和复制的抑制并不限于HPV-16。
对于参与分子间识别和结合的乳头瘤病毒E1和E2蛋白中结构域的物理性质知之甚少。在抑制HPV-16 E1-E2相互作用的HPV16-E2衍生的15-氨基酸最小肽序列中，有7个非常保守的残基(W公司-X-X-M/V/I公司-R（右）-X（X）-E类-X-X-输入/输出-X-X-X-X-A类-R（右）)（另请参见图。). 我们推断，如果这些残基充分代表一个保守的E1相互作用域，HPV-16 E2衍生肽也可能抑制其他HPV E1和E2蛋白之间的相互作用。因此，我们使用HPV-11 E1和E2蛋白测试了E2N-WP15肽的抑制作用。检测表位标记的HPV-11（HPV-11 EE-E1）和HPV-16 E1（HPV-16 EE-E1。还评估了E2N-WP15肽对这些相互作用的影响。如图所示。A、 E2N-WP15有效地抑制了HPV-11 E1和HPV-16 E2之间的相互作用（10到13道），以及HPV-11 EI-E2与IC之间的相互影响（20到24道）50约10μM。E2N-WP15肽也抑制了HPV-11 E1和E2之间的相互作用，尽管这种作用比使用其他E1和E_2组合时观察到的作用弱。（我们估计IC50这种抑制作用约为20μM。）与HPV-16 E2和HPV-16 E1之间的相互作用一样，HPV-16 E_2 E39A突变株不与HPV-11 E1结合（通道8和16）。E2N-MP15肽不抑制HPV-11 E1-E2相互作用或HPV-11 E2和HPV-16 E2之间的相互作用。这表明，与HPV-16 E1中的天然对应物相互作用的HPV-16 E2的结构域也可以与HPV-11 E1特异性相互作用。未观察到HPV-16 E1和HPV-11 E2之间的相互作用（数据未显示）。这与HPV-16 E1和HPV-11 E2在共转染分析中不能支持瞬时复制一致(47). 因此，尽管E1-E2相互作用的许多元素在HPV亚型中是保守的，但这些相互作用并不完全可互换。进一步研究这种非互易功能的性质可能会揭示E1-E2相互作用特异性的重要决定因素。
E2N-WP15抑制E1-E2相互作用和HPV-11的体外DNA复制。（A） 比较了HPV-16 E1和HPV-16 E2（1至8道）、HPV-11 E1和HPV-16 E_2（9至18道）以及HPV-11 E_1和HPV-11 E2（19至26道）之间E1-E2相互作用的抑制。用抗EE表位单克隆抗体沉淀表位标记的E1蛋白，用抗E2血清进行Western blotting检测相关E2蛋白。含有EE-E1且不含E2的阴性对照反应显示在车道1、9和19中。泳道1至16中使用的输入HPV-16 E2和E39A的量显示在泳道17和18中。HPV-11 E2实验（19至25车道）中使用的E2输入量如26车道所示。（B） 在存在或不存在6 ng HPV-16 E2的情况下，使用更多纯化的HPV-11 EE-E1体外复制HPV-11起源质粒p11ori（7874-99）。通道1中的反应混合物不含HPV蛋白。（C） 使用HPV-11 EE-E1和HPV-16 E2测试E2N-WP15抑制HPV-11来源体外复制的能力（通道4至8）。还测定了等效浓度的E2N-MP15肽的影响（通道9至11）。通道1至3不含HPV蛋白。
还测试了E2N-WP15肽抑制HPV-11 E1介导的体外复制的能力。如图所示。B（1至9道），HPV-11 E1可与HPV-16 E2协同支持含有HPV-11来源的质粒的剂量反应性体外复制。（这些蛋白质也在HPV-16起源的复制中发挥作用，但效率低于HPV-11起源的复制；数据未显示。）E2N-WP15肽抑制HPV-16 E2–HPV-11 E1来源的依赖性复制，其效果与抑制HPV-16E1-E2介导的体外复制大致相同（图。B、 11至16车道）。在这些分析中，E39A HPV-16 E2突变体对复制只有轻微影响（17到19道）。因此，抑制肽对体外复制的影响反映了E1-E2相互作用试验中观察到的结果。
E1-E2相互作用的动力学。
关于乳头瘤病毒E1和E2蛋白在复制起始点的有序组装以及复制起始复合物的形成，人们知之甚少。已观察到两种类型的BPV E1-E2起源复合物。一个复合体包含BPV E1和E2(22,34); 另一种复合物只含有E1，它在DNA周围形成寡聚环(33). 虽然在没有E2的情况下，后一种复合物可以在高E1浓度下形成(22,34)，E2刺激寡聚E1复合物的组装。
作为检测HPV-16 DNA复制中复制因子组装的初步步骤，我们进行了实验以确定E1-E2复合物形成的时间。在这些实验中，在添加E2蛋白和抑制肽之前，EE-E1与EE表位抗体和蛋白G珠预先结合。如图所示。，HPV-16 E1-E2复合物快速形成；约3min后，结合反应完成50%，10min内达到饱和稳定状态（2～7车道）。我们还试图利用E2N-WP15肽来研究E1-E2结合反应本身，方法是在E1-E2反应开始后的不同时间添加肽（最终浓度为50μM）。在5分钟时添加肽会显著抑制随后的E1-E2相互作用，但在10分钟后添加肽对E1-E2交互作用几乎没有影响。我们将其解释为HPV-16 E1和E2之间的复合物形成是快速的，并且E2N-WP15抑制该复合物的形成，但在其形成后的结合反应中对E1-E2复合物没有影响。
体外结合试验中HPV-16 EE-E1和E2之间的相互作用动力学。体外E1-E2结合试验在指定的时间内进行（2至7道），E1-E2复合物通过抗EE单克隆抗体免疫沉淀法测定，然后用抗血清免疫印迹法测定HPV-16 E2的C末端。在平行反应中，E2N-WP15肽（最终浓度为50μM）在指定的时间（通道8至12）添加到E1-E2结合反应混合物中，当按照图所示确定EE-E1和E2之间的结合时，反应在60分钟结束后继续进行。答：。
讨论
乳头瘤病毒E1和E2蛋白执行病毒DNA复制所必需的关键步骤：在复制起点组装复制起始复合体。这一过程需要E2氨基末端与E1蛋白的特异性相互作用。乳头瘤病毒的复制在其他方面依赖于宿主细胞聚合酶和宿主细胞复制机制的其他成分。关于这种复制起始复合物的形成和组成，或随后的伸长和终止的开始，我们知之甚少。对乳头瘤病毒DNA复制的调控和协调有了更深入的了解，将有助于我们进一步了解哺乳动物细胞DNA复制的基本机制以及乳头瘤病毒进行DNA复制的具体方式。
我们已经绘制了HPV-16E1蛋白内的许多病毒DNA复制相关活性(45). HPV-16 E1的E2相互作用域位于羧基末端223个氨基酸（氨基酸421到647）内，该区域还包括ATP-结合域。在双杂交分析中，该区域也能够与其他E1分子相互作用(46). HPV-16 E1这个域中的许多错义突变同时破坏了多种E1活性，包括瞬时复制、E1-E1关联、E1-E2复合物的形成、ATP酶活性以及E1在双杂交分析中与细胞蛋白相互作用的能力。许多HPV-16 E1突变的多效性效应使我们推测，这些E1功能紧密聚集或功能相互依赖(46).
BPV 1型（BPV-1）E2氨基末端的初始缺失图谱研究确定了转录激活和病毒DNA复制所必需的结构域(24,42)但未能区分这两个E2功能。BPV E2保守氨基末端的非重叠缺失（例如，Δ1-15、Δ92-161和Δ195-282）破坏了转录激活和复制功能。这些结果表明，E2转录激活和复制功能在氨基末端的扩展域内共存，或者这种缺失突变导致氨基末端内多个功能部分的同时破坏。
最近对采用丙氨酸替代突变的HPV-16 E2和BPV-1 E2氨基末端结构域的研究成功分离了E2氨基终端复制和转录激活功能。HPV-16 E2第39位保守的谷氨酸残基突变为丙氨酸，特异性地消除了其刺激暂时性乳头瘤病毒复制的能力。该突变体不再与E1相互作用，但擅长转录激活。或者，用丙氨酸替换HPV-16 E2第73位的保守异亮氨酸可以消除转录激活，但对E1相互作用和DNA复制没有影响(31). 类似的定向突变研究将这些结果扩展到了BPV E2(1,6,7,10). 基于酵母中BPV E2转录激活的基因筛查已鉴定出其他E2突变体，这些突变体已丧失其中一种或两种功能(6,13).
这些研究提供了令人信服的证据，证明乳头瘤病毒E2氨基末端由至少两个可分离的功能结构域组成：一个结构域由异亮氨酸73定义，是转录激活所需的，另一个结构域由39位的谷氨酸残基定义，这是E1交互和复制所必需的。从这个意义上说，值得注意的是，上述破坏转录激活和复制的BPV E2缺失突变体既没有重叠E39结构域，也没有重叠I73结构域。事实上，即使是散布在E2的前200个氨基酸中的错义突变也能够消除其中一个或两个功能(1,6,13,31,42). 因此，尽管E2氨基末端的转录激活和复制功能在功能上是独立的，但当从正常环境中移除时，这些各自功能所需的结构域不一定保持其功能完整性。此外，在我们对HPV-16 E2的定位研究中，我们将包含氨基酸1至190的结构域定义为在双杂交分析中能够与HPV-16 E1相互作用的最小结构域(45). 由于这些原因，还不确定来源于HPV-16 E2的E39区域的肽是否能够与完整的E2蛋白竞争与HPV-16 E1羧基末端的特异性相互作用。在本研究中，我们证明了一种来源于HPV-16 E2氨基末端并以E39为中心的15-氨基酸肽能够在体外抑制HPV-16 E1-E2相互作用和乳头瘤病毒复制。这种抑制是特异性的，因为在第39位含有丙氨酸替代物的等效肽在两种分析中都具有最小的抑制活性。该肽作为体外E1-E2相互作用的竞争性抑制剂的能力表明，E2氨基末端的相对较小部分中含有特定的E1识别活性，并且该结构域能够采用适合占据E1的E2结合位点的构象。
E1-E2相互作用和肽抑制实验表明，E1-E2识别以及HPV-11和HPV-16的E1和E2蛋白之间的相互作用具有功能保守性。E2的E39残基似乎是这些蛋白质之间E1-E2相互作用的保守功能成分，因为该残基是HPV-16 E1和E2以及HPV-11 E1和HPV-16 E2之间相互作用所必需的。E39对BPV-1 E2的复制功能也至关重要(10). 我们的肽抑制实验重申了该残基在HPV-16和HPV-11 E1-E2相互作用和复制中的重要性，因为E2N-WP15破坏了HPV-16和HPV-11 E1和E2蛋白的所有组合之间的相互作用。我们在结合试验中观察到HPV-16 E1和HPV-11 E2之间缺乏相互作用，这与转染293细胞时这些蛋白无法支持瞬时复制一致(47). 与HPV-11 E1相比，HPV-16 E1在E2伴侣的选择上似乎特别有选择性，后者可以在复制检测中与HPV-6、HPV-11、HPV-16或HPV-18的E2蛋白进行功能合作(9,38). 使用HPV-11和HPV-16嵌合E1蛋白的实验已确定HPV-16 E1的羧基末端284氨基酸是介导HPV-16 E2与HPV-16 E_2选择性结合的结构域(47). 这种选择性被归因于HPV-16 E1这一域内的空间位阻，以某种方式阻止HPV-11 E2结合。测试从多种E2蛋白的E39区衍生的一组扩展肽抑制其他E1和E2蛋白之间相互作用的能力，可以更深入地了解这种选择性的确切性质，从而可以估计单个肽或小分子所对应的HPV亚型的谱可能有效。
肽能够抑制体外E1-E2相互作用和乳头瘤病毒DNA复制的证明是评估小化合物作为乳头瘤病毒抗病毒药物的潜在功效的重要第一步，并验证了这种设计乳头瘤病毒抗病毒化合物的方法。我们还使用E2N-WP15肽检查E1-E2复合物形成和病毒DNA复制启动的早期事件。在两种体外E1-E2相互作用测定条件下，HPV-16 E1-E2复合物在10分钟内迅速形成。我们尚未在基于细胞的测定中测试这些肽抑制HPV DNA复制的能力；由传统氨基酸组成的肽本身通常不可用作药理试剂，因为它们通常不稳定或无法进入细胞。我们将探索加入已知的肽修饰以增加肽溶解度、通透性和生物利用度（例如，罗丹明结合或酰胺键甲基化），以促进E2N-WP15肽或类似肽的使用，抑制HPV DNA在体内的复制。无论E2N-WP15或类似抑制肽是否是体内有效的复制抑制剂，这些研究中定义的肽可能有助于确定结构，作为设计或发现抑制乳头瘤病毒复制的临床有用抗病毒化合物的起点。
