Functional Analysis of the Human Cytomegalovirus US28 Gene by Insertion Mutagenesis with the Green Fluorescent Protein Gene

Jeffrey Vieira; Thomas J. Schall; Lawrence Corey; Adam P. Geballe

doi:10.1128/jvi.72.10.8158-8165.1998

《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8158–8165.

数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.8158-8165.1998年

预防性维修识别码：PMC110158型

PMID：9733857

绿色荧光蛋白基因插入突变人巨细胞病毒US28基因的功能分析

杰弗里·维埃拉,^1,^2,^* 托马斯·夏尔,^三劳伦斯·科里,^1,²和亚当·盖鲍尔（Adam P.Geballe）⁴

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摘要

人类巨细胞病毒US28基因编码的蛋白与G蛋白偶联受体（GCR）具有同源性。先前的研究表明，重组US28蛋白可以结合β类趋化因子（K.Neote，D.DiGregorio，J.Y.Mak，R.Horuk，and T.J.Schall，Cell 72:415–425，1993），并在结合趋化因子后诱导细胞内钙升高（J.L.Gao and P.M.Murphy，J.Biol.Chem.269:28539–285421994）。为了研究US28蛋白在病毒感染细胞中的功能，构建了重组HCMV（HV5.8），US28开放阅读框被插入大肠杆菌gpt基因和绿色荧光蛋白基因。人类成纤维细胞（HF）的生长不需要US28基因。HF在感染后24小时被野生型HCMV结合的RANTES感染，并表现出RANTES诱导的细胞内钙流。在感染HV5.8的细胞中，RANTES没有结合或诱导钙流，表明US28负责HCMV感染细胞中的β-趋化因子结合和诱导钙信号。US28基因结合趋化因子的能力被证明会导致感染细胞培养基中RANTES的浓度显著降低。对感染细胞RNA的Northern分析表明，US28是一个早期基因，而US27（另一个GCR）是一个晚期基因。

已在β和γ疱疹病毒的基因组中鉴定出与细胞七跨膜受体同源的开放阅读框（ORF）(15,37). 许多细胞七跨膜受体已被证明是G蛋白偶联受体（GCR），并由编码多种生物化合物受体的基因超家族组成，包括神经递质、激素、气味和趋化剂。GCR通过相关G蛋白的激活将细胞外配体与细胞内过程的结合联系起来。G蛋白可以激活丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、磷脂酶或Ras(9). 这些蛋白质反过来可以刺激有丝分裂原激活的蛋白激酶或产生第二信使分子，如二酰甘油和三磷酸肌醇，从而激活蛋白激酶C并增加细胞内钙²⁺水平(9). 最终，这些过程导致由配体-GCR相互作用转导的初始信号扩增为复杂的细胞过程，如趋化性。

GCR是趋化因子受体，来源于趋化细胞因子，是一个由70-90-氨基酸可溶蛋白组成的多基因家族，由多种细胞类型分泌，在白细胞运输和免疫调节中发挥重要作用(7). 这两类结构相似的蛋白质由四个保守半胱氨酸中的前两个定义。在α类（例如，白细胞介素-8[IL-8]、MGSA和GCP-2）中，前两个半胱氨酸由干预残基（C-X-C）分离，而在β类（例如RANTES、MIP-1α、MIP-2β和MCP-1）中，它们相邻（C-C）。一般来说，α-趋化因子主要吸引中性粒细胞，而β-趋化素对单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞具有活性(46).

人类巨细胞病毒（HCMV）US28 ORF与细胞β-趋化因子受体CCR-1的同源性约为33%(35). 病毒和细胞蛋白的保守特征包括推测的七个跨膜区和与二硫键形成有关的半胱氨酸。US28和细胞GCR之间的序列同源性导致识别出β-趋化因子作为病毒受体的配体。在293细胞中表达的重组HCMV US28蛋白与β-趋化因子结合(35)与细胞受体结合趋化因子一样，K562细胞中表达的重组US28与配体的结合导致细胞内钙的增加(21).

在急性感染期间，HCMV可在血液和许多组织中发现，肺部、肾脏、唾液腺和肝脏通常受累。HCMV已在培养物和患者组织中的多种细胞中鉴定出来，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞(33,47,52). 由于HCMV可以感染对趋化因子作出反应的细胞类型和产生趋化因子的细胞类型，病毒GCR可能模拟细胞GCR的功能，但病毒GCR的表达在病毒生物学中的作用以及它在其中重要的细胞类型尚不清楚。

在之前的研究中，研究人员用重组蛋白检测了US28的功能(21,36)，我们研究了病毒基因组中表达的US28基因的功能。我们构建了一个重组HCMV，其中US28 ORF被绿色荧光蛋白（GFP）和鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（GPT）基因破坏，并证明US28负责HCMV感染细胞中GCR的功能。

材料和方法

细胞和病毒。

人类包皮成纤维细胞（HF）在杜尔贝科改良的Eagle's培养基（Gibco Laboratories）中生长，补充10%Nu血清（Collaborative Research，Inc.）、0.1 mg链霉素、100 U青霉素和2 mM我-5%加湿CO中的谷氨酰胺₂37°C培养箱。所有实验均使用HCMV（Towne）。

重组病毒的构建。

6-kb巴姆HI Q片段（已发布序列的216298至222296[14])AD169的克隆到巴姆pOK7的HI位点生成pQ62。然后在英国标准普尔HI（219198）和斯图I（219627）个场址包含在巴姆HI Q片段创建pQ63。这种结构，pQ63，用Bcl公司我和一个2.5 kb巴姆HI片段包含大肠杆菌gpt将单纯疱疹病毒（HSV）tk启动子表达的基因和在大鼠β-肌动蛋白启动子控制下的GFP基因插入Bcl公司I站点（位置219666）创建pQ64。对于HF的转染，用巴姆HI，用苯酚-CHCl3和CHCl3萃取，乙醇沉淀，并干燥。DNA以1至2 mg/ml的浓度重新悬浮在STE（5 mM NaCl，5 mM Tris-HCl[pH7.5]，1 mM EDTA）中，每次电穿孔使用20μg。对于电穿孔，HF被胰蛋白酶消化，与等体积的培养基混合，在500×克5分钟，并重新悬浮在电穿孔缓冲液中（OptiMEM I[Gibco]和cytomix的1:3混合物[54][120 mM KCl，0.15 mM CaCl₂，10毫微米K₂高性能操作₄-千赫₂人事军官₄[pH 7.6]，5 mM氯化镁₂]). 在0.4 ml电穿孔缓冲液中2×10⁶至5×10⁶使用BTX ECM 600仪器在室温下将HF细胞和DNA电穿孔，该仪器设置在285 V和1075μF的4 mm试管中。细胞在电穿孔后被电镀，并在电穿孔18到24小时后以2到5的感染倍数（MOI）感染HCMV。从这些培养物中提取的子代病毒，感染后5天（dpi），用于感染新鲜HF，并在含有25μg/ml黄嘌呤和15μg/ml麦考酚酸的培养基中培养。在100%细胞病变后2天采集病毒，并重复使用麦考酚酸类进行选择。然后使用来自第二次麦考酚酸选择的子代病毒在96个平板中通过两倍限制稀释进行斑块纯化重组病毒。重组病毒在450至490-nm紫外线照射下被鉴定为绿色荧光斑块。

已经构建了另外两种病毒HV5.6和HV5.7，它们具有相同的US28缺失并使用与HV5.8相同的插入位点。用pQ63构建HV5.6，并插入巴姆pON855的HI LacZ-GPT盒式磁带(55)在Bcl公司我的网站。该病毒是由麦考酚酸和黄嘌呤产生的，如上所述用于HV5.8。用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-吡喃半乳糖苷）覆盖层(49). HV5.7，其仅在Bcl公司I站点，由HV5.6生成，针对通用测试通过在人Lesch-Nyhan（次黄嘌呤-GPT缺陷型）皮肤成纤维细胞中生长HV5.6来携带药物6-硫鸟嘌呤的基因(25). HV5.7的产生是可能的，因为pON855的LacZ-GPT盒两侧是SV40多聚腺苷酸化信号的直接重复，并且在这两个重复序列之间可能发生重组，删除LacZ和GPT基因，使病毒对6-硫鸟嘌呤产生抗药性，并留下一个SV40多聚腺苷酸信号作为插入物(41,56). 这些重组HCMV的基因组结构通过病毒DNA分析得到确认，如前面所述的HV5.8（数据未显示）。

放射性配体结合和置换。

可置换绑定¹²⁵感染后不同时间对HF进行I标记趋化因子检测。电池（2×10⁶每毫升细胞数）与0.5 nM放射性标记配体和不同浓度的未标记配体在4°C下孵育2小时。通过从细胞悬浮液中取出等分样品并通过硅-石蜡油混合物离心分离缓冲液中的细胞来终止孵育(43). 在1mM未标记配体存在下测定非特异性结合。绘制了代表至少三个单独实验的单个分析测定。碘标记的趋化因子从Dupont/NEN（马萨诸塞州波士顿）获得，未标记的趋化因子从R&D Systems（明尼阿波利斯）获得。测量同源和异源趋化因子位移。实验是用两种独立分离的重组病毒进行的。

细胞质钙测量。

将2 mM indo-1/AM（Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.）在20°C的完整生长培养基中加载HF 45分钟。然后将细胞清洗，再悬浮在Na-Hanks平衡盐溶液（2 mM CaCl）中₂，145 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl₂，5 mM葡萄糖，20 mM HEPES，pH 7.3），含1%牛血清白蛋白，在20°C下保持2小时左右⁵然后将细胞悬浮在2ml Na-Hanks平衡盐溶液中，并在不断搅拌的丙烯酸试管中保持在37°C。荧光测量法测定胞浆游离钙的增加²⁺浓度（[Ca²⁺]i）使用Photon Technologies Inc.荧光分光光度计，激发波长为350 nm（4 nm带宽），同时监测405 nm和485 nm（10 nm带宽）的发射。以2Hz的速率测量405和485nm处的发射比。实验是用两种独立分离的重组病毒进行的。

RNA分析。

60 mm直径培养皿中的HF在5 PFU/细胞的MOI下感染。使用时，在感染前1 h将更昔洛韦（30μm）添加到培养基中。在感染后的不同时间，采集全细胞RNA(16)并通过甲醛琼脂糖凝胶电泳和Northern杂交进行分析(22)带有³²P标记探针。US27探针包含AD169序列的217761至219008序列，US28探针由PCR生成的US28 ORF克隆组成(36).

培养上清液中RANTES浓度的测定。

接种在15.5毫米孔中的HF在MOI为3时感染Towne、HV5.8、紫外线激活Towne或热灭活Towne（60°C，20分钟）或未感染。在吸收1小时结束时，取出接种物，用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，并向每个孔中添加0.3 ml培养基。对于每个实验间隔，从培养物中取出培养基，并添加0.3 ml新鲜培养基。收集的培养基在1500×克，将上清液移到新鲜试管中，并在−70°C下保存，直至分析。按照制造商的说明，使用RANTES（研发系统）的酶联免疫吸附分析试剂盒测定RANTES浓度。

结果

重组HCMV的构建与分析。

HV5.8是一种重组HCMV（Towne），通过删除和插入GPT-GFP盒破坏US28 ORF，其构建步骤如图所示。图1。1。用于构建HV5.8 pQ64的构造包括巴姆HI Q片段（Ad169序列的位置216298至222296），在位置219200之间删除了US28 ORF的前40%(英国标准普尔HI）和219629(斯图一） ●●●●。GPT-GFP盒插入位置219666(Bcl公司一）在US28 ORF内。GPT-GFP结构（图。（图1）1)包含大肠杆菌gptHSV胸苷激酶启动子表达的基因(55)和GFP基因(13)由大鼠β-肌动蛋白启动子表达(38). 这两个基因的转录本都被双向SV40多聚腺苷酸化信号的早期多聚腺苷酸化信号终止(12)，可为插入位点上游的病毒基因提供多聚腺苷化功能(55). HV5.8由pQ64转染的HF产生，随后用HCMV（Towne）感染。子代病毒是在选择通用测试基因经过两个周期，在450～490-nm的光照下，通过绿色荧光斑的鉴定，对含有GFP的重组病毒进行斑块纯化。

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图1

HV5.8、HV5.7和GPT-GFP嵌件的结构。HCMV基因组与6-kb扩增的示意图巴姆含有用于构建重组病毒的US28基因的HI片段。这个Bsp公司HI-to公司-斯图I删除删除了US28 ORF的430 bp。这个Bcl公司I位点是HV5.8或SV40多聚腺苷化片段（核苷酸2533至2774）中GPT-GFP盒的插入点[20])在HV5.7中。GPT-GFP盒的成分是（从左边开始）SV40序列[聚（A）]、核苷酸2533到2774(20); 这个大肠杆菌鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（GPT），核苷酸667至121(40); HSV胸苷激酶启动子（TK），核苷酸47925-48108(31); SV40序列，核苷酸128至37(20); 大鼠β-肌动蛋白启动子（β-act），核苷酸124-262(38); 人类T细胞白血病病毒R区，核苷酸96至270(42); 这个A.维多利亚GFP基因，核苷酸26至742(39); SV40序列[聚（A）]，核苷酸2774至2533(20).

另外两种病毒，US28的缺失与HV5.8相同，但在Bcl公司I现场（219666）也已建成。HV5.6具有来自pON855的LacZ-GPT插件(55)在Bcl公司I站点和HV5.7（图。（图1）1)仅插入了240-bp SV40多聚腺苷化序列，因此不表达任何异源蛋白。HV5.7是根据HV5.6通过反选择生成的通用测试药物6-硫鸟嘌呤基因(25).

从HV5.8中分离出病毒DNA，以检查病毒基因组的结构，并确认没有野生型HCMV。用酶消化HV5.8和HCMV（Towne）的病毒DNA巴姆HI或Hin公司dIII，琼脂糖凝胶电泳分离。通过溴化乙锭染色分析DNA（图。（图2A）2A）并通过与³²含有US27和US28序列的P标记DNA探针（图。（图2B）。2B） ●●●●。在溴化乙锭凝胶中对HCMV和HV5.8 DNA的比较显示，除含有US28的片段外，没有任何变化。杂交分析表明，6-kb巴姆HI和14kbHin公司HV5.8中没有探针在HCMV（Towne）中检测到的dIII片段（包含US28），正如预期的那样，存在比HCMV片段大2 kb的片段。

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图2

HV5.8的基因组结构分析。从HCMV（Towne）和HV5.8中制备病毒DNA，用巴姆HI或Hin公司dIII，并在0.6%琼脂糖凝胶上电泳。（A）溴化乙锭染色的病毒DNA。左侧显示了以千碱基对为单位的分子尺寸标准。（B）病毒DNA与US27-US28杂交分析产生的放射自显影³²图中所示的P标记探针。图77.

重组病毒HV5.8携带水母GFP基因维多利亚多管发光水母(39)由大鼠β-actin启动子表达。使用GFP作为重组病毒的标记物，可以通过荧光显微镜观察感染细胞（图。（图3）。三). 此外，GFP的存在使得通过荧光激活的细胞分选对感染细胞进行分选成为可能，分选后的细胞仍然存活，重组病毒可以被回收（数据未显示）。

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图3

HF上HCMV斑块的可视化。（A）正常照明下病毒斑块的显微照片。（B） HF上的HV5.8菌斑在450至490-nm紫外线照射下用尼康显微镜以200倍放大率拍摄。

比较了HV5.8和HCMV（Towne）的生长动力学（图。（图4）。4). HV5.8中的峰值滴度减少了四到五倍。这一结果不太可能是由于US28区域以外的二次突变造成的，因为三种独立衍生的重组病毒表现出相同的表型（数据未显示）。这种表型是由于US28 ORF的丢失，290个密码子的ORF的缺失，该密码子与US28 ORF重叠约75%，并且在HV5.8中也被破坏，还是插入的影响尚未解决。

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图4

HCMV（Towne）和HV5.8的生长动力学。HF在0.05的MOI下感染野生型HMCV或HV5.8，在指定时间采集，并在−70°C下冷冻。样品在滴度测定时解冻并进行超声处理。首次接种发生在第0天，检测限为10 PFU/ml。

趋化因子结合。

为了确定HCMV感染的细胞是否会表现出特异性趋化因子结合，以标记的趋化因子作为配体进行了实验。感染HCMV的HF在感染24小时和48小时后用¹²⁵I-RANTES和增加未标记RANTES的数量。测定了与细胞结合的标记RANTES的量，表明¹²⁵I-RANTES与HCMV感染细胞结合，这种结合被未标记RANTES的竞争所阻止（图。（图5A5A和B）。感染后24或48小时感染HV5.8或HV5.7的HF和HF未显示¹²⁵I-RANTES装订（图。（图5A5A和B）。这种结合对β-趋化因子具有特异性，因为MCP-1和未标记的RANTES一样，可以与标记的RANT结合竞争，但IL-8没有（图。（图5C）。5C） ●●●●。此外，与未感染细胞相比，感染野生型HCMV或HV5.8后4小时的细胞没有显示RANTES结合增加（数据未显示）。HV5.8和HV5.7感染的细胞缺乏趋化因子结合，这支持了US28是感染细胞与β-趋化因子的结合蛋白的发现。

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图5

的绑定¹²⁵感染细胞标记RANTES。（A）用野生型HCMV、HV5.7或HV5.8感染24小时的未感染HF和HF，用¹²⁵在存在增加量的未标记RANTES的情况下I标记的RANTES，并测定标记的RANTES的量。（B）位移¹²⁵感染后48小时，在感染野生型HCMV、HV5.7或HV5.8的细胞上，通过未标记RANTES对RANTES进行I标记。（C）位移¹²⁵感染MCP-1或IL-8后48小时，HCMV感染细胞的I-标记RANTES，浓度为100 nM。cpm，每分钟计数。

钙助熔剂。

为了测试从病毒基因组中表达的US28 ORF是否负责诱导钙流，在添加各种趋化因子后监测感染HCMV（Towne）或HV5.8的HF的细胞内钙水平。通过用荧光钙指示剂indo-1/AM加载感染细胞并测量荧光变化来监测细胞内钙水平的变化，相对荧光的增加表明细胞内钙的增加。在未感染HF或感染HCMV 4h的细胞中添加RANTES后，细胞内钙水平没有变化，而感染HF 24h或48h的细胞显示添加RANTE后钙增加（图。（图6A）。6A） ●●●●。在HV5.8的实验中，在任何时间点添加RANTES均未检测到钙通量（图。（图6B）。6B） ●●●●。

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图6

HCMV和HV5.8感染HF的细胞内钙通量。在感染后指定的时间，细胞被加载钙指示剂indo-1/AM，并在添加指定的趋化因子期间进行荧光光谱监测。（A）感染后4、24和48小时HCMV感染细胞和未感染HF，用1μM RANTES处理。（B） HF和HF在感染后24和48小时感染HV5.8，并添加1μM RANTES。（C） HF在感染后24小时感染HCMV。顶部的痕迹显示用1μM MIP-1α处理的细胞，然后是1μM RANTES，底部的痕迹显示，用1μM IL-8处理的细胞和用1μM-RANTES处理的细胞。

已经证明，在细胞系中表达的重组US28基因可以引起除RANTES外的β-趋化因子的钙反应，但不能引起α-趋化素的钙反应(21). 检测感染HCMV的HF对MIP-1β（aβ-趋化因子）和IL-8（aα-趋化素）产生的钙通量（图。（图6C）。6C） ●●●●。检测到对MIP-1β的反应，随后添加RANTES不会产生第二次钙通量。向HCMV感染的细胞中添加IL-8不会引起钙通量，但随后添加RANTES确实会产生反应。此外，检测到细胞内钙的增加是对β-趋化因子、MCP-1和MIP-1α的反应，但程度低于RANTES或MIP-1β（数据未显示）。

US27和US28的北方分析。

结合和钙通量数据表明，US28基因在感染后24小时表达。为了证实这是真的，通过在HCMV（Towne）感染后4、24和48小时以及在更昔洛韦存在下感染后48小时从HF分离的总RNA的Northern分析来测定US28和US27的时间表达。图图77显示了使用US27或US28衍生探针对这些样品进行的Northern分析。US27和US28基因以相同的方向转录，并在US28结束时终止于一个共同的多聚腺苷酸化信号，这导致2.9 kb的US27转录本和1.3 kb的US 28转录本(57). 未感染HF或感染后4小时未检测到信号。感染后24和48小时检测到与US28相对应的1.3kb转录本，仅在感染后48小时检测出US27的2.9kb转录物。在感染后48小时，在更昔洛韦的存在下，仅检测到1.3kb的RNA，确定US28为早期基因，US27为晚期基因。

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图7

US27和US28转录本的Northern blot分析。从模拟感染HF、感染后4、24和48小时感染HF以及在存在更昔洛韦的情况下感染48小时HF中分离出全细胞RNA。RNA在1%琼脂糖-1.2 M甲醛凝胶上电泳，并在硝化纤维素上印迹。用US27衍生或US28衍生的RNA杂交分析产生的放射自显影³²显示P标记探针。泳道1，模拟感染；第2道，感染后4h；3巷，感染后24h；4巷，感染后48h；第5巷，感染更昔洛韦后48小时。显示了1.3 US28和2.9 US27转录本的位置以及28S和18S rRNA的位置。

US28 CMV感染培养物中RANTES浓度的调节。

接种肿瘤坏死因子α可诱导人成纤维细胞产生RANTES(34)或CMV(32). US28对感染培养基中RANTES水平的影响是通过分析HF和HF培养上清液中的RANTES浓度来确定的，HF感染了Towne、HV5.8、UV激活病毒或热灭活病毒，时间间隔如图所示。图8。8未感染的HF和感染热灭活病毒的HF在所有时间点产生最低可检测的RANTES水平，而感染Towne、HV5.8和紫外线激活病毒的HF-在感染后8小时显示RANTES显著增加，在8至16小时间隔内增加。感染Towne的培养物中RANTES的水平在感染后16 h至36 h迅速下降，此时的水平与未感染细胞的水平相似。HV5.8感染的细胞在感染后36小时内保持较高的RANTES水平，但确实出现了2和3 dpi的降低。感染紫外线活化病毒的HF在所有时间间隔内均保持RANTES表达水平的升高。

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图8

从感染Towne、HV5.8、紫外线灭活Towne（UV）、加热灭活Town（热量）和未感染HF（uninf）的HF培养物中按指示的时间间隔收集的培养上清液中的RANTES浓度。绘制的结果是四个实验的平均值。

讨论

以前的研究表明，表达重组US28的细胞株可以结合β-趋化因子，并在存在趋化因子配体的情况下显示钙通量(21,35). 在本研究中，我们证明感染HCMV的人成纤维细胞获得与GCR一致的功能，GCR将β-趋化因子识别为配体。HCMV感染的细胞与RANTES（一种β趋化因子）结合，并通过诱导细胞内钙流量对β趋化素的添加作出反应。感染了缺乏US28的病毒的细胞没有显示这些功能，这表明在感染细胞中看到的β-趋化因子GCR的功能是由于US28，而不是由于其他病毒基因或诱导的细胞基因。

发现US28为早期基因，US27为晚期基因。US28转录物的表达在时间上与HCMV感染细胞中确定的β-趋化因子的GCR功能相对应。感染后24小时US28 mRNA的表达与早期使用AD169的研究相比，表明US28和US27都是晚期基因(57). 产生不同结果的可能原因可能是病毒株差异、使用更昔洛韦代替膦甲酸（PFA），或者在之前的工作中仅在单个时间点（7dpi）检测RNA，而延长PFA治疗可能具有非特异性效果。最近一项使用聚合酶链式反应检测RNA的研究也表明，US28基因是一种早期基因(32)但他们的方法无法区分US27和US28作为早期基因。据推测，HCMV GCR可能是病毒粒子的成分，并可能解释感染后不久细胞内钙水平的变化(57). 而UL33蛋白被证明是病毒粒子的组成部分(30)，我们在感染的最初几个小时内没有检测到US28蛋白的活性，这表明US28蛋白不是病毒蛋白，或者它的水平太低，无法用我们的方法检测到。

人类成纤维细胞能够产生RANTES(34)接种HF和CMV可诱导RANTES表达(32). 我们发现US28基因对感染细胞培养基中存在的RANTES水平有着深远的影响。接种了Towne、HV5.8或紫外线活化病毒的细胞培养上清液中的RANTES迅速增加，而从感染后16至24小时开始，Towne感染的培养物中RANTES急剧下降；HV5.8感染的培养物中的水平仍然升高。然而，与感染紫外线活化病毒的培养物相比，感染HV5.8的培养物上清液中RANTES在2和3 dpi时减少，这表明除US28以外的其他因素可能导致趋化因子水平降低。虽然这一结果支持US28在降低感染部位免疫反应方面的作用，但这是否表明US28具有真正的免疫逃避功能，还是仅仅是病毒表达功能性趋化因子受体的体外效应，尚待确定。

编码GCR的基因是γ和β疱疹病毒基因组中的共同主题。HCMV的UL33、UL78、US27和US28 ORF(15,24)人类疱疹病毒6型（HHV-6）的U12和U51 ORF(24)，HHV-8的ORF 74(45)和塞米里疱疹病毒ECRF3(1)均与细胞GCR同源。Epstein-Barr病毒是一种无病毒GCR的γ疱疹病毒，诱导两种细胞GCR EBI-1和EBI-2的表达(8). EBI-1也由HHV-6和-7诱导(26). GCR与β和γ疱疹病毒的普遍存在表明这些蛋白在病毒发病机制中具有重要作用，但这种作用尚未阐明。病毒GCR有三种可能的功能：（i）免疫逃避，（ii）细胞激活，以及（iii）促进细胞迁移和病毒传播。我们的数据显示，HCMV感染细胞在感染后早期获得β-趋化因子GCR功能，可以支持病毒GCR的任何这些作用。

以前已经确定了与免疫逃避有关的模仿细胞功能的病毒基因。痘病毒表达结合IL-1β和γ-干扰素的可溶性蛋白(三,51,53)在动物模型中使用重组病毒表明，这些蛋白质可以影响宿主反应(2,三). US28蛋白可能会隔离趋化因子，从而降低宿主对感染部位的免疫反应。在缺乏β-趋化因子MIP-1α的转基因小鼠中，发现流感病毒清除延迟，说明了趋化因子对免疫反应的潜在重要性(18). 为了支持其吸附趋化因子的功能，US28对β-趋化因子谱的结合亲和力高于细胞受体之一CCR-1(35,45安). 我们的数据表明，US28基因可以降低体外感染细胞释放的RANTES水平，这也支持了免疫逃避的可能作用。尽管US28基因可能通过结合趋化因子在免疫逃避中发挥作用，但US28蛋白传递细胞内信号的事实表明，它还具有其他功能，因为信号转导不应仅用于隔离趋化因子。

US28蛋白所显示的US28表达的早期动力学和细胞激活过程的诱导与其在激活细胞以允许或增强病毒复制方面的作用一致。虽然CMV已被证明在许多可能表达趋化因子受体的细胞类型中复制(10,11,19,47)，US28 GCR对趋化因子的高级结合可能对在配体水平低于激活未感染细胞的配体水平时激活受感染细胞很重要。US28蛋白也可能通过不自然表达趋化因子受体的趋化因子激活细胞。

趋化因子作为细胞趋化剂在诱导细胞与内皮细胞粘附和促进细胞跨内皮迁移中发挥作用(6,44). 因此，US28基因可能影响感染细胞的迁移。β-趋化因子可作为单核细胞、T细胞和NK细胞的趋化剂(4,6,29,44)，其中一些可能被HCMV感染(10,17,19,23,27,47,48). US28蛋白的表达将为感染细胞增加一个对多种β-趋化因子具有高亲和力的GCR(36). 因此，该受体可能使受感染细胞具有改进或新的迁移能力，从而有助于病毒传播。

在构建HCMV US28突变株的过程中，GFP被用作标记物，用于在紫外线照射下识别重组斑块，以及对感染细胞进行荧光激活细胞分选和病毒回收。自重组GFP基因，从水母中分离出来A.维多利亚(39)，首次用作遗传标记秀丽隐杆线虫(13)，它已被用于多种生物，包括酵母(5)，哺乳动物细胞(50)、和转基因小鼠(28). GFP是一种有价值的生物标记物，它可以进行无创检测，只需要紫外线照射即可产生绿色荧光。虽然GFP有助于鉴定重组病毒，但GFP标记病毒的最大用途可能是无创鉴定感染细胞。未来对病毒GCR功能的研究可能涉及单核细胞和其他细胞群的研究，其中只有一部分细胞可能被CMV实验感染。在这样的细胞群中，GFP可以允许对受感染的细胞进行特异性观察或分离受感染的细胞，用于随后的关于病毒GCR研究的实验。

确认

这项研究得到了NIH拨款AI26672（授予A.P.G.）的部分支持。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）