《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8150–8157.
自失活慢病毒载体的研制
加利福尼亚州拉霍亚索尔克生物研究所遗传学实验室，邮编：92037
*通讯作者。通讯地址：加利福尼亚州圣地亚哥市索尔克生物研究所遗传学实验室，邮政信箱85800，邮编92186-5800。电话：（619）453-4100，分机1462。传真：（619）558-7454。电子邮件：ude.klas@amrev. †现住址：德国汉诺威30625，汉诺威医学院神经外科。
‡现住址：日本京都606，坂谷京都大学医学研究生院眼科和视觉科学系。
1998年4月30日收到；1998年7月13日接受。
摘要
我们基于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）构建了一系列新的慢病毒载体，可以转导非分裂细胞。载体构建物中5′长末端重复序列（LTR）的U3区域被巨细胞病毒（CMV）启动子取代，导致Tat依赖性转录，但仍保持高水平表达。通过删除3′LTR U3区的133bp，包括TATA盒和转录因子Sp1和NF-κB的结合位点，构建了一种自失活（SIN）载体。在感染细胞中进行反转录和整合后，缺失转移到5′LTR，导致前病毒中LTR的转录失活。SIN病毒可以在滴度没有显著降低的情况下产生。将病毒注射到大鼠脑内表明，在CMV内部启动子的控制下，含有绿色荧光蛋白基因的SIN载体可以像野生型载体一样有效地转导神经元。有趣的是，一种没有内部启动子的野生型载体也成功地在大脑中转导了神经元，这表明即使在没有Tat的情况下，HIV-1 LTR启动子在神经元中也具有转录活性。此外，向大鼠眼睛的视网膜下间隙注射病毒表明，野生型载体主要转导视网膜色素上皮和感光细胞，而SIN载体能够转导其他类型的视网膜细胞，包括双极细胞、米勒细胞、水平细胞和无长突细胞。这一发现表明，HIV-1 LTR可对某些细胞类型的CMV内部启动子产生负面影响。SIN HIV载体用于基因治疗应该更安全，而且作为一种在非分裂细胞中进行高水平基因转移和表达的手段，它们也具有更广泛的适用性。
基因治疗方法依赖于将基因高效转移到所需的靶细胞（有关综述，请参阅参考文献12,32,34,35、和48). 已开发出多种病毒和非病毒载体，并对其转导效率、转基因持续表达和安全性进行了评估。其中，来自肿瘤逆转录病毒（如小鼠白血病病毒（MLV））的逆转录病毒载体已被广泛用于基因治疗应用。然而，这些逆转录病毒载体的一个主要问题是整合目标细胞的增殖要求，限制了它们用于将基因转移到非分裂细胞，如肝细胞、成肌细胞、神经元和造血干细胞。相反，慢病毒如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）可以感染非分裂细胞(7,30,49).
我们最近开发了一种基于HIV-1的慢病毒载体，可以在体内外转导非分裂细胞(38). 这些HIV载体是水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）的假型；因此它们可以转导广泛的组织，并且可以浓缩到高滴度。我们已经证明，HIV载体可以稳定地整合到宿主细胞基因组中，并在大脑、肝脏、肌肉和视网膜中获得转基因的长期表达(4,24,33,38,39). 在注射部位不能检测到细胞免疫反应。此外，可以将HIV载体再次注射到动物体内，这表明对该载体缺乏任何有效的体液免疫反应(24).
虽然HIV载体有望在基因治疗中发挥巨大作用，但由于HIV-1是艾滋病的病原体，因此人们对其安全性感到担忧。主要的安全问题是在载体生产过程中产生具有复制能力的病毒。在这方面，我们已经通过使用由包装、包膜和载体构建物组成的三质粒表达系统，将通过重组产生具有复制能力的病毒的可能性降至最低(38,39). 此外，最近的研究证明了消除所有辅助基因的可能性(振动频率,虚拟专用数据库,虚拟专用单元、和尼日利亚石油公司)在不丧失转换非分裂细胞能力的情况下(24,26,43,56).
与基于MLV的载体一样，HIV载体的另一个安全问题是，通过载体前病毒随机整合到宿主基因组中，插入激活细胞癌基因的可能性。为了克服这个问题，我们构建了一个自激活（SIN）载体，其中删除了病毒增强子和启动子序列。在本报告中，我们表明SIN载体可以在体内产生并转导非分裂细胞，其功效与野生型载体相似。SIN前病毒中长末端重复序列（LTR）的转录失活应阻止复制活性病毒的动员。这也可以通过消除任何顺式-LTR的作用效应对载体结构进行了进一步修改，其中5′LTR的U3区被巨细胞病毒（CMV）启动子取代，导致Tat依赖性转录，病毒滴度没有降低。SIN载体与该杂交5′LTR结合，进一步降低了重组产生具有复制能力的病毒的可能性，因为病毒产生系统中没有完整的U3序列。这些修改为基于HIV-1的慢病毒载体系统增加了额外的安全功能。
材料和方法
质粒构建和病毒载体的制备。
通过替换420-bp构建质粒pHR′-MCS巴姆HI（高）-Xho公司pHR′的I片段(38)包含多个克隆位点的片段巴姆你好，生态第47III页，Bst公司十一、，萨克二、，Pst（磅/平方英尺）我，生态RI、，克拉我，Xba公司我，血红蛋白一、 和Xho公司I站点。为了重组HIV-1 LTR并生成pHR′-MCS的SIN-LTR、PCR扩增产物Mlu公司我-英国标准普尔EI（−454至−145）和英国标准普尔EI公司-阿帕I（−144至+180）碎片或Mlu公司我-英国标准普尔EI（−454至−145）和英国标准普尔EI公司-阿帕I（-8至+180）片段被克隆到pcDNA3.1/Zeo（+）（Invitrogen）中Mlu公司我和阿帕I位点分别生成pHIV-LTR或pHIV-SIN（括号中的数字表示相对于转录起始位点的位置）。构建HIV载体pLL和pLS，a 2.3-kb英国标准普尔pHR′-MCS的EI片段被克隆到英国标准普尔pHIV LTR和pHIV SIN的EI位点。pLS在3′LTR中有133-bp缺失（−141到−9）Mlu公司我-卡斯pLL和pLS的I（−454至+183）片段分别带有Mlu公司我-卡斯I PCR扩增产物（−13至+183）删除5′LTR的U3区。为了产生带有CMV启动子的杂交5′LTRs，通过插入Pvu公司我-萨克包含CMV启动子的I片段从pcDNA3.1/Zeo（+）进入Pvu公司我和Mlu公司pHIV-ΔU3L和pHIV--ΔU3 S的I位点。杂交5′LTR保持CMV启动子TATA盒与HIV-1 LTR转录起始位点之间23-bp的距离巴姆HI（高）-Xho公司pKS-CMV-GFP的I片段(33)将CMV-绿色荧光蛋白（GFP）表达盒分别装入pLL、pLS、pCL和pCS的相同位点。分别通过从pLL-CG、pCL-CG和pCS-CG中删除CMV启动子构建pLL-G、pCL-G和pCS-G。
VSV-G假型HIV载体是通过载体构建物（15μG）与表达VSV-G的构建物pMD瞬时共转染产生的。G（5μG）和包装将pCMVΔR8.2（10μG）构建成293T细胞，如前所述(39). 通过超速离心制备HIV载体的高密度储备。通过感染293T细胞或HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞来测定病毒的滴度(27)，10时在6孔板中播种5感染前一天，用一系列稀释的载体储存。隔夜培养后，更换细胞培养基；48小时后，对GFP阳性细胞的数量进行评分，以量化滴度。使用HIV-1 p24酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（杜邦NEN）检测载体库存的p24抗原水平。超速离心浓缩后，滴度为1×109至2×109通常可获得单位（TU）/ml。如其他地方所述，通过标记物拯救试验和ELISA测量p24抗原水平来确定复制能力病毒的缺失(39).
Southern和Northern印迹分析。
通过Wu等人的程序从感染病毒的细胞中分离出基因组DNA(51). 用限制性内切酶消化DNA（10μg）英国标准普尔EI和巴姆HI在0.7%琼脂糖凝胶上分离，在20×SSC中转移到Hybond-N+膜（Amersham）中（1×SSC为0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）。使用无酚RNA总RNA分离试剂盒（Ambion）从病毒感染细胞中分离出总细胞RNA。在1%琼脂糖甲醛凝胶上分离RNA（10μg），并转移到25 mM磷酸钾（pH 6.5）中的Hybond-N+膜。用紫外线交联剂（Hoefer）对膜进行紫外线照射，并与32P标记探针由Megaprime DNA标记试剂盒（Amersham）在Rapid-hyb缓冲液（Amersham）中在65°C下生成2小时，在0.1×SSC–0.1%十二烷基硫酸钠中在65℃下洗涤两次15分钟，并暴露于X-Omat AR X射线胶片（柯达）中。从pCL-CG中分离出BN和GFP探针，大小为0.43-kbBss公司HII公司-不是I和0.75-kb生态47III型-Xho公司I片段。
体内实验。
HIV载体的高滴度库存（1×109至2×109TU/ml）注射大脑和眼睛。将CL-G和CS-G载体的滴度归一化为HIV-1 p24抗原水平。成年雌性Fischer 344大鼠通过肌肉注射氯胺酮-头孢马嗪-甲苯噻嗪进行麻醉。三微升载体储备（3×106双侧纹状体和海马注射TU）(n个=每种载体4），使用5μl Hamilton注射器。在注射后2周和6周处死大鼠。
Fischer 344只幼鼠（年龄2至5天）通过在冰上冷冻5分钟进行麻醉。眼球通过眼睑上的切口暴露出来，切口平行于睁开的眼睑边缘。在手术显微镜下进行视网膜下注射。0.5μl的矢量存量（106TU）注入视网膜下间隙(n个=每种载体8），使用与5μl Hamilton注射器连接的玻璃毛细管。在注射后6周和12周处死大鼠。
大鼠心脏内灌注冷固定液（4%多聚甲醛和0.2%戊二醛，置于0.1M磷酸盐缓冲液中）。取出组织，在固定液中进一步固定，并在4°C的30%蔗糖中冷冻过夜。然后将组织冷冻在干冰上的Tissue-Tek O.C.T.复合物（Sakura Finetek）中，并在滑动切片机（50μm厚的脑切片）或低温恒温器（20μm厚眼切片）上切片。如前所述进行免疫荧光染色(4). 用共焦激光扫描显微镜（Bio-Rad）对切片进行分析。收集信号，数字彩色增强，并叠加。
结果
构建和生成改良HIV载体。
在逆转录病毒的生命周期中，在感染细胞的逆转录和病毒DNA合成过程中，3′LTR的U3区域被复制以形成5′LTR的相应区域。这种病毒复制机制使我们能够对HIV载体进行两个主要修改，如图所示。首先，用CMV启动子替换5′LTR的U3区。其次，删除了3′LTR的U3区133 bp，该区域包含TATA盒以及转录因子Sp1和NF-κB的结合位点。该缺失在逆转录后转移到5′LTR。因此，前病毒中LTR的转录单位被消除。这种矢量称为SIN矢量(54).
HIV载体结构和相应的前病毒。（左）HIV载体构建物。每个载体构建物与包装和VSV-G表达构建物共同转染到293T细胞中。病毒转录起始于5′LTR中的U3/R边界，终止于3′LTR的R/U5边界。病毒RNA被包装成病毒粒子。病毒被采集并用于感染目标细胞。三角形表示删除的U3区域。（右）整合前病毒的结构。在受感染的细胞中，在病毒RNA逆转录为双链DNA的过程中，3′LTR的U3区被用作两个LTR中U3区合成的模板。结果，3′LTR的U3区被复制并转移到整合前病毒的5′LTR。这个英国标准普尔电子工程师-巴姆Southern杂交分析中预期的HI限制片段（图。)以及Northern blot分析中预期的RNA转录物（图。)下面显示了每个前叶结构及其大小。还指出了用于Southern blot和Northern blot分析的BN和GFP探针的位置。
一系列称为LL-CG、LS-CG、CL-CG和CS-CG的向量（图。)构建的目的是确定这些修饰是否会改变载体产生的病毒的滴度。所有载体都含有GFP基因，作为带有CMV内部启动子的报告基因。CL-CG和CS-CG载体包含CMV启动子，取代5′LTR的U3区域。CL-CG与CS-CG产生的病毒应分别包含与LL-CG和LS-CG病毒相同的RNA基因组（图。). 我们还构建了不含内部启动子的CL-G和CS-G载体，其中GFP基因受5′LTR启动子控制。
VSV-G假型载体是通过将每个载体结构与VSV-G表达结构和包装结构瞬时共转染到293T细胞中而生成的。转染后62 h收获载体病毒，用于感染293T细胞，通过定量GFP阳性细胞的数量来测定病毒滴度。LL-CG载体的平均滴度为6×105TU/ml。如表所示用CMV启动子替换5′LTR的U3区并没有降低病毒滴度。SIN载体LS-CG和CS-CG的滴度分别与野生型对应物LL-CG和CL-CG的效价大致相同。这些结果表明，SIN载体中U3区的小缺失对滴度没有显著影响。低滴度的CL-G可能反映了LTR启动子的相对效率低下，因为缺乏反式感染细胞中的活化剂Tat。使用CS-G载体对少数细胞的GFP评分为阳性，可能是由于在宿主基因组启动子附近发生整合事件，因为前病毒中没有启动子。为了测量CL-G和CS-G载体的病毒产量，测量了上清液中HIV-1 p24抗原的水平，因为这些与病毒数量相关。用CL-G和CS-G载体获得的p24水平与用其他载体获得的p24水平大致相等，表明所有载体的病毒产生水平大致相似（表). 然而，我们不能排除用这种方法产生缺乏病毒基因组RNA的病毒的可能性。
表1
| 矢量 | 293T细胞滴定（TU/ml）一 | 相对p24水平b条 |
|---|
| LL-CG公司 | 5.7 × 105 | 1 |
| CL-CG公司 | 9.3 × 105 | 1.42 |
| LS-CG公司 | 5.0 × 105 | 0.56 |
| CS-CG公司 | 8.2 × 105 | 1.39 |
| CL-G公司 | 2.1 × 104 | 1.51 |
| CS-G公司 | <10 | 1.26 |
具有CMV启动子的杂交5′LTR的表达是Tat无关的。
已经证明Tat反式HIV-1 LTR的激活不仅需要LTR R区的Tat反应区（TAR），还需要TATA盒以及Sp1和NF-κB的结合位点(2,三,17,22,31,36,41,55). 为了验证杂交CMV-LTR启动子是Tat非依赖性的，比较了CL-G载体构建物和LL-G构建物的启动子活性，在LL-CG中删除了CMV内部启动子，因此GFP基因在野生型5′LTR的控制下表达。用Tat表达质粒或对照质粒将这些构建物转染293T或HeLa细胞，48小时后用荧光光谱法测定细胞提取物中GFP的水平(40). 表显示转染LL-G的细胞中GFP的表达在Tat的存在下增加了三到六倍。低水平反式Tat在293T细胞中的激活可能是由于反式293T细胞表达的腺病毒E1A基因产物激活(37). 另一方面，CL-G对Tat没有反应，尽管表达水平与在Tat存在下用LL-G获得的表达水平相似。因此，用CMV启动子替换5′LTR的U3区导致Tat反应性的丧失，但在293T和HeLa细胞中，Tat的基础活性与野生型LTR相当。
表2
| 构造 | Tat公司 | 相对GFP表达
|
|---|
| 293吨 | 希拉牌手表 |
|---|
| 微重力仪 | − | 1 | 1 |
| + | 3 | 6.2 |
| pCL-G型 | − | 4.9 | 7.3 |
| + | 3.9 | 9.4 |
前病毒结构和转录的特征。
用Southern blot分析前病毒的结构。HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞(27)每种载体感染36天，共培养11代。从感染细胞中分离出基因组DNA，并用限制性内切酶消化英国标准普尔EI和巴姆HI，并与BN探针杂交（图。). 前病毒的预测结构如图所示。.英国标准普尔EI在每个LTR中分裂一次，紧邻SIN矢量中删除区域的上游，以及巴姆HI在5′LTR下游断裂一次。因此，1.69-kb英国标准普尔EI公司-巴姆当与BN探针杂交时，HI片段应该由含有野生型5′LTR的前病毒产生。如果SIN载体3′LTR中存在的133-bp缺失转移到整合前病毒的5′LTR英国标准普尔EI公司-巴姆应该产生HI片段来代替1.69kb的片段。如图所示。，预期的片段是从每个前病毒中产生的。对受感染的293T细胞的分析产生了相同的结果（数据未显示）。
整合前病毒结构的Southern blot分析。从感染HIV载体的HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞中分离的基因组DNA用英国标准普尔EI和巴姆你好。将印迹与BN探针杂交。用于感染的媒介显示在每条车道的上方。对照组，未感染HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞。碎片的预期尺寸如图所示。。尺寸标记显示在左侧。
接下来我们分析了前病毒的转录活性。从感染上述每种病毒的HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞中分离出总细胞RNA，并以GFP基因为探针进行Northern blot分析。如图所示。，表示图中所示的预期成绩单。对每一种前病毒进行了观察。在来源于LL-CG或CL-CG载体的前病毒中，产生了三个转录物：两个5′LTR启动的病毒转录物，一个3.60-kb全长形式和一个2.44-kb剪接形式；以及在CMV内部启动子中启动的1.48-kb转录物。所有转录物在3′LTR的R区的多聚腺苷酸化信号处终止。通过使用BN探针确认全长和剪接形式，该探针仅检测全长形式（数据未显示；见图。对于结构）。CMV内部启动子表达的转录物水平高于5′LTR启动的转录物。在SIN载体LS-CG和CS-CG的情况下，无法检测到来自5′LTRs的转录物，并且检测到来自内部启动子的1.35-kb转录物。由于3′LTR的U3区133-bp缺失，该转录本比LL-CG或CL-CG前病毒的相应转录本短。来自CL-G载体的前病毒产生可检测的全长和剪接病毒转录本。正如预期的那样，在感染CS-G载体的细胞中未检测到RNA转录物。用每种病毒感染的293T细胞获得了相同的结果（数据未显示）。
前病毒表达的Northern blot分析。从感染HIV载体的HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞中分离出总细胞RNA。将该印迹与GFP探针杂交，并与人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）探针（Clontech）再杂交。用于感染的媒介显示在每条车道的上方。对照组，未感染HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞。每个成绩单的预期大小如图所示。。尺寸标记显示在左侧。
从SIN载体感染的细胞中拯救病毒。
为了确定SIN前病毒的5′LTR是否有任何转录活性，我们使用了更敏感的病毒拯救试验。将VSV-G表达结构和包装结构转染到先前感染SIN载体的293T细胞中。如果RNA在SIN前病毒的5′LTR中启动，它将被包装成病毒颗粒并释放到培养基中。然后通过感染原始293T细胞可以检测到这种病毒。结果表明，每毫升可从先前感染LS-CG或CS-CG载体的细胞中挽救3-8时间单位的病毒，而5×104至8×104从用LL-CG或CL-CG载体感染的细胞中拯救TU/ml（表). 由于没有完整的U3序列，特别是在CS-CG的情况下，挽救的病毒不太可能在转染过程中通过重组产生并再生功能性5′LTR。事实上，通过标记拯救试验，用于感染的病毒制剂被证明不含复制能力强的病毒(39). 病毒之所以能够被拯救，大概是因为SIN载体整合在活性细胞启动子附近，并表达前病毒基因组，如CS-G载体所示（表). 根据Northern印迹分析和病毒拯救，SIN前病毒5′LTR的有效转录被灭活。
表3
| 矢量 | 293T细胞滴定（TU/ml）
|
|---|
| 出口1 | 出口2 |
|---|
| LL-CG公司 | 7 × 104 | 5 × 104 |
| CL-CG公司 | 8 × 104 | 7 × 104 |
| LS-CG公司 | 三 | 8 |
| CS-CG公司 | 三 | 三 |
修饰载体的体内递送。
为了在体内转导终末分化神经元，高滴度储备（1×109至2×109TU/ml）的CS-CG和CL-CG载体注射到成年大鼠大脑的纹状体和海马中。同样注射CL-G和CS-G载体，将其归一化为等量的p24抗原，以检测野生型和SIN载体的5′LTR的表达。注射后2周和6周，处死大鼠，冰冻切片并通过荧光显微镜分析GFP的表达。如图所示。CS-CG载体的效率与CL-CG载体相当。有趣的是，CL-G载体也提供了类似的转导效率。这一观察结果与之前的研究一致，这些研究表明HIV-1 LTR通过组成活性NF-κB在神经元中高水平表达(10,25,42). 在注射CS-G载体的大脑中，只有在较高的放大倍数下才能检测到极少数GFP阳性细胞。这很可能是由于前病毒在细胞启动子附近的整合和GFP的表达，如在体外感染中所见。在注射后2周和6周之间，载体的GFP转导频率没有显著差异（数据未显示）。转导细胞的性质通过免疫荧光染色用三种标记物确定：神经元的NeuN、星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞的RIP。结果表明，用每种载体转导的大多数细胞都是表达NeuN的终末分化神经元，这与我们之前的观察一致(4,38,39). 附加免疫荧光染色显示，用CS-CG载体转导的细胞经常被胆碱乙酰转移酶标记，这是胆碱能神经元的标记物（数据未显示）。相反，CL-CG载体转导的细胞很少用这种标记物标记。
注射HIV载体6周后成年大鼠脑纹状体和海马中GFP的表达。切片用碘化丙啶复染。用于注入的矢量显示在左侧。插入，GFP阳性细胞的放大倍数更高。
将CL-CG和CS-CG载体注射到大鼠视网膜下间隙，6周和12周后进行转导评估。视网膜细胞的类型可以通过其在不同视网膜层中的位置和独特的形态很容易识别。在注射野生型载体CL-CG的眼睛中，GFP主要表达于视网膜色素上皮和感光细胞（图。A） ●●●●。另一方面，SIN载体CS-CG不仅可以有效地转导视网膜色素上皮和感光细胞，还可以有效转导内核层中的其他视网膜细胞，包括双极细胞、米勒细胞、水平细胞和无长突细胞（图。B） ●●●●。这一结果以及大脑的结果表明，HIV-1 LTR的转录可能对某些细胞类型中内部启动子的转录具有抑制作用。在注射后6周和12周之间，载体的模式和转导频率没有显著差异（数据未显示）。
注射CL-CG载体（A）和CS-CG载体后12周大鼠幼鼠视网膜中GFP的表达。插图，高倍放大GFP阳性内核层（INL）细胞。比例尺，10μm。视网膜色素上皮；ONL，外核层。
讨论
与其他逆转录病毒（如MLV）不同，HIV-1的特点是其具有复杂的基因组，除了常见的病毒外，还编码两种调节蛋白（Tat和Rev）和四种辅助蛋白（Vif、Vpr、Vpu和Nef）堵住,波尔、和环境价值基因产品。辅助蛋白之一Tat是一种重要的核蛋白，通过增加转录起始和/或延伸来增加病毒RNA的水平（参考文献综述23). 为了显示其功能，Tat与TAR的新生RNA干环结构结合，位于所有病毒转录物的5′端。Tat公司反式据报道，激活还需要TATA盒和5′LTR中的额外序列，包括Sp1和NF-κB的结合位点(2,三,17,22,31,36,41,55). 这与我们的结果一致，即用CMV启动子替换5′LTR的U3区域导致Tat-independent转录（表). 在没有Tat的情况下，这种混合CMV-LTR启动子可以驱动高水平的表达，与有Tat的野生型LTR相比。这允许在没有Tat的系统中生产HIV载体。事实上，Kim等人(26)最近有报道称，含有类似启动子交换的HIV载体可以在没有Tat的情况下产生滴度没有显著降低的病毒。最近的研究表明，在不丧失转导非分裂细胞的能力的情况下，从包装结构中消除所有辅助基因的可能性(24,26,43,56)，尽管某些辅助蛋白似乎需要用于特定组织的最大转导（例如，巨噬细胞的Vpr和肝脏的Vpr和/或Vif）(24,56). 综上所述，这些观察结果表明，除转来自HIV载体生产系统。Rev与载体中的Rev反应元件一起，是将全长载体转录物有效输出到细胞质所必需的。然而，可以用具有类似功能的蛋白质替代Rev功能(28).
HIV-1的转录由5′LTR中的调控序列指导。U3区的核心元件包含一个典型的TATA盒和三个Sp1结合位点，对基础启动子活性和病毒复制至关重要(2,三,17,22,41,55). 紧靠Sp1结合位点上游，NF-κB的串联结合位点构成激活依赖性增强子元件(31,36). 消除所有Sp1和NF-κB结合位点导致病毒复制基本上完全失活(29,44). 虽然已经在NF-κB结合位点上游发现了许多调节转录活性的增强子元件，但它们都不能补偿Sp1和NF-κ的B结合位点的丢失。在本研究所述的SIN HIV载体中，正如预期的那样，缺失了TATA盒以及Sp1和NF-κB的结合位点，导致了体内外感染细胞中前病毒中LTR的转录失活。HIV-1 LTR表达的一个显著方面是在缺乏Tat的情况下其基础活性较低。此外，Tat不被包装成病毒。因此，在大多数感染HIV载体的细胞中，由于缺乏Tat，预计LTR的表达水平较低。然而，我们已经证明了LTR在大脑中的高水平表达（图。)与转基因小鼠在大脑中高水平表达HIV-1 LTR驱动的报告基因的发现一致(10). 据报道，神经元中强烈的HIV-1 LTR启动子活性主要是由于组成型活性NF-κB的存在(25,42). HIV载体的一个安全问题是，前病毒随机整合到宿主基因组中，通过LTR激活原癌基因。在这方面，SIN载体应降低插入激活的可能性。SIN前病毒中LTR的转录失活也应阻止复制活性病毒的动员，并将载体病毒传播的风险降至最低。也可以认为，重组病毒可能通过转染期间的重组而产生，并再生野生型LTR。由于SIN载体与混合CMV-LTR启动子（例如CS-CG）结合，包含一个带有缺失的单一U3区域，病毒生产系统中没有完整的U3序列：用这种载体重组再生野生型U3是不可能的。此外，尽管我们迄今尚未检测到具有复制能力的病毒，但这种组合修饰将重组产生具有复制能力病毒的风险降至最低。
基于MLV的SIN载体的应用受到限制，因为删除TATA盒会导致低滴度(9,20,21,45,53,54). 这可能是因为3′LTR中的TATA盒区域通过二级结构相互作用在病毒RNA的3′端加工中起着重要作用。因此，大多数SIN MLV载体仅在增强子区域缺失，LTR的转录失活相对无效(9,20,45,54). 在HIV-1中，U3区域内的序列，特别是TATA盒和转录起始位点之间的序列，被证明是高效3′端处理所必需的(6,8,13,18,46,47). 这些序列指导裂解和聚腺苷化特异性因子（负责识别AAUAAA六聚体的因子）与聚（A）位点的稳定结合，并提高3′端加工的效率(19). 然而，对转染SIN载体结构的293T细胞的RNA进行的Northern blot分析显示，与野生型载体相比，转录物水平没有降低（数据未显示），与病毒滴度没有显著降低一致（表). 这一发现表明，SIN矢量中U3序列的删除可能不会影响3′端处理的效率。
体内实验结果表明，与野生型载体相比，SIN载体可以提高胆碱能神经元中转基因的表达。类似地，其他视网膜细胞类型也显示SIN载体的转基因表达水平较高（图。). 在某些细胞类型中，内部CMV启动子的表达可能受到HIV-1 LTR表达的负面影响。这种被称为转录干扰的现象在其他逆转录病毒载体中也有报道(1,5,11,14,15,45,50,52). 我们的结果表明，HIV载体中LTR的U3区缺失可能导致一些组织中内部启动子的高效表达。此外，SIN载体对于引入组织特异性或可调节启动子特别有用，因为LTR可能没有顺式-对这些内部启动子的作用影响。SIN-HIV载体不仅应提高HIV载体介导的基因治疗的安全性，而且还应具有将基因高效转导到非分裂细胞中的通用性。
致谢
我们感谢N.Somia和T.Kafri对手稿的批判性阅读。我们感谢Verma和Gage实验室的成员提出的有益建议。
H.M.得到了上原纪念基金会奖学金的支持，M.T.得到了日本眼库协会奖学金的支持。这项工作得到了国家卫生研究院和弗朗西斯·伯杰基金会的资助。I.M.V.是美国癌症学会分子生物学教授。
参考文献
1Armentano D，Yu S-F，Kantoff P W，Ruden T V，Anderson W F，Gilboa E。内部病毒序列对逆转录病毒载体效用的影响。《维罗尔杂志》。1987;61:1647–1650. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Berkhout B、Gatignol A、Rabson A B、Jeang K-T.TAR对HIV-1 LTR的依赖性激活：证明tat需要启动子的特定区域。单元格。1990;62:757–767.[公共医学][谷歌学者] 3Berkhout B，Jeang K-T.TATA启动子和增强子在基础和塔特-诱导人类免疫缺陷病毒1型长末端重复序列的表达。《维罗尔杂志》。1992;66:139–149. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Blömer U，Naldini L，Kafri T，Trono D，Verma I M，Gage F H。用慢病毒载体在成年神经元中高效持续的基因转移。《维罗尔杂志》。1997;71:6641–6649. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Bowtell D D L，Cory S，Johnson G R，Gonda T J。携带两个基因的逆转录病毒载体在造血细胞中表达的比较。《维罗尔杂志》。1988;62:2464–2473. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Brown P H，Tiley L S，Cullen B R。人类免疫缺陷病毒1型长末端重复序列中的有效聚腺苷酸化需要侧翼U3特异性序列。《维罗尔杂志》。1991;65：3340–3343。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Bukrinsky M I、Sharova N、Dempsey M P、Stanwick T L、Bukrinscaya A G、Haggerty S、Stevenson M。人类免疫缺陷病毒1型整合前复合物的主动核导入。美国国家科学院程序。1992;89：6580–6584。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Cherrington J，Ganem D.人类免疫缺陷病毒（HIV）中多聚腺苷化的调节：启动子邻近性和上游序列的贡献。EMBO J。1992;11:1513–1524. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Cone R D，Weber-Benarous A，Baorto D，Mulligan R C。调节由可传播逆转录病毒载体编码的完整人类β-珠蛋白基因的表达。分子细胞生物学。1987;7：887–897。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Corboy J R，Buzy J M，Zink M C，Clements J E。转基因小鼠中枢神经系统中HIV长末端重复序列的直接表达。科学。1992;258:1804–1808.[公共医学][谷歌学者] 11Correll P H，Colilla S，Karlsson S.体内小鼠造血细胞长期表达的逆转录病毒载体设计。鲜血。1994;84:1812–1822.[公共医学][谷歌学者] 12Crystal R G.向人类转移基因：早期教训和成功的障碍。科学。1995;270:404–410.[公共医学][谷歌学者] 13DeZazzo J D，Kilpatrick J E，Imperiale M J。人类免疫缺陷病毒1型mRNA 3′末端形成中长末端重复序列U3与转录控制区重叠的参与。分子细胞生物学。1991;11:1624–1630. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Emerman M，Temin H M。逆转录病毒载体中带有启动子的基因可被表观遗传机制独立抑制。单元格。1984;39:459–467.[公共医学][谷歌学者] 15Emerman M，Temin H M.整合逆转录病毒载体中基因抑制的定量分析。分子细胞生物学。1986;6:792–800. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Frankel A D，Pabo C O。人体免疫缺陷病毒Tat蛋白的细胞摄取。单元格。1988;55:1189–1193.[公共医学][谷歌学者] 17Garcia J A，Wu F K，Mitsuyasu R，Gaynor R B。参与人类免疫缺陷病毒转录调控的细胞蛋白的相互作用。EMBO J。1987;6:3761–3770. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Gilmartin G M，Fleming E S，Oetjen J.体外激活HIV-1前mRNA 3′处理需要上游元件和TAR。EMBO J。1992;11:4419–4428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Gilmartin G M，Fleming E S，Oetjen J，Graveley B R.CPSF对HIV-1信使核糖核酸3′-加工增强子的识别：涉及poly（A）位点定义的多序列接触。基因发育。1995;9:72–83.[公共医学][谷歌学者] 20Guild B C，Finer M H，Housman D E，Mulligan R C。体内培养的小鼠胚胎细胞和造血细胞中用于表达基因的逆转录病毒载体的开发。《维罗尔杂志》。1988;62:3795–3801. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Hawley R G、Covarrubias L、Hawley T、Mintz B。残疾逆转录病毒载体可有效将外源基因导入造血干细胞。美国国家科学院程序。1987;84:2406–2410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Jones K A，Kadonaga J T，Luciw P A，Tjian R.通过细胞转录因子Sp1激活艾滋病逆转录病毒启动子。科学。1986;232:755–759.[公共医学][谷歌学者] 23Jones K A，Peterlin B M.控制HIV-1启动子处的RNA启动和延伸。生物化学年度收益。1994;63:717–743.[公共医学][谷歌学者] 24Kafri T，Blömer U，Peterson D A，Gage F H，Verma I M。慢病毒载体直接将基因持续表达至肝脏和肌肉。自然遗传学。1997;17:314–317.[公共医学][谷歌学者] 25Kaltschmidt C、Kaltschmisdt B、Neumann H、Wekerle H、Baeuerle P A。神经元中的组成性NF-κB活性。分子细胞生物学。1994;14:3981–3992. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Kim V N、Mitrophanous K、Kingsman S M和Kingsman A J.基于人类免疫缺陷病毒1型的慢病毒载体的最低要求。《维罗尔杂志》。1998;72：811–816。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Kimpton J，Emerman M.基于整合的β-半乳糖苷酶基因激活的敏感细胞系检测复制能力和假型人类免疫缺陷病毒。《维罗尔杂志》。1992;66：2232–2239。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Krug R M.从细胞核向细胞质输出mRNA的调节。当前Opin细胞生物学。1993;5:944–949.[公共医学][谷歌学者] 29Leonard J、Parrott C、Buckler-White A J、Turner W、Ross E K、Martin M A、Rabson A B。人类免疫缺陷病毒1型长末端重复序列中的NF-κB结合位点对病毒感染性无需。《维罗尔杂志》。1989;63:4919–4924. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Lewis P，Hensel M，Emerman M。人类免疫缺陷病毒感染的细胞在细胞周期中被阻止。EMBO J。1992;11:3053–3058. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Liu J，Perkins N D，Schmid R M，Nabel G J。特定NF-κB亚单位与塔特刺激人类免疫缺陷病毒1型转录。《维罗尔杂志》。1992;66:3883–3887. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32米勒·A·D·人类基因治疗已经成熟。自然。1992;357:455–460.[公共医学][谷歌学者] 33Miyoshi H，Takahashi M，Gage F H，Verma I M。使用基于HIV的慢病毒载体将稳定有效的基因转移到视网膜中。美国国家科学院程序。1997;94:10319–10323. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Morgan R A，Anderson W F。人类基因治疗。生物化学年度收益。1993;62:191–217.[公共医学][谷歌学者] 35Mulligan R C.基因治疗的基础科学。科学。1993;260:926–932.[公共医学][谷歌学者] 36Nable G，Baltimore D.一种诱导转录因子激活T细胞中人类免疫缺陷病毒的表达。自然。1987;326:711–713.[公共医学][谷歌学者] 37Nabel G J，Rice S A，Knipe D M，Baltimore D。T细胞中人类免疫缺陷病毒增强剂激活的替代机制。科学。1988;239：1299–1302。[公共医学][谷歌学者] 38Naldini L，Blömer U，Gallay P，Ory D，Mulligan R，Gage F H，Verma I M，Trono D。慢病毒载体对非分裂细胞的体内基因传递和稳定转导。科学。1996;272:263–267.[公共医学][谷歌学者] 39Naldini L，Blömer U，Gage F H，Trono D，Verma I M。注射慢病毒载体的成年大鼠大脑中转基因的高效转移、整合和持续长期表达。美国国家科学院程序。1996;93:11382–11388. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Niswender K D、Blackman S M、Rohde L、Magnuson M A、Piston D W。培养细胞中绿色荧光蛋白的定量成像：显微技术的比较、融合蛋白的使用和检测限。《显微镜杂志》。1995;180:109–116.[公共医学][谷歌学者] 41Olsen H S，Rosen C A.塔塔图案对塔特-人类免疫缺陷病毒基因表达的介导转录激活。《维罗尔杂志》。1992;66:5594–5597. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Rattner A、Korner M、Walker M D、Citri Y。NF-κB激活神经元中的HIV启动子。EMBO J。1993;12:4261–4267. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Reiser J、Harmison G、Kluepfel-Stahl S、Brady R O、Karlsson S、Schubert M。使用假型缺陷高滴度HIV 1型颗粒转导非分裂细胞。美国国家科学院程序。1996;93:15266–15271. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Ross E K、Buckler-White A J、Rabson A B、Englund G、Martin M A。NF-κB和Sp1结合基序对人类免疫缺陷病毒1型复制能力的贡献：病毒生长的不同模式由T细胞类型决定。《维罗尔杂志》。1991;65:4350–4358. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Soriano P，Friedrich G，Lawinger P。逆转录病毒载体中引入成纤维细胞和胚胎干细胞的启动子相互作用。《维罗尔杂志》。1991;65:2314–2319. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Valsamakis A，Zeichner S，Carswell S，Alwine J C.人类免疫缺陷病毒1型多腺苷酸化信号：有效多腺苷酸化所需的AAUAAA上游3′长末端重复元件。美国国家科学院程序。1991;88:2108–2112. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Valsamakis A，Schek N，Alwine J C.人类免疫缺陷病毒多聚腺苷酸化信号中AAUAAA上游的元素是体外有效多聚腺苷酸化所必需的。分子细胞生物学。1992;12:3699–3705. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 48Verma I M，Somia N.基因治疗：承诺、问题和前景。自然。1997;389：239–242。[公共医学][谷歌学者] 49Weinberg J B、Matthews T J、Cullen B R、Malim M H。非增殖人类单核细胞的1型生产性人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染。《实验医学杂志》。1991;174:1477–1482. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Williams D A，Orkin S H，Mulligan R C.逆转录病毒介导的人类腺苷脱氨酶基因序列转移到培养细胞和体内小鼠造血细胞中。美国国家科学院程序。1986;83:2566–2570. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Wu Q，Chen M，Buchwald M，Phillips R A.从动物组织中提取高质量基因组DNA的简单、快速方法。核酸研究。1995;23:5087–5088. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Xu L，Yee J-K，Wolff J A，Friedmann T。影响Moloney小鼠白血病病毒载体长期稳定性的因素。病毒学。1989;171:331–341.[公共医学][谷歌学者] 53Yee J-K，Moores J C，Jolly D J，Wolff J A，Respess J G，Friedmann T。转录失活逆转录病毒载体的基因表达。美国国家科学院程序。1987;84:5197–5201. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 54Yu S-F，Rüden T V，Kantoff P W，Garber C，Seiberg M，Rü）ther U，Anderson W F，Wagner E F，Gilboa E.设计用于将整个基因转移到哺乳动物细胞的自失活逆转录病毒载体。美国国家科学院程序。1986;83:3194–3198. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Zeichner S L，Kim J Y H，Alwine J C.人类免疫缺陷病毒1型长末端重复序列转录活性的Linker扫描突变分析。《维罗尔杂志》。1991;65:2436–2444. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Zufferey R，Nagy D，Mandel R J，Naldini L，Trono D。多重减毒慢病毒载体实现了体内高效基因传递。国家生物技术。1997;15:871–875.[公共医学][谷歌学者] 
