牛疱疹病毒1潜伏相关基因编码的蛋白在潜伏感染牛的三叉神经节神经元中表达并在生产性感染过程中与细胞周期蛋白依赖激酶2相互作用

细胞提取物的制备。

如前所述制备全细胞裂解物和核提取物(11,12,24).

抗体、免疫沉淀和蛋白质印迹分析。

P2抗体针对LR开放阅读框2的氨基末端(11)P2血清中的免疫球蛋白G（IgG）部分在蛋白a柱上纯化。针对cdk2（sc-163）、cdk4（sc-260）、cdk7（sc-529）、cdc2（sc-54）、cyclin A（sc-239和sc-437）和cyclin E（sc-198和sc-247）的抗体购自圣克鲁斯生物科技公司（加州圣克鲁斯）。针对BHV-1编码糖蛋白D的单克隆抗体来自S.Srikumaran（内布拉斯加州大学）。

用150μg细胞裂解液在4°C下进行免疫沉淀3至4小时；使用1μg抗体。用蛋白A-Sepharose珠（Bio-Rad）沉淀免疫复合物，并用洗涤缓冲液（10mM Tris-HCl[pH 8.0]、50mM NaCl、1mM EDTA、0.5%Nonidet P-40）洗涤四次(12,24). 在1×激酶缓冲液（50 mM Tris，25 mM醋酸镁，2.5 mM EDTA）中洗涤免疫复合物，并将颗粒重新悬浮在10μl相同缓冲液中。如前所述进行蛋白质印迹分析(11,12,24).

质粒。

质粒pcDNA3 LRT（LRT）含有完整的2.0-kb LR基因。pcDNA3轻轨ΔSph（LRTΔSph）缺少1-kb速度包含LRP编码序列的I片段。这些结构包含在pcDNA3（Invitrogen）中，并在其他地方详细描述(11,24).

cdk活性的测量。

含有10μCi的[γ]cdk反应混合物-³²P] ATP，0.1 M ATP，1.5μg谷胱甘肽秒-转移酶（GST）–Rb融合蛋白（Rb-SE；见下文），酶活性如前所述(12). 在30°C下30分钟后，通过添加25μl十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加载缓冲液停止反应。用SDS-PAGE分析反应产物；凝胶干燥后进行放射自显影。激酶活性用荧光成像仪（分子动力学）测量。GST-Rb构建物Rb-SE，包含Rb的C末端结构域（氨基酸768-928）融合到GST，从J.Wang（加州大学圣地亚哥分校）获得(30).

用亲和矩阵沉淀cdk络合物。

细胞裂解物（300μg蛋白质）或柱级分与50μl p13一起孵育^例如1珠子（Upstate Biotechnology，Lake Placid，N.Y.）或25μl p9^{CKShs1号机组}琼脂糖珠（Calbiochem）在4°C下摇晃过夜。在4°C下，在洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH8.0]，50 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5%Nonide P-40）中洗涤珠子两次5 min。将与珠结合的蛋白质在SDS-PAGE缓冲液中煮沸5分钟，然后进行SDS-PACE（10%凝胶）；用所示抗体进行免疫印迹。

从感染的MDBK细胞中部分纯化LRP。

MDBK单元（共5×10⁹500个100毫米的电池²组织培养皿）感染BHV-1 36至48小时，用橡皮警察刮取，离心造粒，用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。将填充的细胞重新悬浮在低渗缓冲液中（10 mM HEPES[pH7.9]，10 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，0.2 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，0.5 mM二硫苏糖醇[DTT]，大豆胰蛋白酶抑制剂、亮氨酸蛋白酶和抑肽酶各0.1μg/ml），超声处理，离心。将颗粒重新悬浮在高渗缓冲液（含0.4 M KCl、0.2 mM EDTA和25%甘油的低渗缓冲液）中，并对细胞进行超声处理。离心后，将细胞重新悬浮在高渗缓冲液中，并重复超声处理。将超声处理所得的三种上清液混合，用低渗缓冲液将盐浓度调节至100 mM KCl，并在4°C下通过离心澄清提取物（使用JA-20转子在J2-21贝克曼离心机中18000 rpm离心15 min）。

将提取物应用于40 ml DEAE-Sepharose柱（Sigma），该柱在加载缓冲液（含有100 mM KCl、0.2 mM EDTA和10%甘油的低渗缓冲液）中平衡。用负载缓冲液洗涤后，用KGED缓冲液（10 mM KH）在7 ml组分中洗脱结合蛋白（包括LRP）₂人事军官₄-纳₂高性能操作₄【pH 7.0】、0.2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、0.5 mM DTT、5%甘油、大豆胰蛋白酶抑制剂、亮氨酸蛋白酶和抑肽酶每毫升0.1μg、250 mM KCl）。280 nm（OD）处的光密度₂₈₀)已确定；使用P2抗体通过Western blot分析鉴定含有LRP的组分。

含LRP的级分在KGED缓冲液中透析，然后加载到5-ml Econo S柱（Bio-Rad）上，该柱在KGED缓冲液中平衡。用TGED缓冲液（每毫升40 mM Tris-HCl[pH7.8]、0.2 mM EDTA、0.2 mM-PMSF、0.5 mM DTT、10%甘油、0.1μg大豆胰蛋白酶抑制剂、亮氨酸蛋白酶和抑肽酶）对柱进行广泛清洗。用含有100 mM KCl的TGED缓冲液洗脱结合蛋白，并收集2 ml组分。使用P2抗体通过Western blot分析鉴定含有LRP的组分。

含有LRP的组分经TGED缓冲液透析，然后装入2ml肝素-淀粉亲和柱（Bio-Rad），该亲和柱与TGED缓冲溶液平衡。用TGED缓冲液对色谱柱进行广泛清洗后，用含有100 mM KCl的TGED缓冲溶液洗脱蛋白质，并收集1 ml组分。

小牛TG神经元LRP的表达。

因为LR-RNA是潜伏感染神经元中唯一大量表达的病毒转录物(23)，我们有兴趣确定LRP是否在潜伏感染小牛的TG神经元中表达。两头小牛感染BHV-1达90天，然后按上述方法收集TG(25). 作为对照，从两个未感染的小牛身上采集TG。用石蜡包埋的TG制备薄片。在90dpi时，LR-RNA很容易被检测到，但在85或90dpi时，在眼拭子中没有检测到感染性病毒。TG中还检测了BHV-1糖蛋白D的表达，以确认小牛是潜在感染。在感染BHV-1 24小时的MDBK细胞中检测到糖蛋白D的高水平表达（图。​（图2A）2A） 但在模拟感染细胞中没有（图。​（图2B）。2B） ●●●●。在感染90天的小牛TG中，神经元中未检测到糖蛋白D（图。​（图2C2C和D）。另一只潜伏感染的小牛也得到了相同的结果，未感染小牛的TG中未检测到特异性染色(31). 总之，这些研究表明，通过眼和鼻滴注感染BHV-1的小牛在90dpi时潜伏感染。

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图2

90dpi时小牛TG中糖蛋白D的分析。将感染BHV-1 24 h的MDBK细胞（A）或模拟感染的MDBK细胞（B）固定并染色。从潜伏感染的小牛（C和D）身上制备薄片。随后用针对糖蛋白D的单克隆抗体对样品进行染色。放大倍数：×59（a至C）和×148（D）。

在90 dpi时，P2抗体与两只小牛TG内的一些神经元核发生特异性反应（图。​（图3A三A和B）。潜伏感染犊牛约10%的TG神经元表达LRP。相反，P2抗体与从两个未感染小牛身上制备的TG薄片没有特异性反应（图。​（图3C三C或D）。未感染小牛的一些神经元有深色细胞核，这是核仁反染的结果，而不是因为抗体与神经元蛋白发生交叉反应。通过在高倍或低倍镜下检查薄片，核仁的反染色很容易与P2阳性神经元区分开来（图。​（图4）。4). P2阳性染色导致整个细胞核的红棕色染色，而核仁复染为蓝色或紫色。因此，在潜伏感染小牛的TG中，LRP在一组神经元的细胞核中检测到。

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图3

90 dpi时TG神经元LRP的检测。取两个不同的潜伏感染小牛（A和B）或两个不同未感染小牛的薄片（C和D）。用P2抗血清中的IgG检测LRP。箭头表示细胞核被P2抗体特异染色的神经元。放大倍数：所有面板×59。

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图4

潜伏感染牛神经元LRP的检测。薄片是从两个不同的潜伏感染小牛（B到D；面板B和C中的切片来自同一小牛）或一个未感染小牛上制备的。用P2抗血清中的IgG检测LRP。箭头表示细胞核被P2抗体特异染色的神经元。放大倍数：×148（A和B）和×236（C和D）。图中的截面与图中的不同。​图3三.

LRP与cdk-cyclin复合物的相互作用。

虽然先前的研究表明LRP与细胞周期蛋白a结合(24)，目前尚不清楚LRP是与cdk2或cdc2细胞周期蛋白a复合物结合，还是仅与细胞周期蛋白a结合。通过使用p13分析LRP与cdk2或cdc2细胞周期蛋白复合物相互作用的能力^例如1或p9^{CKShs1号机组}分别交联到琼脂糖或琼脂糖。第13页^例如1是一个葡萄裂殖酵母与酵母cdc2蛋白特异结合的蛋白质(三,8). 第9页^{CKShs1号机组}是一种特异性结合cdk2但不容易结合cdk4或cdk6的人类蛋白质(2). 最初的实验是为了评估cdk2、cdc2、cdk4或cdk7对p13的亲和力^例如1或p9^{CKShs1号机组}这些研究使用从U2-OS细胞制备的核提取物，因为先前的研究表明LR基因产物抑制这些细胞中的S期进入(24). 第13页^例如1或p9^{CKShs1号机组}珠子有效结合cdk2和cdc2，但不结合cdk7（图。​（图5）。5). 如前所述(2)，第13页^例如1弱结合cdk4但p9^{CKShs1号机组}没有。Cdk7不与任一亲和矩阵结合。因此，这两个亲和矩阵都是特定的探针，可用于测试LRP是否与cdk2或cdc2-cyclin复合物相关。

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图5

cdk与p9的相互作用^{CKShs1号机组}或p13^例如1U2-OS细胞的核提取物（250μg蛋白质）与p9孵育^{CKShs1号机组}（第9页）或第13页^例如1（第13页）珠子。用结合缓冲液洗涤三次（每次洗涤1ml）后，将与珠结合的蛋白质进行SDS-PAGE（10%凝胶）。使用材料和方法中描述的特定抗体检测cdk。粗提取物（25μg）作为对照（C）。左边的数字代表分子量标记的位置（单位为千道尔顿）。箭头指示cdk的位置。

LRP由p9沉淀^{CKShs1号机组}或p13^例如1当珠子与转染LRT的U2-OS细胞制备的核提取物孵育时（图。​（图6A6分别为A或B）。在一些实验中，来自转染细胞的细胞质提取物含有由p9沉淀的LRP^{CKShs1号机组}或p13^例如1可以想象，LRP在某些核提取物的制备过程中从核中泄漏出来，但在其他过程中没有。正如预期的那样，转染LRTΔSphI或模拟转染细胞的U2-OS细胞没有表达p13沉淀的40-kDa蛋白^例如1或p9^{CKShs1号机组}并被P2抗体识别。当MDBK细胞感染BHV-1 36 h时，p9沉淀核提取物中的LRP^{肌酸激酶1}或p13^抽吸1（图。​（图6C6C和D）。相反，空白珠与cdk-LRP复合物没有相互作用。用针对这些蛋白的抗体或用cdk4或cyclin D1融合蛋白的GST下拉试验来证明LRP与cdk4或D型细胞周期蛋白结合的尝试均未成功。总之，这些研究表明LRP与cdk2或cdc2-cyclin复合物有关。

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图6

LRP与p9的相互作用^{CKShs1号机组}或p13^例如1在转染或感染的细胞中。U2-OS电池（2×10⁶细胞/100-mm培养皿）转染15μg表达LR基因产物（LRT）的质粒或缺乏LR编码序列（LRTΔSphI）的突变体(24). 转染48小时后，制备细胞质提取物（C道）或核提取物（N道），并用p9培养300μg蛋白质^{CKShs1号机组}（A） 或p13^例如1（B） 珠子。通道B，用空白Sepharose珠培养样品。感染BHV-1（2 TCID）的模拟感染MDBK细胞（Mock）或MDBK₅₀/36小时（36小时pi）也用于这些研究（C或D）。核提取物与p9孵育^{CKShs1号机组}（C） 或p13^例如1（D） ●●●●。提取物与空白珠（−）或与珠交联的相关蛋白（+）孵育。用含有100 mM NaCl的PBS广泛清洗珠子后，对沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE（10%凝胶），并用P2抗体检测LRP（箭头）。

用P2抗体免疫沉淀感染MDBK细胞的核提取物，并用GST-Rb融合蛋白检测cdk活性。Rb被用作底物，因为它在体外可被所有cdk有效磷酸化，但不能被其他常见蛋白激酶磷酸化（参考文献综述28和29). GST-Rb融合蛋白（图。​（图7a，7a、 P2抗体免疫沉淀感染MDBK细胞制备的核提取物时，磷酸化的不是GST蛋白（lane G），而是lane H）。正常兔血清在未感染（A和B道）或感染（E和F道）细胞中没有免疫沉淀cdk活性。此外，P2抗体没有免疫沉淀未感染细胞（C区和D区）的cdk活性。

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图7

用P2抗体免疫沉淀cdk活性。（a） 从模拟感染的MDBK细胞（泳道a至D）或36hpi（泳道E至H）制备核提取物。核提取物（100μg蛋白质）与免疫前兔血清（A、B、E和F道）的IgG或P2抗血清（C、D、g和H道）的免疫沉淀。洗涤免疫沉淀物后，[γ-³²P] 将ATP（10μCi）和1.5μg的GST-Rb（B、D、F和H）或1.5μg GST融合蛋白（A、C、E和g）添加到免疫沉淀中。（b） 用LRTΔSphI（A和b道）或LRT（C和D道）转染U2-OS细胞。用P2抗血清中的IgG免疫沉淀细胞核提取物（100μg蛋白质）。清洗免疫沉淀物后，[γ-³²P] 将ATP（10μCi）和1.5μg GST（A或C）或GST-Rb（B或D）添加到免疫沉淀中。所有蛋白激酶反应均按照材料和方法进行。

用P2抗体免疫沉淀后，从转染LRT的U2-OS细胞制备的核提取物也能磷酸化GST-Rb，但不能磷酸化GST（图。​（图7b，7b、 车道D和C）。相反，转染LRTΔSph的U2-OS细胞制备的核提取物在与P2抗体免疫沉淀后（A和B道）不能磷酸化Rb-GST或GST。总之，这些研究表明P2抗体沉淀了一种蛋白激酶，磷酸化了已知的cdk底物Rb。这一发现与LRP与cdk2或cdc2-cyclin复合物相关的结论一致。

前三位作者对这项工作贡献均等。

这项研究得到了美国农业部（9402117和9702394）和生物技术中心的资助。

我们感谢Jean Wang（UCSD）编码GST-Rb和S.Srikumaran的质粒，以及针对BHV-1 gD的单克隆抗体。我们也感谢Fernando Osorio和Charles Wood对原稿进行了批判性审查。