在高等真核生物中，DNA复制和基因表达在一定程度上是通过DNA结合蛋白的作用来调节的。对真核病毒的研究为这些机制提供了重要的新见解，并表明这两个过程是相关的。来自病毒系统的证据表明，细胞或病毒来源的转录因子可以直接参与DNA复制(70). 转录因子的类似作用已在酿酒酵母(70). 转录因子似乎通过与复制蛋白直接相关或通过改变起源周围的整体结构在复制中发挥作用(70). 有趣的是，作为对病毒蛋白（如EB病毒Zta蛋白和乳头瘤病毒E2蛋白）的突变研究，调节复制增强的并不是反式激活过程本身，已经证明，在瞬时转染分析（称为瞬时分析）中，复制和反式激活功能是可分离的(1,10,19,25,50,51). 这表明这两个过程可能相互独立地发挥作用，并且可能在病毒复制周期的不同阶段需要。对致癌人乳头瘤病毒（HPV）类型E2蛋白的复制和反式激活功能的检测为这两个过程的关系提供了重要的见解。
HPV诱导良性鳞状上皮肿瘤，在某些情况下可能发展为癌(72,73). 在基底细胞感染后，HPV基因组以多拷贝核质粒的形式稳定存在，并且只表达早期病毒基因。病毒生命周期的完成需要感染角质形成细胞的分化，这导致病毒拷贝数的扩增和晚期病毒启动子的激活。这些晚期启动子引导衣壳蛋白L1和L2以及丰富的病毒E1∧E4蛋白的表达，这些蛋白可能在病毒逃逸中起作用(31,38). 由于缺乏用于分析病毒生命周期的遗传系统，触发这些过程的分子事件尚未确定。最近从转染的克隆DNA模板合成HPV病毒的成功现在允许对这些机制进行详细的研究(22,23).
一些研究小组的研究表明，乳头瘤病毒E2蛋白可以作为病毒基因表达和复制的调节器。最初的研究使用牛乳头瘤病毒1型（BPV1）来表明E2是病毒DNA瞬时复制和病毒在转化细胞中稳定维持所必需的(14,15,47,69). E2蛋白形成二聚体，与ACCN序列的回文DNA特异结合6GGT，在乳头瘤病毒的调节区域存在多个拷贝(40,60). E2通过与病毒E1蛋白形成复合物增强病毒DNA的复制，E1蛋白具有复制起始蛋白的特性(61). 体外和体内研究表明，E2与E1的结合增加了E1对来源识别的特异性(8,20,36,39,43,54,55,63,71). BPV1 E2蛋白首先被描述为一种增强子结合蛋白，在瞬时分析中可以刺激位于异源启动子上游的多聚E2结合位点的转录(三,27,58). 随后的研究表明，几个早期BPV1启动子通过E2以结合位点依赖的方式被激活(26,28,57,64). 交易能力被证明对BPV1转化细胞至关重要(10,14,15,47,52).
虽然HPV与牛病毒有一些相似之处，但两组之间存在显著差异。致癌生殖器HPV在靶向组织和转录控制方面与BPV1不同。生殖器HPV的主要早期启动子（在HPV16和HPV31中标记为P97）位于E6基因上游的上游调控区（URR）。它的活性完全依赖于细胞转录因子，并通过各种选择性剪接的多顺反子mRNA指导早期基因的表达(31,38). URR的组织在生殖器HPV中高度保守，在P97 TATA盒上游含有两个E2结合位点以及上游的另外两个位点(65). 在瞬时表达分析中，E2与P97近端位点的结合可以下调P97活性，并提供调节癌蛋白E6和E7以及复制蛋白水平的方法(6,13,49,65–67). 此外，低浓度E2被认为通过启动子远端E2结合位点弱激活P97转录(9,59). 与BPV1 E2蛋白一样，HPV E2蛋白可以强烈激活合成启动子的转录，该启动子由多聚E2结合位点与最小启动子融合而成(11,29,35,45,50,68).
E2反式激活功能的保守性表明，它在病毒生命周期中具有重要功能，但迄今为止尚未在致癌HPV中确定E2反义激活功能的靶点。在瞬时检测中，BPV1和HPV16 E2的反式激活和复制功能可以通过E2氨基末端结构域的突变来分离(1,10,19,25,50). 尽管这两种活性是可分离的，但它们都存在于乳头瘤病毒中高度保守的氨基酸残基中。在本研究中，我们试图通过基因分析确定E2转录激活在致癌HPV生命周期中的作用。我们发现，表达反式激活缺陷但具有复制能力的E2蛋白的病毒基因组可以在NHK中建立为外显体，并且能够诱导分化后的后期病毒功能。这表明E2的反式激活在致癌HPV的病毒生命周期中不是一个基本功能。
材料和方法
重组质粒。
质粒pUKHPV31包含克隆到生态修饰的pUC18质粒的RI位点(34). E2基因的突变是通过变色龙突变试剂盒（Stratagene）和含有E2基因特定突变的引物引入的。pHPV31 E2:EN20包含核苷酸（nt）2750（G到A）和2752（A到C）的突变，pHPV21 E2:RK37包含nt 2801和2802（CG到AA）的突变。序列分析证实了所有突变。质粒pRP742包含克隆到巴姆pcDNAII（Invitrogen）的HI位点，之前已经描述过(34). 质粒pRPA31L1由克隆到pSP72（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）中的HPV31 nt 5521至5703组成，之前已进行过描述(62). HPV31 E1和E2表达载体以pSG5（Stratagene）为基础，已在前面进行了描述(21). 为了便于突变E2基因的亚克隆，用巴姆HI来自pSG31E2，然后克隆到Bgl公司II位pSG5，产生pSBE2。E2突变体EN20、RK37和EQ39（见结果）通过PCR从突变体基因组中扩增，用于替换巴姆HI（高）-Acc公司pSBE2中的B7I片段，并重新测序。E2突变体IL73作为Acc公司B7I公司-生态RI片段（HPV31 nt 2865至3361）进入pSXE2。质粒pSXE2是pSG31E2的衍生物，通过去除生态通过部分消化和删除Aat公司二-不适用I片段来自pSG31E2中的载体主干。质粒pGL31URR含有HPV31 nt 7067至107，通过PCR使用含有Mlu公司我和Xho公司I限制站点并插入Mlu公司我/Xho公司I-消化pGL3碱性（Promega）。荧光素酶报告质粒p6XE2BS-luc是通过将含有HPV31 E2BS3和E2BS4的寡核苷酸（5′GCGTGACCGAAAGTGGTGAACGTTTTCGGGGTGCGC-3′）插入到Mlu公司最小猴病毒40（SV40）早期启动子（Promega）上游质粒pGL3启动子的I位点。
含HPV31的人角质形成细胞的产生、培养和诱导分化。
从克隆技术公司（加利福尼亚州圣地亚哥）购买的NHK在KGM（克隆技术公司）中生长，并在第2代转染重新鉴定的HPV31 DNA或突变的病毒DNA和pSV2neo DNA，如前所述(23). 用每毫升200μg的Geneticin（Gibco BRL）在添加了5 ng表皮生长因子的E-培养基中对丝裂霉素处理的成纤维细胞饲养细胞进行7至10天的筛选，并扩增耐药克隆。用来自两个不同供体的细胞重复三次生成稳定的细胞系，以确保重复性。如前所述，在不添加蛋白激酶C活化剂的情况下培养器官型筏培养物(23,41,42).
瞬时荧光素酶表达测定。
SCC-13细胞来源于脸颊鳞状细胞癌，并在成纤维细胞饲养细胞存在的情况下维持在E培养基中。约2.5×105转染前一天接种SCC-13或NHK细胞。第二天，根据制造商的建议，通过使用15μl OptiMEM（Gibco BRL）中的脂质内酰胺或NHK的KGM（克隆技术），用0.5μg p6XE2BS-luc和0.1μg pSG5或相应的E2表达载体转染细胞。第二天，更换培养基，将细胞再培养24小时。用冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，然后添加350μl冷荧光素酶提取缓冲液（0.1 M磷酸钾[pH7.8]，1%Triton X-100，1 mM二硫苏糖醇[DTT]）进行裂解。通过离心（Eppendorf Microfuge；16000×克如制造商手册所述，在Monolight 2010光度计（分析发光实验室）中测量2至5μl。
凝胶阻滞分析。
SCC-13电池（6×105)在转染前一天接种，并在第二天如上所述用2μg pSG5或E2表达载体转染。在转染后44小时收集细胞，并按照之前所述制备全细胞裂解物(33)稍作修改。简单地说，用冷PBS清洗细胞，然后在PBS中刮入Microfuge管并通过离心收集（Eppendorf Microfuge；16000×克，30秒，4摄氏度）。将细胞颗粒重新悬浮在20μl裂解缓冲液中（10 mM HEPES[pH7.9]，500 mM KCl，50 mM NaF，0.5 mM Na哦-钒酸盐、0.2 mM EDTA、1 mM DTT、20%甘油、蛋白酶抑制剂混合物[Boehringer Mannheim]）。通过在干燥的冰乙醇浴中培养试管，然后在37°C下培养2分钟，制备裂解液。在Eppendorf Microfuge（16000×克，5分钟，4°C）。上清液在10 mM HEPES（pH 7.9）–125 mM KCl–50 mM NaF–0.5 mM Na中稀释哦-钒酸盐–0.2 mM EDTA–1 mM DTT–20%甘油–蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Boehringer Mannheim），snap冷冻，储存于−80°C。凝胶阻滞分析采用20000 cpm的32P-end标记的含有E2BS4的双链寡核苷酸（HPV31 nt 45至70）。结合反应混合物获得了布拉德福德试验测定的等量蛋白质。反应在10 mM HEPES（pH 7.9）–100 mM KCl–1.4 mM DTT–10%甘油–50μg热变性鲱鱼精子DNA/ml–100μg聚（dI-dC）（法玛西亚）/ml–5 mM NaF–0.2 mM Na中进行哦-钒酸盐在室温下放置15分钟。配合物在4%的聚丙烯酰胺凝胶（37.5:1）中分离，在200 V的0.25×三硼酸盐-EDTA中。凝胶干燥并进行自动射线照相。
瞬时复制分析。
约6×105转染前一天将SCC-13细胞接种到直径为60mm的培养皿中。如上所述，通过使用0.5μg pGL31URR、1μg pSG31E1和0.1μg各自E2表达载体转染细胞。第二天，将转染细胞分成直径为100 mm的培养皿，再培养48 h。使用Hirt程序纯化低分子量DNA(30)经过以下修饰：用50μg蛋白酶K/ml在400 mM NaCl–10 mM EDTA–10 mM Tris-HCl（pH 7.5）–0.2%十二烷基硫酸钠（SDS）中于55°C下消化细胞颗粒3小时；将NaCl加入1M中，在4°C下沉淀高分子量DNA过夜，然后离心（60分钟，4°C，16000×克). 上清液在用异丙醇沉淀之前，用酚-氯仿-异戊醇萃取一次，用氯仿萃取一次。每个样品用5 U的Dpn公司一、 15 U，共血红蛋白一、 在Southern分析之前，每毫升50μg RNase A持续5小时。用pGL31URR的一个片段对Southern blots进行了探测，该片段包含与荧光素酶基因相连的HPV31片段。用不同的DNA制剂重复转染四次。
Southern杂交分析。
通过蛋白酶K和核糖核酸酶A消化、酚氯仿提取和乙醇沉淀分离细胞株的总细胞DNA。消化后的DNA在0.8%琼脂糖凝胶中分离，并转移到GenescreenPlus膜（NEN Dupont）。使用随机定时DNA检测特定片段（HiPrime试剂盒；Boehringer Mannheim）。杂交在50%甲酰胺–4×SSPE–5×Denhardt溶液–1%十二烷基硫酸钠–20μg鲑鱼精子DNA/ml，42°C过夜（1×SSPE为0.18 M NaCl，10 mM NaH2人事军官4和1 mM EDTA（pH 7.7））。在室温下在2×SSC–0.1%十二烷基硫酸钠中洗涤两次斑点，然后在0.1×SSC-0.1%十二烷基苯磺酸钠中洗涤二次，然后在50°C的0.1×SSC-1%十二烷基磺酸钠中洗涤一次（1×SSC是0.15 M氯化钠加0.015 M柠檬酸钠）。斑点通过放射自显影术进行可视化，并通过磷光成像进行定量（Molecular Dynamics Inc.）。
核糖核酸酶保护分析。
用Trizol试剂（Gibco BRL）从含有角质形成细胞的HPV31中分离出总细胞RNA。沉淀的RNA颗粒与250000 cpm反义杂交32从线性化的pRP742或pRPA31L1转录的P标记核糖探针，置于10μl 40 mM PIPES（pH 6.4）–400 mM NaCl–1 mM EDTA–80%甲酰胺中，37°C过夜[PIPES为哌嗪-N个,N个′-双（2-乙磺酸）]。RNase消化通过添加300μl 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）–300 mM NaCl–5 mM EDTA进行，其中每ml含有10μg RNase A和30 U RNase T1；在37°C下消化60分钟。将SDS添加到0.2%和400μg/ml蛋白酶K中，然后在37°C下消化15分钟，即可停止RNase反应。然后用酚-氯仿提取样品并用乙醇沉淀，然后在甲酰胺负载缓冲液中再悬浮，并在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行拆分。干凝胶通过放射自显影术进行可视化，并通过磷光成像进行定量。
原位杂交。
对用4%多聚甲醛固定的石蜡包埋的筏组织切片进行5μm厚的DNA原位杂交分析。根据制造商的说明，使用致病基因HPV原位筛选分析（酶诊断）进行杂交分析。对扩增DNA的细胞进行定量，如下所示：对10个随机选择的场（放大倍数×200）中的阳性细胞进行计数，并以每个显微镜场的平均数表示。
免疫组织化学。
用二甲苯和乙醇梯度对固定在4%多聚甲醛中的石蜡包埋筏组织横截面（5μm厚）进行脱蜡。组织切片在37°C下用100μg/ml的蛋白酶（Boehringer Mannheim）在PBS中消化5分钟。然后在室温下将切片在含有1%Triton X-100和1%牛血清白蛋白的1×PBS中封闭1h。用亲和纯化的兔多克隆抗体孵育切片，检测HPV31 E1∧E4蛋白(46)在室温下，在封闭溶液中稀释至1:100，保持1小时。采用异硫氰酸荧光素-驴抗兔多克隆抗体（Amersham）进行二级抗体检测。结果用奥林巴斯BH-2显微镜和荧光素显微镜过滤器进行可视化。
结果
HPV31 E2的瞬时复制和反式激活功能可以通过单个氨基酸突变来分离。
为了研究致癌HPV31 E2蛋白的反式激活和复制功能的作用，我们在HPV31 E2基因产物中的保守氨基酸20、37、39和73处产生突变（突变体EN20、RK37、EQ39和IL73）（图。). 以前的报道表明，BPV1和HPV16 E2的瞬时反式激活和复制功能可以通过E2氨基末端结构域保守残基37和73中的单个氨基酸交换来分离(1,10,19,25,50)（图。). 首先将突变的HPV31 E2基因克隆到SV40表达载体中，并在DNA结合活性、转录刺激和E1依赖性来源复制增强的瞬态分析中进行分析。由于E2的特异性DNA结合对其许多性质至关重要，HPV31野生型E2和突变株EN20、RK37、EQ39和IL73的表达载体首次转染到SCC-13细胞中，并分析细胞裂解物的结合活性。对等量的裂解物进行凝胶阻滞分析32含有HPV31 E2结合位点4的P标记寡核苷酸（图。A） ●●●●。在转染wt E2或突变基因的细胞中检测到类似的特异性延迟复合物。观察到所有突变E2蛋白将E2BS探针结合到与野生型E2相似的水平，这表明蛋白质水平没有重大差异。
HPV31 E2蛋白的线性表示。E2的高度保守的氨基和羧基末端结构域分别表示为黑色和条纹盒。最不保守的铰链区域显示为白色。箭头表示突变导致E2蛋白之间高度保守残基（残基20、37、39和73）的氨基酸交换。
（A） SCC-13细胞中表达的HPV31 wt E2和E2突变蛋白EN20、RK37、EQ39和IL73的凝胶阻滞分析。对照通道未收到蛋白提取物（lane−）或转染亲本pSG5载体（lane SG5）的细胞提取物。Lanes E2、20、37、39和73从转染了各自表达载体的细胞中获得相同数量的提取物。E2-DNA复合体对应的延迟带用标记为c的箭头表示32含有E2结合位点的P标记寡核苷酸由标记为f.（B）的箭头指示。用HPV31 wt E2或E2突变蛋白EN20、RK37、EQ39或IL73的表达载体和E2应答报告质粒p6XE2BS-luc转染SCC-13细胞，并分析荧光素酶活性。报告质粒由驱动荧光素酶基因（luc）表达的最小SV40早期启动子（SV）上游的六个E2结合位点（E2）组成，如下图所示。通过共转染E2突变表达质粒获得的荧光素酶活性与转染的wt E2细胞的活性相对应，后者设置为1。标准偏差用误差线表示。（C） 瞬时复制分析。将质粒pGL31URR单独（−）或与HPV31 E1的表达载体或两种载体以及HPV31 wt E2或E2突变蛋白EN20、RK37、EQ39和IL73的表达载体一起转染SCC-13细胞。通过Southern杂交分析pGL31URR的瞬时复制。有代表性的放射自显影如下图所示。pGL31URR的复制水平通过磷酸化成像分析进行量化，并与HPV31 wt E2诱导的复制水平相关，后者设置为1。标准偏差用误差线表示。
接下来，我们研究了HPV31 E2突变体从E2依赖的报告质粒瞬时激活转录的能力是否发生改变，如BPV1 E2和HPV16 E2的报道（图。B） ●●●●。在这些研究中，我们使用了一个荧光素酶报告质粒，该质粒包含最小SV40早期启动子上游的六个E2结合位点。在SCC-13细胞中，HPV31 wt E2表达载体的共转染刺激了报告质粒的基础荧光素酶表达，根据实验结果，水平在40到80倍之间。在每个实验中，含有突变体EN20和EQ39的表达载体刺激转录的程度与野生型E2相同，而突变体RK37和IL73未能刺激荧光素酶的表达（图。B） ●●●●。将转染的HPV31 E2:IL73表达载体的数量增加10倍并没有增加报告质粒的刺激水平（数据未显示）。E2突变体RK37和IL73也未能在NHK中实现E2依赖性表达（数据未显示）。
为了确定突变E2蛋白对刺激HPV31来源的E1依赖性复制的影响，我们使用质粒pGL31URR进行了瞬时复制分析，该质粒包含HPV31 URR背景下的病毒来源（图。C） ●●●●。将HPV31 E1表达载体和wt E2表达载体或突变衍生物与pGL31URR一起转染SCC-13细胞。72小时后，从转染细胞中制备低分子量DNA，用限制性内切酶消化幽门螺杆菌我和Dpn公司I用于区分复制DNA和非复制DNA，并通过Southern杂交进行分析(44). 在单独转染原始质粒或单独转染HPV31 E1表达载体时未检测到复制DNA。E1和E2表达载体与pGL31URR质粒共转染导致高水平的复制源质粒，如图所示。C.E2突变体EN20、RK37和IL73诱导的复制水平与wt E2相当。相反，E2:EQ39表达载体的转染显示，原始质粒的瞬时复制减少到重量E2水平的30%。综上所述，这些数据表明，所有突变蛋白和wt E2在至少一次检测中均得到稳定表达和功能。此外，我们确定有可能从基因上分离HPV31 E2的反式激活功能和复制功能，正如对BPV1和HPV16的E2基因所描述的那样(1,10,19,25,50).
含有反式激活阴性E2 IL73突变基因的HPV31基因组在NHK中可以稳定地保持为外显子。
瞬时转染试验中记录的E2活性可能无法准确反映E2在病毒生命周期中的功能。为了研究E2的复制和反式激活功能在病毒生命周期中的作用，构建了包含E2基因上述突变的HPV31基因组。所有突变都位于E2基因的5′端，与任何已知的开放阅读框都不重叠，也不会改变顺式-已知参与复制或转录的作用序列。含有wt或突变E2基因的病毒基因组通过限制性消化、凝胶纯化和重纯化从质粒序列中释放出来。然后将重新鉴定的病毒基因组与pSV2neo质粒一起转染到早期传代NHK中，在药物筛选后，分离出稳定的细胞株(22,23). HPV转染细胞系在培养中至少可存活12代。这超过了正常角质形成细胞在组织培养中的寿命，后者通常在第3代至第5代时衰老。通过Southern对总细胞DNA的分析，在三次细胞传代后确定病毒DNA的状态（图。). 对转染HPV31 wt、E2:EN20、E2:RK37和E2:IL73基因组后获得的细胞系DNA的分析表明，有三种显著的物种与病毒DNA的超螺旋、开环和串联形式一致（图。，车道N）(5,22,23). 这表明这些细胞系中的病毒DNA主要以外显体形式存在。相比之下，HPV31 E2:EQ39细胞系仅包含与病毒DNA完全整合形式一致的高分子量杂交DNA。对HPV31 E2:EN20转染的DNA进行分析，发现DNA片段的大小不同于病毒基因组的线性形式（图。，EN20，lane S），表明病毒DNA已整合到细胞染色体中。利用荧光成像仪分析HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73细胞系的线性化、超螺旋和开环形式的病毒DNA，以确定病毒拷贝数。这表明，本实验中E2:IL73细胞系的拷贝数为wt水平的85%，而E2:RK37细胞系中的拷贝数减少到wt水平15%。从两个不同供体分离的NHK的三个独立转染中建立的细胞系证实，E2:IL73基因组以与HPV31 wt基因组相似的拷贝数保持为上位体，而E2:RK37基因组以显著减少的拷贝数维持在上位体。为了证实E2基因突变仍存在于细胞系中，通过PCR从细胞总DNA中扩增出E2基因的5′部分。然后对扩增产物进行测序，证明存在引入的突变（数据未显示）。
稳定转染HPV31 wt、E2:EN20、E2:RK37、E2:EQ39和E2:IL73基因组后获得的人类角质形成细胞细胞系DNA的Southern分析。用任一限制性内切酶消化10微克的总细胞DNA巴姆HI（N道），不切割HPV31 DNA，或生态RV（S道），识别HPV31基因组中的一个位点，然后接受Southern分析。作为尺寸标记，生态使用相当于每个细胞5个和25个病毒拷贝的RI线性化的HPV31 DNA（泳道5和25）。用32P标记的HPV31基因组DNA。在放射自显影的左侧，显示了病毒DNA的级联或整合（C/I）、开环（III）、线性（II）和超螺旋（I）形式的位置。在右侧，大小为Hin公司dIII噬菌体lamba DNA以千碱基表示。在最右边，显示了含有E2:RK37细胞DNA的通道长时间暴露的结果。
我们的研究表明，人类角质形成细胞中HPV31外显子的稳定维持需要残基39定义的E2的复制功能，而不是残基37和73定义的反式激活功能。与HPV31wt和E2:IL73细胞系相比，E2:RK37细胞系的拷贝数减少，这不能用在瞬时测定中测量的E2:RK37的DNA结合、反式激活或复制活性的差异来解释（图。). 我们怀疑E2:RK37细胞系拷贝数的严重减少是由于E2的一个额外的未知功能所致。
在HPV31 wt和E2:IL73细胞系中P97转录水平相似。
由于E2参与了主要早期启动子P97的正调控和负调控(6,9,13,49,59,65–67)，我们研究了HPV31 wt、E2:IL73和E2:RK37细胞系之间P97启动转录物的水平是否存在差异。在这些研究中，从单层培养的各种细胞系中分离出总RNA，并通过带有反义探针的RNase保护试验进行分析，该探针跨越nt678至919。该探针可以检测到在nt877的供体位点未拼接或拼接的P97转录本。在HPV31 wt和E2:IL73突变株系中，检测到类似水平的剪接和未剪接P97转录物（图。). 在图中。E2:IL73细胞的转录水平似乎略高于HPV31 wt细胞；然而，这些差异在其他检测中无法重复检测到。相反，E2:RK37细胞系中的P97水平持续下降，这可能是因为这些细胞中的病毒拷贝数较低。
单层培养中生长的HPV31 wt（lane wt）、E2:RK37（lane 37）和E2:IL73（lane 73）细胞系RNA的核糖核酸酶保护分析。将总细胞RNA（10μg）杂交到32从质粒pRP742转录的P标记反义探针，并进行核糖核酸酶保护分析。P97转录本的位置由放射自显影左侧的箭头指示，这些转录本在nt 877（SD 877）的供体位点未拼接或拼接。通道P包含未消化的探针。A类32P-end标记的1-kb梯形图用作尺寸标记（通道M），尺寸以右侧的核苷酸表示。反义探针的结构如放射自显影图所示。P97和P742启动子的起始位点以及nt 877（SD 877）的剪接供体位点用箭头表示。虚线表示P97的起始位置不包括在探针中。探针覆盖的部分E7和E1基因如结构图所示。
有人认为，E2可能在低水平E2表达载体的瞬时检测中对P97启动子进行反式作用，但在较高水平上对其进行抑制(9,59). 为了直接测量HPV31 wt E2以及E2:RK37和E2:IL73突变体对P97活性的影响，进行了瞬时报告分析。将越来越多的wt E2、E2:RK37或E2:IL73表达载体与P97荧光素酶报告质粒共同转染。两个E2突变体的行为与wt E2相似，并没有显著刺激P97活性。相反，在较高浓度的E2表达载体中，发现所有载体都在相同程度上抑制P97转录（数据未显示）。这些结果表明，P97不是HPV31 E2反式激活功能的重要靶点。
E2:IL73细胞诱导分化依赖性病毒功能。
在单层培养中，E2:IL73细胞系在病毒拷贝数或早期基因表达水平方面与wt细胞系没有显示出显著差异。E2的反式激活功能仍有可能在病毒生命周期的分化依赖阶段发挥作用。在角质形成细胞分化后，维持HPV的上位拷贝，诱导病毒DNA扩增，同时激活病毒晚期启动子P742，并表达E1∧E4、L1和L2蛋白(5,12,16–18,22,23,32). 为了检测E2反式激活是否对这些活动至关重要，在器官型筏培养基中培养HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73细胞系。分层后，通过原位DNA杂交扩增病毒基因组或免疫组织化学分析病毒E1∧E4蛋白的分化依赖性表达，固定筏培养物的组织切片并进行分析（图。). 首先通过DNA原位杂交分析筏中生长的细胞的组织切片，以扩增HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73细胞系（图。A） ●●●●。在HPV31 wt和E2:IL73细胞的筏式培养中，观察到同样数量的细胞扩增了病毒DNA。对10个随机筏段进行定量分析后发现，与E2:IL73筏段中的11.8±0.8个阳性细胞相比，HPV31 wt筏培养物每个培养场平均有15.8±2.9个（平均值±标准误差）阳性细胞。由于无法准确确定单个细胞中的扩增水平，因此仍有可能通过E2反式激活来调节扩增。然而，我们的主要发现是E2:IL73细胞仍然存在扩增。E2:RK37细胞筏式培养中仅检测到极低水平的扩增。E2:RK37细胞中病毒DNA的低基础水平可能阻止了我们检测到扩增，虽然扩增仍在发生，但速度有所降低。
（A） HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73筏培养物横截面的DNA原位杂交分析。用HPV31/33/35特异性探针检测HPV31 DNA，阳性细胞显示蓝色染色。（B） 免疫组织化学分析筏培养物中HPV31 E1∧E4蛋白的分化依赖性表达。在筏式培养中生长的HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73细胞系的组织横截面（5μm厚）与针对HPV31 E1∧E4蛋白产生的多克隆抗体孵育。免疫荧光法检测特异结合的二级抗体（异硫氰酸荧光素结合）。
用HPV31 E1∧E4蛋白特异性多克隆血清对筏组织切片进行染色，发现HPV31 wt和E2:IL73细胞系中的分布模式相似（图。B） ●●●●。E2:RK37细胞未检测到E1∧E4免疫反应。这些数据表明，E2反式激活的丢失不会显著干扰病毒基因组的分化依赖性扩增或E1∧E4蛋白的表达。这两种分析都不是高度定量的，但根据信号强度，似乎E2:IL73细胞中的病毒DNA扩增和E1∧E4蛋白的表达水平可能比HPV31 wt细胞中的有所降低。
接下来，我们研究了分化依赖型晚期病毒P742启动子的诱导水平是否存在差异，其活性与E1∧E4表达的开始相关。核糖核酸酶保护分析是一种定量分析，可以直接比较不同细胞系的诱导水平。从在器官型筏系统中分化的HPV31 wt、E2:RK37和E2:IL73细胞系中分离出总RNA，并使用上述探针进行RNase保护分析，该探针允许同时检测P97-和P742-启动的转录物。在HPV31 wt和E2:IL73细胞系中检测到在P97启动的转录物，这些转录物在供体nt877处未拼接或剪接（图。). 与图中所示的先前分析一致。发现E2:RK37株系中P97转录水平降低。分化后，nt742处的晚期HPV31启动子被诱导(32). P742启动子缺乏TATA盒，因此引导异质性起始位点。来自HPV31 wt和E2:IL73细胞系分化器官型筏培养物的RNA包含对应于P742启动子启动的转录物。在图中所示的实验中。，E2:IL73细胞系中P742转录物的水平降低到wt细胞系中的70%。在其他检测中，发现P742诱导水平为重量的40%至73%。相反，在筏式培养的E2:RK37细胞中未检测到P742转录物。我们的结论是，依赖于残基73的E2反式激活功能不需要诱导分化依赖性P742启动子。然而，我们一直观察到E2:IL73细胞系中P742的诱导水平低于HPV31 wt细胞系，这表明E2反式激活可能会增加P742表达水平。
筏式培养中生长的HPV31 wt（lane wt）、E2:RK37（lane 37）和E2:IL73（lane 73）细胞系RNA的核糖核酸酶保护分析。将总细胞RNA（10μg）与32P-标记的反义探针，如图图例所示。P97和P742转录本的位置显示在放射自显影的左侧，这些转录本在nt 877（SD 877）的供体位点未拼接或拼接。通道P包含未消化的探针。A类32P-end标记的1-kb梯形图被用作尺寸标记（通道M），尺寸用右侧的核苷酸表示。参见图的图例。以获取图底部图表的描述。
重要的是要确定E2 IL73突变是否影响病毒结构基因L1和L2的转录。来自允许在raft系统中分化的细胞系的RNA通过使用反义RNA探针的RNase保护测定进行分析，该反义RNA探针跨越L1基因开始时nt5552处的剪接受体位点，并允许检测L1-以及L2/L1特异性转录物（图。). 在HPV31 wt、E2:IL73或E2:RK37细胞的单层培养物中以及在分化的E2:RK17细胞中均未发现晚期衣壳蛋白基因转录物。HPV31 wt和E2:IL73细胞的分化产生了拼接和未拼接的晚期基因转录物。然而，L1和L2/L1转录物的数量一直减少到E2:IL73细胞系wt水平的20%-30%。我们的结论是，E2的反式激活能力对诱导早期或晚期病毒功能并不重要；然而，它可能会增加这些活动的水平。
单层（M）或筏（R）培养物中生长的HPV31 wt（车道wt）、E2:RK37（车道37）和E2:IL73（车道73）细胞系RNA的核糖核酸酶保护分析。将总细胞RNA（20μg）杂交到32从质粒pRPA31L1转录的P标记反义探针。晚期基因转录物的位置显示在放射自显影的左侧，这些转录物在nt 5552（SA 5552）处的受体位点未被切割或剪接。反义探针的结构如放射自显影所示。指出了被探针和剪接受体位点（SA 5552）覆盖的L2和L1基因的部分。
讨论
我们的研究表明，致癌人乳头瘤病毒E2蛋白的反式激活能力对于外显子的稳定维持、早期或晚期基因的表达或分化依赖性基因组扩增并不重要。虽然E2:IL73突变细胞系中病毒外显子的稳定拷贝数和晚期转录水平可能略有降低，但诱导所有晚期功能的能力仍然保持。这表明E2反式激活并不需要诱导早期或晚期病毒功能，尽管它可能调节晚期功能的水平。虽然我们的研究未能证明E2在激活早期P97或晚期P742启动子中的重要作用，但我们不能排除E2激活其他未经证实的次要病毒启动子的可能性。然而，我们的研究表明，E2激活这些启动子对诱导早期或晚期病毒功能并不重要。
与BPV1的研究相比，E2反式激活对癌原性乳头瘤病毒类型早期功能的激活不是必需的。靶向鳞状上皮的人类生殖器乳头状瘤病毒与诱发纤维乳头状瘤的BPV1之间存在一些显著差异。在BPV1中，许多启动子被证明对E2有反应，E2基因的突变导致转化能力的丧失(10,14,15,26,28,47,52,57,64). 在人类病毒中，E2突变不会通过HPV基因组降低人类角质形成细胞的永生化能力(48). 在生殖器型HPV中，早期病毒转录被位于URR中的增强子元件激活，而URR仅结合细胞因子(7,37). 这些差异表明，这两种类型的乳头瘤病毒利用不同的机制调节病毒基因表达。与这一想法一致，表达E2蛋白的BPV1突变基因组（具有复制能力但反式激活缺陷）没有转化小鼠C127细胞，而在我们的研究中，相应的HPV31基因组（E2 IL73）很容易使角质形成细胞永生化(10).
在高危型HPV中发现了两个主要的病毒启动子：nt97上游的主要早期启动子和HPV31中以nt742为中心的晚期启动子(4,24,32,53,56). 在瞬时试验中，HPV16和HPV18早期启动子的表达被低浓度的共转染E2表达载体激活，而在高浓度时被抑制(9,59). 在我们的研究中，我们没有检测到HPV31早期启动子的任何激活，只观察到E2对P97的抑制，我们之前假设这是调节感染基底细胞稳定拷贝数的机制的一部分(62). 我们的研究并不排除E2可以增加晚期P742启动子的表达的可能性，因为E2永生化的细胞：IL73突变基因组在此活动中减少。然而，很明显，E2转录激活对后期表达的激活并不重要。类似地，E2反式激活可能调节基因组扩增水平，而在E2:IL73突变体中，基因组扩增水平似乎略有降低。同样，由于基因组扩增仍在发生，我们得出结论，E2反式激活对这一过程并不重要。
有人认为，病毒DNA的上位状态对晚期启动子的高水平激活至关重要(23). 对这种依赖性的一种解释是，基因组扩增会增加基因组拷贝数，导致模板数量增加导致后期表达增加。如果E2反式激活的缺失甚至稍微减少基底细胞中外显子的拷贝数，这可能导致晚期基因表达水平的降低。对一个具有与HPV31 E2:IL73突变相似的温度敏感性E2突变体的BPV1基因组的分析表明，有丝分裂后细胞中病毒基因组的扩增不需要E2反式激活功能，这被认为类似于分化上皮细胞的扩增过程(2). 与BPV1 wt细胞系相比，E2温度敏感性细胞系中的扩增水平似乎略有降低，这与E2反式激活对扩增过程不是必需的，但可以调节扩增程度的观点一致(2). 最后，我们的研究并不排除E2的氨基酸73在DNA包装或衣壳蛋白组装中发挥作用的可能性(12个).
我们还检测了第二个氨基酸37处的E2突变体，该突变体对反式激活有缺陷，并发现它在瞬时测定中的表现与E2 IL73突变体相似。与E2:IL73突变体相比，E2:RK37突变体基因组在单层培养中表现出严重的拷贝数减少，并且在器官型筏中晚期功能水平无法检测，这可能是拷贝数低的结果。例如，如果一个负因子调节晚期基因表达，E2:RK37基因组的扩增程度可能无法滴定出该蛋白。我们怀疑E2:RK37突变体对基因组拷贝数控制和诱导晚期表达所必需的额外功能有缺陷。Sakai及其同事支持这一观点，他们证明HPV16 E2中残基37从精氨酸突变为丙氨酸会降低E2的瞬时复制功能(50). HPV16 E2 RA37突变蛋白保留了与病毒E1蛋白复合的能力，这表明HPV E2中的残基37可能是E2额外复制活性的一部分。此外，含有E2 K37突变的BPV1基因组无法在转染的C127细胞上诱导焦点形成，尽管突变的E2蛋白具有反式作用、瞬时复制病毒DNA以及与E1蛋白形成复合物的能力(10). 这两项研究都表明，E2的氨基酸37对除反式激活外的其他活动至关重要。
问题在于致癌HPV E2蛋白的反式激活是否在病毒生命周期中起到任何生理学上的重要作用，还是它是瞬时转染分析的产物。我们的研究表明，如果E2反式激活在病毒生命周期中有任何作用，那么它只是一个适度的反式激活，可以增强后期功能的水平。在体内感染中，反式激活功能可能变得更加重要。例如，我们的研究还没有解决E2激活组织培养系统中没有记录其活性的细胞基因的可能性。另外，E2在人类病毒中的主要作用可能是作为与E1一起作用的复制因子，以及作为早期基因表达的负调控因子。
