所有疱疹病毒生命周期中的一个关键方面是决定维持和阻断病毒潜伏期。例如，爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）是一种人类疱疹病毒，在体内和体外感染B细胞以建立潜在感染（有关综述，请参阅参考文献38). 在这些潜伏感染的细胞中，EBV生命周期的裂解阶段可以通过12-O（运行）-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）或表面免疫球蛋白交联(62,69). 这些药物激活病毒即刻早期蛋白BZLF1的表达，也称为EB1、Zta、Z或ZEBRA(10,38【及其参考】，45,61,63). 相反，BZLF1在EBV潜伏期被抑制，以阻止裂解期的开始和宿主细胞的最终死亡。
BZLF1是一种与转录因子bZip家族相关的序列特异性DNA结合蛋白，它通过顺式-作用ZRE（Zta响应元件）DNA结合基序(66). BZLF1含有一个羧基末端结构域（见图。A、 上部），其通过卷曲线圈相互作用介导同源二聚(9,42)和一个与转录因子AP-1家族成员的DNA结合域具有序列同源性的基本区域(18,66). 因此，BZLF1与TRE（TPA应答元件）或AP-1序列基序结合，具有高亲和力(18,46). BZLF1的氨基末端结构域在转录激活中起作用(11,12,22)并直接参与EBV裂解DNA复制起源的激活，奥利利特(2,56——58).
变速箱-和顺式-EBV裂解循环的作用元件。（A） （上半部分）BZLF1中功能域的模块化结构示意图与AP-1家族其他成员相似。BZLF1由一个参与DNA复制和转录激活的转录激活域、一个基本的DNA结合域和一个负责BZLF同二聚体化的二聚体结构域组成。（下部分）人c-Jun和BZLF1的基本DNA结合结构域的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸用垂直线表示；双点和单点分别表示相似和不太相似的残留物。箭头表示c-Jun中的氨基酸与DNA碱基接触(26). BZLF1中aa 186处的丝氨酸与大多数bZip蛋白中同等位置发现的高度保守的丙氨酸（开放箭头）不同。重点介绍了BZLF1中的氨基酸丝氨酸186、精氨酸187和赖氨酸188，它们形成了保守的PKC基序。（B） 的精细结构奥利利特，及其顺式-作用元件。奥利利特位于发散转录的启动子区，如图所示。左右两侧的基因BHLF1和BHRF1及其启动子（黑条）如图所示。开放矩形描绘了包含最小值的基本序列元素奥利利特(59). 阴影区域表示定义不明确的区域，这些区域用作奥利利特.放大视图奥利利特如图底部所示，包括已知的功能序列元素，由代表BZLF1（ZRE1至ZRE7）的七个结合位点的图标表示，病毒增强子因子R的一组结合位点，以及TATA和CCAAT框。
为了维持EBV生命周期的潜伏期，抑制BZLF1至关重要，但特定刺激在某些条件下会减轻抑制，从而过渡到EBV的裂解期。因此，在潜伏感染的B细胞中无法检测到BZLF1的表达，但BZLF启动子区域包含多个TPA应答的转录因子结合基序，如ATFα、ATF1、ATF2和c-Jun(67)以及通过正反馈机制触发BZLF1表达的ZRE位点(14,20). 因此，能够诱导AP-1活性的刺激物是BZLF1表达的有效诱导物(6). 除了转录控制外，BZLF1的活性还受蛋白质相互作用的调节(24,32,36,37,60,68)和磷酸化(13,41,55).
磷酸化是细胞和病毒转录因子的一种基本调控修饰，改变了它们对DNA结合或转录活性的亲和力（有关综述，请参阅参考文献30). 例如，AP-1家族的典型成员c-Jun的调控被发现由两种不同的磷酸化事件介导。Jun N-末端激酶（JNK）对各种刺激（如TPA、紫外线辐射或细胞内信号转导子）的反应，使位于N-末端转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，导致c-Jun的转录活性增强(5,16,53). 另一方面，c-Jun在其DNA结合域附近的位点磷酸化会降低DNA结合亲和力，而其中一个位点的去磷酸化会导致DNA结合增加(7). 这些磷酸化相互调节，因为JNK/应激活化蛋白激酶对c-Jun N末端反式激活结构域的磷酸化似乎改变了羧基末端位点对磷酸酶和激酶的可及性(50). 类似地，BZLF1在体外被酪蛋白激酶II磷酸化，接近其基本DNA结合域，这影响了BZLF1-binding的亲和力(41). 体内也发现BZLF1磷酸化，但这一发现的相关性尚不清楚(13). 此外，在BZLF1的DNA结合域中丝氨酸氨基酸残基186处提出了蛋白激酶C（PKC）的一致磷酸化基序，该基序被发现对BZLF的全部生物活性至关重要(23).
除了调节DNA结合外，磷酸化还可以影响蛋白质的复合物形成，以指导其激活潜能。例如，环AMP反应因子CREB与辅活化因子CREB-结合蛋白（CBP）的相互作用需要位于CBP结合域的丝氨酸残基上的CREB磷酸化(51). 这种招募对于针对环腺苷酸的靶向基因诱导至关重要。因此，就像型钢混凝土通过丝氨酸/苏氨酸激酶途径的信号转导也可能需要能够识别磷酸化氨基酸的蛋白质相互作用基序。
PKC是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可由佛波酯（如TPA）直接激活（有关综述，请参阅参考文献49). PKC同工酶在多种不同刺激改变细胞功能和增殖后的信号转导级联中起着关键作用。在体外，大量蛋白质被PKC的不同亚型磷酸化。体内研究表明，只有少数蛋白质是PKC的生理底物（有关综述，请参阅参考文献27)例如，MARCKS（针对肉豆蔻酰化丙氨酸富含C激酶底物）（有关综述，请参阅参考文献1)，细胞骨架蛋白受体(31)和细胞内传感器，如Raf-1(39)和p53(64).
由于对BZLF1的功能特性感兴趣，我们注意到其转录活性可以通过TPA增强。因此，我们提出了BZLF1是否可以作为TPA活化激酶的底物的假设，以及这种假定的关系是否具有任何功能意义。本文中，我们提供了遗传学、生物化学和生物学证据，证明BZLF1的完全激活依赖于S186的磷酸化，这可能会影响协同细胞因子的募集。
材料和方法
蛋白表达质粒大肠杆菌。
所有蛋白质均表达于大肠杆菌DH5α(29)作为谷胱甘肽S公司-pGEX-1λT（Pharmacia）中的转移酶（GST）融合。BZLF1编码cDNA序列来自EBV B95.8株(4,10). 将全长BZLF1 cDNA（氨基酸[aa]1至245）插入巴姆HI（高）/生态RI-cut pGEX-1λT质粒，在两个蛋白结构域之间提供凝血酶裂解位点。该重组质粒被命名为pGST:BZLF1-wt。pGST:BZLF1-T159A、pGST：BZLF-1-S186A、pGPST:BZLF1-T159A/S186A和pGST:0ZLF1-S186D，表达BZLF1的不同替代突变体，通过pBluescript II SK（−）载体（Stratagene）中的定点突变产生。对表达BZLF1及其突变体的所有质粒的编码部分进行序列分析。
重组真核质粒。
如前所述构建报告质粒pBHRF1-Luc和pBHLF1-Luc(57,59). p4xZRE5tk-Luc是一个报告质粒，包含四个ZRE5结合位点的拷贝，通过连接合成的寡核苷酸（如下所述）进行多重聚合。将ZRE5的多聚体结合位点插入上游，并靠近融合到荧光素酶报告基因的单纯疱疹病毒1型的最小胸苷激酶启动子。质粒pCMV-BZLF1-wt是一种高效诱导EBV生命周期裂解期的表达载体。如前所述，BZLF1基因在这种逆转录病毒载体构建体中由人巨细胞病毒早期基因的启动子驱动(28). 如前所述，克隆了BZLF1嵌合转录因子质粒pCMV-BZLF（trans）：E2(57). pCMV-BZLF1（反式）：E2由BZLF的转录激活域（aa 1至169）融合到牛乳头瘤病毒E2转录和复制因子的DNA结合和二聚化域（aa281至410）组成。其他由不同载体质粒表达的重组或天然转录因子[pCMV-c-jun（trans）：E2和pCMV-E2-TR]是Paul Lambert慷慨的馈赠(44). 质粒pLPV-BZLF1-wt表达嗜淋巴性乳头状瘤病毒早期基因启动子BZLF1基因的cDNA(52). 如上所述，通过定点突变产生BZLF1替代突变体，相应的质粒命名为pCMV-BZLF1-S186A、pLPV-BZLF1-S186A、pLPV-BZLF1-S186D和pLPV-BZLF1-S186E。
细菌蛋白质合成和纯化。
大肠杆菌用GST-BZLF1变异体表达质粒转化的DH5α菌株在400 ml Luria-Bertani培养基中生长至600 nm 0.5的光密度，并用2 mM IPTG（异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷）。收集细胞，将细菌颗粒重新悬浮在5 ml冷裂解缓冲液中（1×Tris-EDTA，1%Triton X-100，以及以下蛋白酶抑制剂：每ml 0.5μg亮肽，每ml 1μg胃蛋白酶抑制素，1 mM苯甲基磺酰氟，50 mM苯甲脒，1 mM-pefabloc和0.5μg抑肽酶），并超声处理10 min。在45000rpm超速离心1小时后，将清除的提取物结合到与谷胱甘肽偶联的Sepharose珠（Pharmacia）上。BZLF1与GST融合后，用1 U凝血酶（Sigma）酶解30分钟释放。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯染色进行分析。蛋白质含量通过标准程序测定。
瞬时转录分析。
人类胚胎肾293细胞和EBV阴性Burkitt淋巴瘤细胞系BL41在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长。BL41细胞（5×106用5μg报告质粒（pBHRF1-Luc，pBHLF1-Luc、p7xE2-BHRF1-Luc或p4xZRE5tk-Luc）和2μg激活质粒[pCMV-BZLF1-wt或pCMV-BZLF1-S186A；pLPV-BZLF1-wt，pLPV-BZLF1-S186A，pLPV BZLF1-S186D或pLPV-B ZLF1-S186E；或pCMV c-Jun（反式）：E2，pCMV-B Zlf1：E2或pCMV-E2-TR]。使用相同数量的质粒DNA转染5×106使用Lipofectamine（Gibco BRL Life Technologies）进行DNA转染，每次转染293个细胞。转染后8小时，用每毫升100 ng TPA和/或每升1μmol PKC抑制剂GF109203X（Biomol）处理细胞12小时。如前所述，在细胞提取物中测量荧光素酶活性(59). 所有反应至少进行四次。
瞬时复制分析。
细胞系D98HR1来自EBV基因组阳性Burkitt淋巴瘤细胞系P3HR1和人类上皮细胞系D98之间的体细胞杂交(25). 该贴壁细胞系包含约20个EBV基因组拷贝（数据未显示），并保存在含有5%胎儿血清和5%新生小牛血清的Dulbecco’s Eagle培养基中。10微克奥利利特质粒p526通过电穿孔与5μg pCMV-BZLF1-wt或pCMV-BZLF1-S186A共转染。质粒p526已在前面描述过(28). pCMV-BZLF1的伴随引入有效地诱导了EBV的裂解周期。共转染两天后，制备DNA，用酶消化输入质粒DNA巴姆HI和Dpn公司我要消除甲基化的原核DNA，并根据标准程序在Southern杂交和放射自显影后检测到的特定信号来量化p526复制的效率。
核提取。
用2μg质粒pCMV-BZLF1-wt或pCMV-BZLF1-S186A（如上所述）转染293个细胞，或模拟转染，然后用TPA（100 ng/ml）处理不同时间长达1小时。立即收集细胞，并将其重新悬浮在300μl低渗缓冲液A中（10 mM HEPES[pH7.9]，10 mM KCl，0.1 mM EDTA，1.5 mM MgCl2、0.5 mM二硫苏糖醇[DTT]、蛋白酶抑制剂[见上文]和磷酸酶抑制剂β-甘油磷酸、氟化钠、焦磷酸、钼酸盐、原钒酸和癸二酸各1 mM），并在冰上培养30分钟，将粗核颗粒重新悬浮在200μl高渗缓冲液B中（20 mM HEPES[pH7.9]，0.4 M NaCl，0.1 mM EDTA，1.5 mM MgCl2，0.5mM DTT，25%甘油，以及如上所述的蛋白酶和磷酸酶抑制剂），然后在冰上孵育30分钟。离心后，上清液用于凝胶阻滞测定和用抗BZLF1单克隆抗体Z130进行免疫印迹分析(48)（见下文）。
凝胶阻滞试验。
用细菌表达的BZLF1和转染BZLF表达质粒的细胞核提取物进行凝胶移位实验。将不同的蛋白质制剂与32在10 mM HEPES（pH 7.9）、10%（vol/vol）甘油、60 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.25 mM DTT和2μg聚（dI-dC）的25μl溶液中，含有AP-1位点或不同ZRE位点的P标记寡核苷酸（每个样品20000 dpm）。用T4多核苷酸激酶标记DNA探针。在有无抗BZLF1单克隆抗体Z125的情况下，在室温下进行30分钟的结合反应(48)并在0.2×TBE（1×TBE为90 mM Tris、64.6 mM硼酸和2.5 mM EDTA[PH8.3]）中的7.5%聚丙烯酰胺凝胶（20:1丙烯酰胺-双丙烯酰胺）上分离。将凝胶干燥并暴露在柯达XAR-5胶片上。以下寡核苷酸用于凝胶移位实验（结合位点下划线）：AP-1，5′-TCGAAGCTATGACTCA公司TCCGGTCGA-3′(54)；ZRE2/7，5′-CTAGCTCACCT公司TGAGCAA公司TTTGGTCTAGAA-3′(9)；ZRE3A，5′-CTAGCATA型TGAGCCA公司CAGATC-3′(65)；和ZRE5，5′-CTAGATGTCACCTTTGCACA公司TTTGGTCAG-3′(46).
蛋白质印迹分析。
将等分的各种蛋白质样品在Laemmli缓冲液中煮沸，在15%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，然后电转移到硝化纤维素膜上。用单克隆抗体免疫印迹法检测BZLF1，单克隆抗体识别BZLF的aa 59和93（Z125）之间的表位或aa 177和196（Z130）之间的一个表位(48)、辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠免疫球蛋白G（Promega）和ECL检测试剂（Amersham）。
体外磷酸化。
在含有激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl[pH7.5]，1.32 mM CaCl）的反应混合物（15μl）中磷酸化纯化的BZLF12，5 mM氯化镁2、1 mM EDTA、1.25 mM EGTA和1 mM DTT）补充10 nM TPA、每毫升5μg磷脂酰丝氨酸、5 mM ATP和0.5μCi的[γ-32P] ATP。将反应混合物与纯化的PKC在室温下孵育15分钟。随后在SDS–15%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离产物，并通过放射自显影术进行可视化。
体内标记。
如上所述，用10μg pCMV-BZLF1-wt或pCMV-BZLF1-S186A转染293细胞。转染后12小时，293个细胞培养物（在90 mm培养皿中）用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，并在5 ml无磷Dulbecco改良Eagle's培养基（Sigma）中培养3小时[32P] 然后添加正磷酸盐（2.5 mCi）（Amersham）。在4小时标记期后（TPA存在或不存在的最后一个小时[100 ng/ml]），用冰镇磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞两次，并用针对BZLF1的Z130单克隆抗体结合蛋白G-Sepharose（法玛西亚）从细胞裂解液中免疫沉淀标记蛋白。结合蛋白在Laemmli缓冲液中煮沸洗脱，并通过SDS-PAGE进行分析。将SDS-聚丙烯酰胺凝胶印在硝化纤维素膜上，并通过放射自显影术检测标记的蛋白质（数据未显示）。通过生物素化Z125免疫检测评估免疫沉淀BZLF1的数量（数据未显示）。
质谱法。
在连接至Perkin-Elmer API 100四极质谱仪和Berthold放射性探测器的ABI微净化系统173上进行质谱分析。如下所述对BZLF1进行磷酸化和消化。将来自5μg BZLF1的色氨酸肽加载到ABI 100-0.3 mm反相（C18)列。以5μl/min的速度运行0至35%的乙腈梯度（100 min），随后在20 min内梯度为35至70%。质量以0.1原子质量单位阶跃在米/z范围为500至1500，孔电压为20 V。
磷酸肽图谱。
如上所述，BZLF1在体内进行放射标记、免疫沉淀并进行SDS-PAGE。放射自显影后，从凝胶的相应区域切除BZLF1条带，用水冲洗，并用胰蛋白酶在50 mM NH中消化至完全4HCO公司三在37°C下过夜。胰蛋白酶处理后，将释放的肽进行冷冻干燥，再悬浮在水中，并应用于高效液相色谱或薄层纤维素板进行二维肽图绘制。标记的磷酸肽的分离通过在1000V下在pH 1.9下电泳20分钟在水平方向上进行，并且通过上升色谱在垂直方向上进行。如上所述，对PKCα体外磷酸化的重组BZLF1使用相同的肽定位程序。
GFP标记EBV的诱导和滴度测定。
最近建立了一个完全重组的EBV基因组；它携带绿色荧光蛋白（GFP）基因，受人巨细胞病毒即时早期启动子/增强子控制。通过将高达1μg的pCMV-BZLF1-wt转染到293细胞中诱导病毒产生，293细胞以潜伏方式携带重组EBV基因组。将转染的293细胞在1μmol PKC抑制剂GF109203X（或仅二甲基亚砜[DMSO]作为阴性对照）存在下保存4天。从这293个细胞中提取上清液，用于超感染5×104Raji细胞呈剂量依赖性。Raji细胞是EBV阳性Burkitt淋巴瘤细胞系，在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长。感染后4天，通过紫外光学显微镜或荧光激活细胞分选仪（FACS）分析绿色Raji细胞的数量来确定病毒滴度，如其他地方所述(15).
结果
TPA刺激BZLF1应答基因的表达。
潜伏感染EBV阳性B细胞中BZLF1的表达激活了与TPA治疗这些细胞一样多的早期启动子(10). EBV早期启动子的TPA诱导通常通过TPA介导的BZLF1启动子Zp通过其AP-1反应位点的上调来解释(6,14,21,40). 随后，BZLF1基因产物反式激活其自身的启动子以及许多裂解基因的启动子，从而启动病毒基因表达的级联(6,14,19). 我们的初步观察表明，TPA也可能独立于BZLF1基因的诱导而调节BZLF1的转录活性。
差异转录EBV早期基因BHRF1和BHLF1的上游区域构成BZLF1应答启动子，与奥利利特EBV DNA复制的裂解起源（图。B）(28). 为了测量这些BZLF1应答启动子的TPA诱导率，我们用荧光素酶替换BHRF1和BHLF1基因的开放阅读框，以酶法测量相对转录活性(59). 为了排除内源性BZLF1诱导产生的影响，我们选择EBV阴性的Burkitt淋巴瘤细胞系BL41进行这些实验以及以下大多数实验。
如图所示。A、 BZLF1表达质粒（pLPV-BZLF1-wt）与报告质粒BHRF1-Luc的共转染导致BHRF1启动子上调5至10倍，而TPA的加入显著刺激了BHRF1的上调。TPA与PKC抑制剂GF109203X联合治疗导致TPA效应的抑制，而在没有BZLF1的情况下，用TPA和/或PKC抑制剂处理细胞并没有诱导BHRF1报告子。用BHLF1启动子进行了非常相似的观察（图。A、 下部面板）以及不同的细胞系，包括293个细胞（见下文）。
TPA诱导BZLF1应答基因表达。（A） BL41细胞瞬时转染荧光素酶报告质粒pBHRF1-Luc（上面板）或pBHLF1-Luc（下面板）。如有指示，BZLF1表达质粒pLPV-BZLF1-wt被联合转染。用TPA、PKC抑制剂GF109203X或两者联合处理细胞。根据转染报告质粒和载体（左栏）的细胞中荧光素酶的活性计算相对转录激活度，并将其设置为1。（B） TPA和PKC抑制剂均不影响BZLF1的稳态蛋白水平。通过Western blotting分析平行分析荧光素酶活性的细胞裂解物的等分样品，如图中的面板A所示。（C） 突变报告基因构建物p7xE2-BHRF1-Luc的转录激活。除了七个ZRE基序被七个E2结合位点所取代外，该质粒与本图面板A中显示的报告质粒pBHRF-1-Luc相同。将分别由c-Jun和BZLF1的反式激活结构域组成的嵌合转录因子[pCMV-c-Jun（反式）:E2和pCMV-BZLF1（反式）:E2]与报告质粒共转染，与pCMV-BZLF1-wt（不能与报告质粒结合）进行比较E2本身的一个版本（pCMV-E2-TR）。如图所示，随后用TPA处理细胞或不处理细胞。相对转录激活基于仅转染报告质粒的细胞中测量的荧光素酶活性（左栏）。仅用报告质粒转染的细胞中的TPA诱导导致荧光素酶活性增加约两倍。
为了证实TPA或PKC抑制剂或两者的联合治疗对转染质粒pLPV-BZLF1-wt表达的BZLF1水平没有影响，我们通过Western blotting分析了BZLF1-蛋白的细胞裂解物。未检测到BZLF1稳态水平的差异（图。B和数据未显示）。
TPA介导的c-Jun活化部分是由于c-Jun N末端激酶磷酸化其活化域(16,35). 因为BZLF1与c-Jun有一些相同的特点(18)，我们询问BZLF1应答启动子的TPA诱导是否依赖于类似的机制。为此，由牛乳头瘤病毒E2蛋白的DNA结合域组成的嵌合转录因子融合到c-Jun的激活域[c-Jun（反式）：E2](44)或BZLF1[BZLF1（反式）：E2](57)使用了。用BHRF1荧光素酶报告子结构分析这些嵌合体的TPA反应性，其中所有7个ZRE位点都被E2结合位点取代(57)（图。C） ●●●●。该报告质粒的转录激活依赖于包含E2的DNA结合结构域的转录因子(57).
正如预期的那样，嵌合转录因子c-Jun（trans）：E2由TPA诱导大约八倍（图。C） ●●●●。相反，用BZLF1（反式）：E2诱导TPA的效果只有两倍。这种诱导水平也可以通过单独使用报告质粒、野生型BZLF1（不能与报告结构结合，该结构缺乏野生型BJLF1的所有结合位点）或转录阻遏物E2-TR观察到。
总之，这些数据表明BHRF1启动子的诱导依赖于（i）BZLF1与顺式-作用ZRE位点和（ii）BZLF1的羧基末端碱性和/或二聚化结构域，但不在其N末端反式激活结构域上。
EBV滴度受PKC水平的影响。
最近，我们在大肠杆菌在F因子衍生质粒上，该质粒还包括潮霉素抗性基因和GFP，分别作为遗传和表型标记。转染293细胞后，B95.8–F因子DNA分子在潮霉素的选择下在染色体外保持不变。通过转染编码BZLF1的表达载体可以产生病毒，通过Raji细胞的重叠感染和GFP阳性细胞的可视化可以很容易地评估病毒滴度(15). 由于细胞培养基中存在的生长因子提供了低水平的内源性PKC活性，我们推测PKC抑制剂可能会影响携带B95.8–F因子基因组的293个细胞的溶酶体诱导效率。pCMV-BZLF1-wt表达质粒通过Lipofectamine转染到这些细胞中，细胞在PKC抑制剂GF109203X的存在下或仅在其溶剂DMSO的等效浓度下保存4天。如材料和方法中所述，使用无细胞上清液感染Raji细胞，并在重复感染后4天对相应组的GFP阳性细胞进行计数或通过FACS进行分析。如图所示。与阴性对照组相比，用PKC抑制剂处理的细胞获得的上清液中EBV滴度降低了5到6倍。Raji细胞感染的不同多样性也有相同的趋势（数据未显示），这表明EBV裂解期和/或病毒成熟的诱导在一定程度上取决于细胞内支持病毒生成的内源性PKC水平。由于组成性过度表达的BZLF1的蛋白质水平不受PKC激活或抑制的影响（图。B） GF109203X可通过PKC直接或间接介导影响BZLF1的转录后修饰。
PKC抑制剂可降低293细胞释放的EBV滴度。如前所述，在人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子的控制下，在上皮样细胞系293中建立了携带GFP基因的完全重组EBV基因组(15). 通过转染pCMV-BZLF1-wt诱导病毒产生。将一半转染的293细胞在PKC抑制剂GF109203X或仅DMSO存在下作为阴性对照保存4天。从这293个细胞中获得无细胞上清液，每10个病毒上清液中有1个用于感染Raji细胞。病毒滴度是通过紫外光学显微镜分析绿色Raji细胞的数量来确定的，如相位对比显微镜所示。作为阴性对照，从经PKC抑制剂处理的293个细胞获得的上清液显示EBV滴度低于仅经DMSO处理的细胞（5至6倍）。
体外PKC对BZLF1的磷酸化作用。
由于TPA和PKC抑制剂GF109203X直接影响PKC的酶功能，我们询问BZLF1是否可以作为PKC的底物。如图所示。A、 细菌表达的BZLF1蛋白在体外容易被PKCα磷酸化。为了绘制BZLF1的磷酸化位点，用[γ-32P] 在PKCα存在下的ATP和胰蛋白酶裂解后的质谱分析。我们能够确定BZLF1的PKC磷酸化的两个可能的候选位点：位于159位（T159）的苏氨酸残基和位于186位（S186）的丝氨酸残基，这两个位点都是完美PKC一致模体（S/T-R-K）的一部分（见图。A、 下部，用于S186图案）(三). 产生了具有单氨基酸取代的BZLF1突变体。T159和S186都被丙氨酸（A）取代，将PKC共有基序改变为序列A-R-K。基序S186（但不是T159）的突变导致磷酸化显著降低（图。)表明S186是BZLF1体外PKC依赖性磷酸化的主要靶点。PKCη、PKCδ和PKCζ属于不同类别的新型和非典型PKC(34)，每个磷酸化BZLF1的程度相似（数据未显示）。
BZLF1在体外被PKCα在丝氨酸186处磷酸化。（A） 体外标记BZLF1的放射自显影术。BZLF1-wt和点突变体BZLF1-159A、BZLF1-S186A和BZLF1-T159A/S186A被表达为GST融合蛋白大肠杆菌并在体外被PKCα磷酸化。在SDS凝胶上分离后，通过放射自显影术分析标记的蛋白质。体外PKCα仅能有效磷酸化BZLF1-wt和BZLF1突变体T159A。（B） 图A中SDS凝胶的考马斯染色。经考马斯着色验证，不同GST-BZLF1融合蛋白的数量具有可比性。
体内BZLF1的磷酸化。
连同反式激活分析（图。)，我们的数据表明，BZLF1可能是体内TPA激活的激酶（如PKCs）磷酸化的靶标。为了解决体内BZLF1的磷酸化状态，我们用pCMV-BZLF1-wt或pCMV-BZLF1-S186A转染293细胞。细胞与[32P] 正磷酸盐和TPA处理1h后，从细胞裂解液中免疫沉淀BZLF1，在放射自显影之前，通过SDS-PAGE分析沉淀蛋白，同时进行BZLF免疫检测（数据未显示）。在胰蛋白酶消化和双向凝胶电泳后，将免疫沉淀的BZLF1-wt和BZLF1-S186A的磷酸肽图谱与细菌表达的和在体外磷酸化的BZLF1-wt中的磷酸肽图进行比较（图。).
BZLF1的磷酸映射。（A） 在SDS-PAGE之前，细菌表达的GST-BZLF1-wt在体外被PKCα磷酸化。放射性标记的GST-BZLF1带通过放射自显影术鉴定，切除并进行胰蛋白酶消化。释放的肽通过双向电泳分离，并通过放射自显影术显示。检测到两个信号（x和y），这两个信号对应于携带S186的两个部分消化的肽。BZLF1-S186A在体外未被PKCα磷酸化（图。)因此没有产生肽点（数据未显示）。（B） 瞬时转染293细胞的BZLF1-wt和BZLF1-S186A蛋白的二维胰蛋白酶磷酸肽定位[32P] 体内正磷酸盐。细胞未经处理或在收获前与TPA孵育1小时。BZLF1免疫沉淀，SDS-PAGE电泳。切除带并进行胰蛋白酶消化和二维磷酸肽色谱。BZLF1是组成性磷酸化的，如标记为a到e的五个点所示，这五个点可以在所有四个面板中看到。此外，在TPA刺激后，BZLF1-wt而非BZLF1-S186A显示了两个额外的信号，标记为x和y。这些信号对应于体外PKC-磷酸化BZLF1所看到的相同斑点，如图中的面板A所示。箭头表示肽样品的应用位置。
在体外，两个点（x和y[图。A] ），尽管BZLF1的胰蛋白酶消化理论上只能产生一个氨基酸184到187的肽。检测到两个斑点很可能是由于部分胰蛋白酶裂解(8)，因为胰蛋白酶通常会在C端裂解精氨酸残基或赖氨酸残端，S186之后紧接着是两种氨基酸（图。A） ●●●●。如上所述，BZLF1-S186A在体外未检测到磷酸化，因此未检测到任何磷酸肽（数据未显示）。如图所示。B、 BZLF1 wt和BZLF1-S186A在非刺激的293细胞（点a至e）中组成性磷酸化，如先前报道的那样(13). 用TPA处理后，BZLF1-wt中产生了两个额外的磷酸化肽，分别命名为x和y，其迁移模式与来自BZLF1-wt的磷酸化磷酸化肽的迁移模式相同。经TPA处理后，BZLF1-S186A的磷酸肽图谱没有产生额外的斑点（图。B） 表明S186是体内磷酸化的靶点，可能涉及TPA激活的PKC。
S186A取消了BZLF1应答启动子的TPA激活和TPA应答。
S186位于BZLF1的DNA结合域，这引起了人们对其磷酸化是否可能是TPA增强BZLF功能的原因的关注。为了仔细研究这一假设，我们分析了野生型BZLF1和在186位携带丙氨酸替代物的BZLF1-S186A突变株在有无TPA的情况下，在BL41细胞中对BHRF1荧光素酶报告子构建pBHRF1-Luc的能力。如图所示。A（上面板）。从LPV启动子表达的BZLF1-S186A在反式激活BHRF1启动子时稍有受损，但其TPA诱导性显著降低。在胚胎肾细胞系293中也获得了较低水平的类似结果，表明这种现象不一定涉及B细胞特异性因子（图。A、 下部面板）。此外，测试了两个在186位携带酸性氨基酸天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）的BZLF1点突变体，BZLF1-S186D和BZLF1-S186E。它们都没有引起可测量的交易动机（图。A、 上部面板），表明该位置需要磷酸化，不能被负电荷取代。在159位携带苏氨酸替代物的BZLF1突变体（BZLF1-T159A）表现出与BZLF1-wt相似的表型，表明S186在介导TPA反应中至关重要（数据未显示）。
丝氨酸186的突变降低了BZLF1依赖性启动子的激活及其TPA诱导性。（A） （上面板）BL41细胞瞬时转染荧光素酶报告质粒BHRF1-Luc和BZLF1-wt、BZLF1-186A、BZLF1-S186D或BZLF1-S186E的组成表达载体。用TPA处理12 h后，收集并裂解细胞，测定荧光素酶活性，并与未处理细胞的提取物进行比较。报告活性表示为基于报告质粒和载体转染细胞中相对光单位的折叠刺激（左栏）。BZLF1突变体的表达水平与野生型（wt）BZLF相似，如Western blotting所证实的（数据未显示）。（下面板）对293个细胞重复与上面板中所述相同的测定，产生可比较的结果。（B） 用最小报告子瞬时转染BL41细胞构建4xZRE5tk-Luc，包含基础胸腺嘧啶激酶启动子上游的四个ZRE5位点。用越来越多的pLPV-BZLF1-wt或pLPV-BZLF1-S186A与细胞共转染，并用TPA处理或不处理，测定不同细胞提取物的荧光素酶活性，如图A所示。
由于BHRF1启动子结构复杂，我们还测试了一个最小的荧光素酶报告质粒，该质粒包含基础胸腺嘧啶激酶启动子（p4xZRE5tk-Luc）上游的四个多聚ZRE5位点。随着BZLF1-wt数量的增加，可证明多达五倍的反式激活和TPA诱导性，而BZLF1-S186A则没有（图。B） ●●●●。
BZLF1的表达足以触发EBV裂解周期的激活，从而从DNA复制的裂解起点诱导DNA扩增，奥利利特（有关审查，请参阅参考38). 因此，我们询问丝氨酸186的突变是否对BZLF1诱导DNA复制的能力有任何意义。奥利利特在瞬时复制试验中用奥利利特质粒p526，如前所述(28,57,59). 该质粒的扩增是裂解阶段DNA复制的直接结果。正如最近得出的结论，BZLF1中用丙氨酸取代丝氨酸186完全消除了p526扩增（数据未显示）(23).
总之，这些结果强调了丝氨酸186作为一种有助于转录和DNA复制的功能残基的重要性。然而，这些数据提出了一个问题，即丝氨酸186的磷酸化是否主要调节BZLF1的不同DNA结合基序的DNA结合亲和力。
丝氨酸186对TPA诱导增强BZLF1的DNA结合至关重要。
由于S186位于BZLF1的DNA结合域，预计该氨基酸的突变会影响BZLF的DNA结合亲和力。有趣的是，S186位于一段氨基酸中，与AP-1家族的其他转录因子（如c-Jun、c-Fos和GCN4）同源(21). 与DNA结合的c-Fos–c-Jun异二聚体的晶体结构表明DNA结合域中的五种氨基酸与DNA接触(26). 这五种氨基酸中有四种在c-Jun和BZLF1之间保守；它们对应于BZLF1的DNA结合域中的天冬酰胺（N）182、丙氨酸（A）185、半胱氨酸（C）189和精氨酸（R）190（图。A、 下部）。第五种氨基酸是c-Fos–c-Jun中的丙氨酸，对应于BZLF1中的S186。因此，正如之前所注意到的，BZLF1-S186A与c-Jun的核心DNA结合域相同(40). 在凝胶阻滞试验中，我们观察到细菌表达的BZLF1-S186A对一些但不是所有BZLF1结合位点的相对结合亲和力略有降低。就ZRE3A和ZRE5而言，与BZLF1-S186A形成的DNA-蛋白复合物较弱，但就ZRE2/7和AP-1位点而言，与BZLF1-wt形成的DNA蛋白复合物一样强，这两个位点都比ZRE 3A和ZRE5更好（图。A和未显示的数据）(46).
S186突变和TPA处理在BZLF1 DNA结合亲和力中的作用。（A） 用细菌表达和纯化的BZLF1-wt和BZLF1-S186A进行凝胶阻滞试验。电泳前，用带有不同ZRE或AP-1基序的标记寡核苷酸孵育等浓度的BZLF1蛋白。每个反应样品用不同制剂的提取物进行两次。由于不清楚的原因，未检测到与ZRE1寡核苷酸的复合物。作为对照，使用缺少BZLF1 DNA结合域的GST融合蛋白（GST-BZLFΔ167-245）。（B） 用转染BZLF1-wt和BZLF1-S186A的293个细胞的核提取物进行凝胶阻滞试验，并用TPA处理或不处理1小时。核提取物在没有或存在BZLF1特异性抗体Z125的情况下与标记的ZRE2/7或ZRE5寡核苷酸孵育。（C） B组中使用的转染293细胞核提取物中BZLF1的免疫检测表明，不同处理提取物中的BZLF蛋白数量相等。
为了确定TPA对BZLF1体内DNA结合亲和力的影响，我们对用pCMV-BZLF1-wt和pCMV-BZLF1-S186A瞬时转染的293细胞的核提取物进行了凝胶阻滞分析，无论是否进行TPA处理。同时，对核提取物进行Western blot分析，以确保等量的BZLF1（图。C） ●●●●。如图所示。B、 TPA处理可重复地增强BZLF1-wt的DNA结合亲和力，但不增强BZLF1-S186A的DNA结合亲合力，其表现出与细菌表达的BZLF1-S186A相似的DNA亲和力降低（图。A） ●●●●。这些观察结果表明，TPA处理提高了BZLF1的DNA结合亲和力，并强调了S186残基的重要性，这再次证明对TPA效应至关重要。
为了确认DNA蛋白复合物实际上包含BZLF1，使用BZLF特异性抗体（Z125）进行超移位分析(48)已执行。正如预期的那样，超移位复合物显示了ZRE2/7的更高的DNA结合亲和力（图。B） 以及TPA处理后带有BZLF1-wt的AP-1位点（数据未显示）。BZLF1-S186A的超移复合物没有TPA反应（数据未显示）。在竞争性凝胶位移分析中，DNA-蛋白复合物可以以浓度依赖的方式与相应的未标记寡核苷酸竞争，表明BZLF1对DNA识别的特异性（数据未显示）。
BZLF1磷酸化后细胞因子的假定招募。
作为DNA结合域组成部分的氨基酸的磷酸化通常抑制DNA结合亲和力(30). 因此，在S186处加入带负电荷的磷酸盐，类似于c-Jun，可能会直接接触DNA，这可能会导致DNA分子排斥。为了解决这个问题，我们分析了重组纯化的BZLF1的DNA结合，该BZLF在体外被PKCα磷酸化达50%（数据未显示）。正如预期的那样，体外磷酸化显著降低了DNA-蛋白质复合物形成的效率（图。; 将车道5和6与车道1和2进行比较，将车道e和f与车道a和b进行比较）。
一种假定的细胞因子可恢复体外磷酸化的BZLF1的DNA结合活性。在体外用PKCα磷酸化BZLF1后，分析细菌表达的BZLF与AP-1（左面板）或ZRE2/7（右面板）基序的不同寡核苷酸的相对结合亲和力。磷酸盐掺入率约为50%，用[32P] ATP（数据未显示）。如Western blotting所证实的，每个病例中使用了相当数量的非磷酸化和磷酸化BZLF1-wt（数据未显示）。在与指示样品中的适当寡核苷酸孵育之前，添加从模拟转染293细胞制备的核提取物。为了证明BZLF1在蛋白-DNA复合物中的存在，添加BZLF1-特异性抗体（Z125）以产生超转移复合物。放射自显影信号上方和下方的数字标志着与模拟转染核提取物孵育后相应样本对中信号强度的相对增强。信号强度通过荧光成像仪进行量化。
为了建立与体内相似的实验条件，在与标记的寡核苷酸在磷酸酶抑制剂存在下孵育之前，将体外磷酸化的BZLF1与293细胞的核提取物孵育。该重建实验使仅磷酸化的BZLF1的DNA结合亲和力增加了两到三倍（图。; 将车道5和6与车道7和8进行比较，将车道e和f与车道g和h进行比较，这与从经TPA处理的293细胞中提取的BZLF1-wt的大小大致相同（图。B） ●●●●。未磷酸化BZLF1未观察到此类影响（图。; 将通道5和7与通道1和3进行比较，将通道f和h与通道b和d）进行比较，表明推测的细胞因子可能以磷酸化依赖的方式参与。然而，在这些实验中，没有证据表明S186磷酸化后形成的移位复合物中有任何其他因子。
讨论
我们的研究结果表明，佛波酯诱导BZLF1的翻译后磷酸化，从而进一步激活天然和人工BZLF1-responsive启动子。用突变和嵌合BZLF1进行的转录激活分析表明，丝氨酸残基位于BZLF基本结构域的186位。我们的数据表明，S186在TPA处理后磷酸化，导致BZLF1蛋白的DNA结合和转录活性增强，而其他机制可以排除（例如，TPA处理后BZLF1的核转位增加[数据未显示]）。
体外PKC靶点S186的鉴定（图。)TPA刺激后在体内（图。)提示PKC可能是磷酸化BZLF1的激酶，因为S186位于保守的PKC磷酸化基序中（图。A） ●●●●。BZLF1-S186A突变体的表型特征是TPA对BZLF1应答启动子的作用显著降低（图。)，其效果与PKC抑制剂相当（图。A） ●●●●。因此，对这一发现最直接的解释是PKC磷酸化S186，以便在对TPA或相关刺激的快速反应中激活BZLF1。病毒滴度取决于内源性PKC水平的发现与这一假设相符。
我们的数据与Daibata和同事的数据相矛盾(13). 他们认为TPA诱导了去磷酸化，并且在用PKC抑制剂治疗后，BZLF1的磷酸化增强。尽管这些差异可能是细胞特异性差异或实验装置变化的结果，但我们也注意到突变型和野生型BZLF1之间磷酸肽点a到e的强度变化（图。). 因此，我们不能排除S186的磷酸化对BZLF1中其他磷酸受体残基也有影响的可能性。确定S186或S173(41)也是磷酸酶的靶点，如c-Jun所示(7). 此外，Jun家族成员被多种细胞激酶磷酸化(16,43,47)，其中一些也可能负责BZLF1的构成性磷酸化（图。) (41). 未来的研究应揭示PKC亚型的性质和BZLF1磷酸化发生的亚细胞位置。
S186磷酸化似乎对BZLF1在体内外的DNA结合潜力产生相反的影响。凝胶位移实验中添加的核组分部分恢复和改善了纯化和磷酸化的BZLF1的结合，这可能表明BZLF以磷酸化依赖的方式与另一种蛋白质合作（图。). 另外，核提取物中存在的磷酸酶活性或变构构象变化也可能调节S186磷酸化BZLF1的DNA结合亲和力。虽然我们缺乏细胞因子的物理证据，但这是一个有趣的假设，因为一些蛋白质相互作用涉及转录因子的基本DNA结合域以稳定DNA结合(17,33). 利伯曼及其同事的一份报告也支持这一发现，他们观察到TPA治疗后Raji细胞中与BZLF1一起诱导细胞结合活性(46). 如果这个假设是真的，S186突变为丙氨酸将干扰BZLF1相互作用因子的募集，从而导致无法对TPA或类似信号作出反应。
Francis和同事独立分析了一个BZLF1-S186A突变体(23)发现其结合ZRE位点或激活转录的能力不受影响。BZLF1-S186A，但不是BZLF1-S186T突变体，未能破坏EBV感染Raji细胞中的病毒潜伏期(22个)这意味着BZLF1-S186T中186位的苏氨酸残基可以像S186一样作为PKC底物。然而，没有尝试在PKC激活剂（如佛波酯）存在的情况下分析这些突变体。
我们认为仅仅结合BZLF1不足以实现其作为转录和复制因子的功能。为了充分激活，BZLF1需要在S186被磷酸化，可能是通过PKC或相关激酶。通过提供磷酸丝氨酸特异性对接位点，S186可能招募一种相互作用的细胞因子，该因子稳定DNA结合并增强转录激活。因此，未来的工作将集中于确定这一假定因素。
