《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8098–8104.
羧肽酶D（gp180）是一种高尔基体驻留蛋白，在乙型肝炎病毒粘附和进入中的作用
德国海德堡大学Zentrum für Molekulare Biologie，邮编69120
1998年4月10日收到；1998年6月23日接受。
摘要
羧肽酶D（gp180）是乙型肝炎病毒（HBV）的众多候选受体之一，经检测发现它是禽HBV的实际细胞受体。这一结论基于以下观察结果：（i）gp180是唯一与大鸭乙型肝炎病毒（DHBV）包膜蛋白的前S外结构域高亲和力结合的宿主蛋白，已知其对病毒感染至关重要；（ii）确定与gp180物理结合的前S亚结构域与感染竞争实验中定义为受体结合结构域的功能域一致；（iii）可溶性gp180缺乏膜锚，有效抑制DHBV感染；（iv）有效的种间gp180–前S相互作用仅限于禽肝炎病毒的自然宿主；和（v）gp180在异源肝癌细胞系中的表达介导的细胞附着和随后荧光标记的病毒颗粒内化为囊泡结构。然而，gp180的表达并没有使转染的异源细胞允许生产性感染，这表明融合需要一个种特异性的共受体来完成病毒的进入。与已知病毒受体的情况相反，在肝细胞表面未检测到gp180，但发现它集中在高尔基体中，在高尔基体内通过往返质膜发挥作用。
人类乙型肝炎病毒（HBV）是肝病毒科该科由土拨鼠、松鼠和一些鸟类（如北京鸭和灰鹭）中的成员组成。这些病毒都具有相同的基因组组织和病毒结构，具有独特的组织嗜性，宿主范围极窄，将其限制在自然宿主和一些密切相关的物种中(9). 通常认为，在病毒摄取过程中，这些病毒与其细胞表面受体的相互作用至少部分地导致了这种狭窄的宿主范围。尽管做出了重大努力，但对参与这些早期事件的参与者及其分子机制仍知之甚少。对于与医学相关的HBV，这主要是由于缺乏有效的体外感染系统；肝源性细胞系是不可感染的，而且，除了原代人肝细胞不易获得外，感染这些细胞的能力很差，并且因制备和供体而异(19). 因此，尽管已经假设了人类HBV的许多候选受体（参考文献综述4)在感染实验中，没有人被证明与肝病毒感染有关。
相比之下，动物模型鸭乙型肝炎病毒（DHBV）提供了可用的原代鸭肝细胞（PDHs）培养物，可以有效感染(29). 因此，该模型可以在分子水平上研究肝病毒感染周期的早期事件。作为与细胞受体分子结合的可能配体，禽嗜肝病毒通过在同一开放阅读框内的差异翻译起始编码两种相关的包膜蛋白：主要的S蛋白，提供80%的表面蛋白含量，和较大的L蛋白，其中S蛋白由161个氨基酸的亲水性前S结构域N末端延伸。这两种包膜蛋白也存在于大量分泌的非感染性亚病毒颗粒（SVP）中，使得这些颗粒在与宿主细胞的初始相互作用方面无法与含DNA的病毒颗粒区分开来。通过使用这些SVP，已经证明DHBV通过病毒L蛋白的前S结构域与肝细胞表面的细胞受体结合(13). 据报道，与DHBV L蛋白这一区域结合的候选受体是gp180，一种在鸭肝脏中发现的180-kDa糖蛋白(15). 该蛋白被分离、克隆并表征为一类新的膜结合羧肽酶的原型(16)，后来被指定为羧肽酶D(24). 来自其他物种的同源蛋白已被克隆并鉴定(27,36)，证实羧肽酶D是一种I型跨膜蛋白，由一个大的腔/细胞外部分、一个跨膜结构域和一个约60个氨基酸的C末端细胞质尾部组成。与受体功能一致，gp180以前曾被报道位于内膜和质膜(15). 然而，gp180（类似于其他物种的羧肽酶D）不仅在鸭肝脏中发现，而且在已知不易感染DHBV的各种其他组织中也发现。此外，转染LMH细胞（一种能够产生和分泌感染性病毒的鸡肝癌细胞系）后gp180的表达并不能使这些细胞允许DHBV感染(16). 最后，尚未报告gp180抗体可中和PDH的DHBV感染。因此，尽管禽乙型肝炎病毒系统具有实验优势，但仍需要澄清这些肝病毒进入细胞的机制、所涉及的细胞成分的性质，尤其是gp180在这些过程中的作用。
在感染竞争试验中使用重组前S多肽，我们在DHBV L蛋白的前S区内定位了一个亚结构域，该亚结构域是有效结合细胞受体所必需的(30). 获得的结果使我们得出结论，DHBV的摄取涉及两个不连续的步骤，gp180可能是一个主要的病毒附着位点。在补充工作中，我们在这里提供了在体外和细胞环境中用重组前S和病毒颗粒获得的直接gp180结合数据。我们的研究表明，gp180是一种Golgi-resident蛋白，是禽肝炎病毒的细胞受体，它介导病毒附着并内化到宿主细胞。然而，尽管病毒-gp180的结合有助于鸟类嗜肝病毒的宿主鉴别，但这种相互作用似乎不是其显著宿主特异性的主要决定因素。
材料和方法
gp180表达质粒。
gp180编码序列(16)由Kazuyuki Kuroki善意提供，通过Nco公司我将含有巨细胞病毒启动子和牛生长激素poly（a）位点的最小pUC质粒转化为质粒pC-gp180。pC-gp180型百万吨由一个类似的结构pC-myc-gp180衍生而来，该结构额外包含一个myc表位标签插入到第一个表位中千磅我的网站在编码区。突变体pC-gp180Tm公司在Ile-1334处的预测的跨膜区之后终止（…CVCSI.）。
荧光共轭物。
用5（6）-羧基荧光素将重组DHBV-pre-S与荧光素偶联N个-羟基琥珀酰亚胺酯（Boehringer Mannheim）。将10微升新制备的染料储备溶液（10 mg/ml二甲基亚砜）添加到0.5 mg前S中的1 ml缓冲液C（200 mM硼酸钠，pH 8.5）中。在室温下培养1小时后，使用PD-10柱（Pharmacia）将标记的前S从未反应的染料中分离出来并转移到磷酸盐缓冲液（PBS）中。用一步离心法从高滴度鸭血清中富集DHBV颗粒(13). 峰值分数（500μl），包含约1014用500μl 2×缓冲液C稀释的颗粒/ml按照上述方法进行标记。
生化结合测定。
他的全部6-按照其他地方的报告制备并处理标记的前S多肽(30). 根据制造商的说明（2 h，室温；100 mM NaP）将前S偶联到CH-活化的Sepharose（Pharmacia）我–100 mM NaCl[pH 6.5]–每mg干树脂中含有4 mg DHBV或HHBV pre-S）。通过Dounce在缓冲液H（150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl[pH7.4]，2 g抑肽酶/升，2 g亮氨酸蛋白酶/升，1 mM苯甲基磺酰基氟化物，1%Triton X-100）（5 ml/g肝脏）中均质制备肝脏提取物，并通过离心去除细胞核和碎片。将前S–Sepharose（500 pmol的前S）与200μl提取物和600μl缓冲液h在4°C下在没有或存在未偶联配体的情况下培养4 h（4°C）。用缓冲液W（不含蛋白酶抑制剂的缓冲液H）清洗Sepharose四次。用过量的游离前-S（50μl中360 nmol；37°C）洗脱特异性结合蛋白1 h，将其装载在十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上，并通过银染色检测；或者，将洗净的Sepharose重新悬浮在50μl Laemmli缓冲液中并煮沸10 min，然后通过Western blotting（ECL系统；Amersham）检测gp180。gp180与500 pmol的前S偶联到Sepharose的结合被测定为被50%的抑制，约5 pmol的游离前S；因此，将250 pmol的游离多肽用于竞争实验（见图。B） ●●●●。
gp180相互作用所需DHBV前S序列内区域的映射。（A） 用于绘制gp180结合域的一系列His-tagged前S多肽的示意图。左侧的数字对应于面板B中的车道。每个删除的边界在右侧给出。虚线反映了PDH竞争性DHBV感染的受体相互作用所需的最小结构域的边界(30). （B） 用抗gp180抗血清进行Western blot检测，检测与固定化DHBV前S结合的gp180，无论是否存在相应的竞争性前S多肽（A组中的1到10）。
感染抑制。
如前所述制备和培养PDH(23). 从培养上清液中纯化可溶性gp180（sgp180）高五昆虫细胞感染了编码gp180胞外结构域（氨基酸1至1308）的重组杆状病毒。重组病毒的构建和sgp180的纯化已在别处描述(6,31). 将sgp180和含有DHBV的鸭血清（100个含有DNA的颗粒/细胞）混合，并立即在500μl的维持培养基中应用于含有约8×105细胞。培养14小时后，清洗细胞并进一步培养。6天后，收集细胞，使用QIAamp血样试剂盒（Qiagen）制备细胞内病毒DNA，并进行DNA斑点杂交分析，如前所述(23). 放射性信号用分子动力学荧光成像仪定量。
内化分析。
HuH7细胞在六孔培养皿中培养或（用于共聚焦显微镜）在盖玻片室载玻片（Nunc）上培养，并通过使用标准磷酸钙方案或Superect（Qiagen）用表达gp180的质粒转染。转染后1至2天，用标记底物（50至100μl/ml培养基）在37°C下培养细胞4小时，用PBS洗涤，用3%多聚甲醛固定20分钟。用0.25%Triton X-100在PBS中渗透固定细胞，并用gp180多克隆抗体或，在gp180的情况下Tm公司使用Myc单克隆抗体（9E10），然后使用四甲基罗丹明结合的二级抗体。荧光分析采用Leica DM IRB倒置荧光显微镜（20×/0.40物镜）和Leica TCS NT共焦激光扫描显微镜（63×/1.2物镜）。
gp180本地化。
将培养在盖玻片上的PDH固定，并与gp180抗血清反应，然后与次级荧光素结合抗体反应。转染pC-myc-gp180的HuH7细胞在转染后1天固定，并与TGN46多克隆抗血清和单克隆抗体9E10共染。第二抗体分别与荧光素和四甲基罗丹明偶联。如上所述，通过共焦显微镜分析免疫荧光。
结果
gp180是鸭肝细胞中主要的前S结合蛋白。
添加重组DHBV前S多肽可有效抑制培养PDH的DHBV感染大肠杆菌(30). 因此，重组DHBV-pre-S能够与肝细胞上的病毒受体结合，并防止病毒结合和随后的感染。我们已经使用该重组蛋白来评估除先前报道的gp180外，细胞前S结合蛋白是否参与病毒附着，并且在感染抑制期间可能被前S靶向。为此，我们将DHBV前S共价固定到Sepharose（参见材料和方法），然后用鸭肝或PDH的Triton X-100提取物或溶解的肝膜培养该亲和矩阵。用过量的游离配体洗脱结合蛋白。尽管SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染色显示许多蛋白质从前S基质中洗脱出来（图。A、 左车道），gp180是洗脱液中唯一持续存在的蛋白质，无论输入来源如何，其与亲和矩阵的结合可以通过添加自由竞争前S蛋白来抑制（图。A、 右车道）或病毒颗粒（未显示）。通过Western blotting（图。B） ●●●●。观察到的与前S–Sepharose结合的速率常数证实了这种相互作用的特异性：通过测量上清液中gp180的消失（通过放射免疫印迹检测）及其在自由配体存在下的再现，我们估计该反应的发生率约为104M（M）−1秒−1; 在4°C下24小时后未检测到关闭反应，因此假设其速度低于3×10−6秒−1（未显示数据）。这些初步动力学数据得到了重组gp180和前S多肽的详细BIAcore分析的支持(31).
gp180是鸭肝脏中主要的DHBV前S结合蛋白。（A） 用SDS-PAGE和银染法分析从DHBV前S亲和基质中洗脱的鸭肝蛋白。在没有（−）或存在（+）100 pmol游离DHBV前S多肽作为竞争物的情况下进行结合。分子质量（千道尔顿）如右图所示。（B） 用抗gp180抗血清作为探针进行类似实验的免疫印迹。
DHBV L蛋白中决定与细胞受体功能结合和与gp180物理结合的结构域广泛重叠。
利用一组末端和内部缺失的前S多肽，感染抑制研究绘制了病毒L蛋白高效受体与氨基酸30至115结合的必要区域(30). 为了证实与该区域相互作用的细胞受体是gp180，我们使用了相同的缺失突变体（图。A） 映射gp180绑定所需的域。参照上述感染竞争，我们进行了结合竞争分析，在结合过程中存在过量的游离前S多肽；然后通过Western blotting检测未压缩的基质结合gp180（图。B） ●●●●。
通过该程序，突变体Δ22-30、Δ128-139和30-115（图。B、 泳道2、9和10）有效地抑制了gp180与DHBV pre-S基质的结合，表明gp180结合结构域位于氨基酸30和115之间。氨基酸30和115之间的缺失都会影响结合效率；通过前S突变体Δ52-61、Δ62-73和Δ74-84（3、4和5道）观察到一些剩余的gp180竞争能力，定义了一个内部结构域（氨基酸85到115），其中缺失完全消除了gp180相互作用（6、7和8道）。
这些gp180结合数据与用相同突变体和合成肽获得的互补受体相互作用数据显著相关(30). 另一种禽肝炎病毒灰鹭HBV（HHBV）的L蛋白也与功能性受体相互作用和gp180结合相关；HHBV前S多肽结合鸭gp180(1,11)阻止DHBV感染(30). 由于所有前S–gp180结合数据与来自感染竞争实验的相应细胞受体结合数据一致(30)我们得出结论，gp180是肝细胞表面DHBV的受体。
sgp180有效抑制DHBV感染。
为了进一步证实gp180是细胞DHBV受体，我们检测了缺乏跨膜区和细胞质域（sgp180）的重组gp180能否阻断PDHs的DHBV感染，如其他病毒受体系统，如人类免疫缺陷病毒（HIV）和CD4的情况(34). sgp180，从感染重组杆状病毒的昆虫细胞中获得(31)，用于与重组前S多肽类似的感染抑制试验(30). 随着PDH培养物中DHBV感染期间sgp180数量的增加，感染抑制以浓度依赖的方式发生（图。). 当sgp180浓度为7.5μg/ml时，感染几乎完全消失（抑制率>97%）；大约0.13μg/ml的浓度达到了50%的抑制，该浓度相当于每个DHBV颗粒中7个sgp180分子的浓度，假设在用于感染的血清中，DHBV病毒伴随着1000倍的非感染但具有受体结合能力的SVP。
sgp180能有效抑制DHBV感染。PDH与含有DHBV的鸭血清（102含有DNA的颗粒/细胞；14 h，37°C）。在感染后第6天，收集细胞并通过DNA斑点杂交检测细胞内DHBV DNA。将两个独立测量值归一化为在没有sgp180的情况下获得的值；条形图表示标准偏差。每毫升一微克sgp180相当于每种病毒颗粒约50个sgp180分子，假设为10三每个含DNA病毒的SVP。
gp180是一种Golgi-resident蛋白。
gp180以前被报道为细胞表面蛋白(15). 为了解决gp180的亚细胞定位问题，我们使用共焦显微镜对培养PDH中的内源性gp180进行免疫荧光分析。细胞在电镀后2天固定，用抗gp180抗血清进行免疫染色，并进行分析。通过这种方法，gp180仅在细胞内的管状、核周结构中检测到（图。A） 未发现在可检测的程度上存在于质膜上。
gp180集中在高尔基体中。（A） 用抗gp180抗血清对从小鸭中制备的PDH进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。（B） 将Myc表位标记的gp180转染HuH7细胞。在转染后1天，细胞被固定，并对gp180（四甲基罗丹明）（左面板）和内源性TGN46（荧光素）（右面板）进行联合免疫。通过共聚焦显微镜（对相同细胞的顺序扫描）分析荧光。
为了检测含有gp180的细胞间室的特性，我们将pC-myc-gp180（一种在巨细胞病毒启动子控制下表达myc表位标记的gp180的质粒）转染到HuH7细胞（人肝源性细胞系）中。转染后1天，用gp180的单克隆抗体9E10和抗高尔基体标志蛋白TGN46的抗血清对细胞进行共染色(21). 共焦显微镜分析显示，表达的gp180和内源性TGN46准确地共定位（图。B） 这表明gp180定位于高尔基体而非细胞表面。
gp180转染介导非许可细胞对DHBV颗粒的摄取。
如果gp180是细胞DHBV受体，人们会认为瞬时表达的gp180可以作为DHBV的受体，介导非许可细胞中的病毒摄取。为了检验这一点，用pC-gp180转染HuH7细胞（对DHBV感染不允许），用荧光标记的DHBV颗粒或重组DHBV前S多肽孵育，洗涤、固定，对gp180进行反免疫染色，并检查荧光病毒蛋白和gp180的存在和定位（图。). 通过Western blotting（未显示）验证gp180的表达。
gp180介导非许可细胞对DHBV颗粒或前S多肽的摄取。将gp180（A、B和C）或gp180转染HuH7细胞Tm公司，一个缺乏细胞质尾部的突变体（D）。用荧光标记的DHBV颗粒（A和B）或前S（C和D）孵育后，固定细胞并对转染的gp180（红色荧光）进行免疫染色。细胞核用DAPI（A）（蓝色荧光）染色。荧光分析采用常规荧光显微镜，使用相同细胞的连续多次曝光（A），或共焦荧光显微镜（B、C和D）（同步扫描）。
在这些实验中，荧光标记的病毒底物不仅与表达受体的细胞结合，而且选择性地内化。在图中。传统荧光显微镜显示病毒颗粒的这一点：总细胞的细胞核用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色，并被视为蓝色荧光。从这些细胞中，只有转染细胞（gp180，染色为红色）吸收标记颗粒（绿色荧光）。共焦显微镜显示，内化的病毒颗粒与gp180共定位于囊泡，主要是核周隔室（图。B） ●●●●。gp180的另一部分定位于管状结构，未发现与病毒颗粒相关。荧光标记的前S多肽以类似的效率内化（图。C） ●●●●。
此外，我们使用了一个构造（pC-gp180Tm公司)表示gp180（gp180）的C末端截断形式Tm公司)缺乏胞质结构域。在这种情况下，配体被发现与暴露的突变受体一起滞留在细胞表面，明显固定在质膜中，但不能进行内吞作用（图。D） ●●●●。综上所述，这些发现表明gp180在细胞表面与病毒结合，并能够将结合颗粒共内化。然而，根据免疫荧光分析结果判断，gp180表达的HuH7细胞未被感染，而在与含有DHBV的鸭血清孵育后第5天未检测到细胞内核心抗原（未显示）。
病毒-gp180相互作用是保守的，仅限于禽肝病毒宿主。
在DHBV感染竞争分析中(30)以及上述gp180结合竞争试验，发现来自DHBV和HHBV的禽前S蛋白在功能上是可互换的，这表明最初的gp180结合可能是这两种禽肝病毒摄取机制中的共同步骤。为了证实这一假设，我们研究了苍鹭肝提取物的gp180同源物是否是HHBV L蛋白的有效结合蛋白。使用固定化的HHBV前S多肽，条件与之前的鸭肝提取物实验中使用的条件相似（图。A） ，我们发现了一种类似的180-kDa结合蛋白（图。A） ●●●●。此外，正如已经用鸭肝提取物观察到的那样（图。A） 从基质中洗脱出许多非特异结合蛋白，其结合不受过量游离HHBV前S的影响。发现苍鹭gp180与DHBV前S结合的效率与鸭gp180相似（未显示）。相反，当我们分析鸡肝提取物时，其中包含类似水平的血清学交叉反应gp180同源物，我们无法通过银染色检测到该蛋白或任何其他蛋白与DHBV前S基质的特异性结合（未显示）。只有通过更敏感的Western印迹技术检测到鸡同源物的极弱结合（图。B、 下部面板）。在没有鸡肝病毒的情况下，这些观察结果表明，有效的前S–gp180相互作用是禽宿主肝病毒感染的一个共同特征。
有效的gp180–前S相互作用仅限于禽肝病毒宿主。（A） 用SDS-PAGE和银染法对苍鹭肝脏中的蛋白质进行洗脱和分析，这些蛋白质在无（−）或存在（+）250 pmol游离HHBV前S的情况下与HHBV的前S–Sepharose结合。（B） 来自类似实验的抗gp180免疫印迹，比较鸭肝gp180和鸡肝同源蛋白与DHBV pre-S–基质的结合亲和力。使用游离DHBV pre-S作为竞争对手来证明特异性结合（+）。在结合反应过程中，两种动物的蛋白质水平相似，所用抗体同样能检测到鸭和鸡的蛋白质。分子质量（千道尔顿）如右图所示。
讨论
本文的结果提供了令人信服的证据，证明羧肽酶D或gp180是宿主肝细胞表面禽肝炎病毒识别的受体。这一结论是基于几项观察结果得出的，这些观察结果对肝病毒进入机制具有各种普遍意义。首先，发现gp180是在鸭肝提取物和富含质膜蛋白的组分中检测到的唯一一种前S-特异性结合蛋白。我们的数据不排除其他DHBV结合蛋白在低水平上的存在，或其相互作用较弱；然而，考虑到gp180的高亲和力和明显丰度，这些分子似乎不太可能用作病毒受体。
其次，使用结合竞争分析，我们绘制了有效gp180相互作用所需的前S亚域，该亚域与之前在感染竞争实验中定义的受体相互作用域显著相关(30). 从这两种实验方法来看，相互作用域似乎被划分为一个对结合至关重要的核心域，范围从氨基酸85到115，以及一个N末端位置更高的区域，包括氨基酸30以下的序列，这增强了受体亲和力。这一观察澄清了早先明显矛盾的gp180–前S结合数据，该数据将结合域映射到氨基酸43至108(11)或氨基酸87至102(28)DHBV L蛋白。Bruns等人(2)最近报道了非感染性SVP增强DHBV感染。通过使用在L蛋白中携带缺失的重组SVP，导致这种增强所需的区域被映射到此处定义为gp180结合的核心相互作用域的相同氨基酸。这强烈表明感染增强需要SVP结合细胞受体gp180。
第三，sgp180以剂量依赖的方式有效地阻断了DHBV感染。据估计，每个病毒颗粒大约需要7个sgp180分子（假设包含约10个表面暴露的前S结构域）才能达到50%的抑制效果（图。). 如果是这样，这个结果表明病毒颗粒一旦被sgp180复合，就不能再进入细胞；这意味着细胞gp180以及细胞表面的其他假定结合蛋白不能轻易取代病毒结合的可溶性受体分子。此外，似乎通过可溶性形式的羧肽酶D介导病毒颗粒的潜在摄取(25)不是启动肝病毒感染的替代选择。
最后，使用荧光标记的DHBV颗粒和非许可性HuH7细胞，我们证明gp180介导了这些颗粒的摄取，表明gp180能够在细胞表面结合病毒并导致其内部化。这种内化似乎独立于病毒触发的受体寡聚化，因为单体前S多肽被同样好地吸收。
PDHs的免疫荧光研究表明，gp180仅在内部高尔基样室中检测到。事实上，在HuH7细胞中，瞬时表达的gp180与高尔基体标记蛋白TGN46共定位(21)，位于内部管状隔室中；正如gp180定位的初步分析所观察到的那样，它也在细胞表面以非常高的表达水平被检测到(15). gp180的细胞质结构域包含几个指示蛋白质细胞内分选的基序，例如，与CD3链的内吞作用类似的二亮氨酸基序(17). 因此，gp180缺乏细胞质尾部（gp180Tm公司)仍然迁移到质膜上，但它不能再被回收，因此在细胞表面积累（图。D） ●●●●。这些观察结果表明，gp180是一种Golgi-resident蛋白，通过以与TGN38或furin类似的方式从质膜中持续回收来保持其亚细胞位置(三,20). 通过检测小鼠羧肽酶D在垂体细胞系AtT-20的转高尔基网络中的循环，该模型也得到了支持(33). 据我们所知，gp180是Golgi-resident蛋白通过循环进入质膜而充当病毒受体的第一个实例。
荧光标记DHBV颗粒的内化（图。A和B）和gp180的细胞运输表明DHBV的摄取涉及内吞作用。这与表明生产性DHBV感染需要能量依赖性内吞作用的数据一致(14). 然而，我们的数据并没有排除融合发生在细胞表面的可能性，正如已知的HIV情况一样，尽管CD4受体被内化(20年).
已经提出了(18)gp180的羧肽酶活性可能参与摄取机制，处理内部裂解的L蛋白。到目前为止，我们还没有发现任何证据支持这一观点，作为一种有效的羧肽酶D抑制剂（2-巯基甲基-3-胍基乙基硫丙酸；50%抑制浓度=150 nM）(24)即使浓度高达100μM，也不会干扰DHBV感染(32).
羧肽酶D似乎是禽肝炎病毒的常见受体；HHBV和DHBV是该亚科中进化关系最远的病毒，在病毒配体和细胞受体分子之间表现出无限制的种间相互作用。DHBV前S和鸡羧肽酶D之间没有观察到这种相互作用，这表明受体水平的种间相互作用可能是DHBV相关肝病毒向其他鸟类宿主进化传播的先决条件。
在gp180表达质粒的转染实验中，原代鸡肝细胞的感染性不能达到可重复测量的程度(1). 此外，雏鸭或PDH培养物没有有效的HHBV交叉感染(7,10,26); 然而，呈现DHBV前S表面结构域的表型混合HHBV可有效感染PDH(7,10). 总之，这些观察结果进一步支持了这样一种观点，即在这些病毒进入的后期需要第二个宿主特异性因子（共受体）(30). 参与宿主和/或组织限制的共受体已被提出和/或鉴定为其他病毒，如腺病毒(35)、回声病毒(22)或者，最显著的是HIV，不同菌株与CD4结合，但使用不同的趋化因子受体作为融合的辅因子(5,8). 在本研究中，我们发现DHBV颗粒被表达gp180的HuH7细胞内吞，而不依赖于其他鸭子特异性因子；因此，我们假设目前未知的宿主特异性共受体参与了内吞作用后的一个重要步骤，很可能触发融合。因为我们和其他人(15,28)没有发现另一个前S结合蛋白，我们假设假定的共受体没有丰富的特征，也没有与这些病毒的前S外结构域高度亲和力。
虽然我们的模型令人满意地回答了大多数问题，但我们目前无法解决的一个矛盾是鸭子肝脏特异性DHBV感染的效率极高(12)尽管gp180普遍表达(15)以及病毒-受体相互作用的高亲和力。
到目前为止，还没有证据表明与gp180同源的蛋白质也可以作为HBV和其他哺乳动物肝病毒的受体。虽然在研究扩展到哺乳动物的情况之前，我们不能排除这种可能性，但哺乳动物病毒的进入机制以及所涉及的细胞和病毒成分的特征似乎与这里讨论的相似，尽管受体分子可能不相同。
致谢
我们特别感谢Kazuyuki Kuroki在最初的实验中提供了一些gp180表达结构、gp180抗体和建议。我们感谢Bärbel Glass制备PDH和提供鸭血清；Vas Ponnambalam提供抗TGN46抗血清；汉斯·威尔为苍鹭肝脏组织；Christa Kuhn和Stefan Seitz研究鸡肝组织；克劳迪娅·克鲁斯（Claudia Kruse）为获得纯sgp180做出了贡献；劳埃德·弗里克（Lloyd Fricker）、他的团队和马修·汉纳（Matthew Hannah）进行了有益的讨论；伊丽莎白·格里加西奇（Elizabeth Grgacic）的批判性阅读和建设性评论；和Karin Coutinho获得专家编辑协助。
K.M.B.感谢Boehringer Ingelheim Fonds博士的产前奖学金。这项工作得到了德国化学工业协会（SFB 229）和德国化学工业基金会（Fonds der Chemischen Industrie）的支持。
参考文献
1Breiner、K.B.和H.Schaller。未发布的数据。
2Bruns M，Miska S，Chassot S，Will H。非感染性亚病毒颗粒增强乙型肝炎病毒感染。《维罗尔杂志》。1998;72：1462–1468。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 3Chapman R E，Munro S.从细胞表面提取TGN蛋白需要内体酸化。EMBO J。1994;13:2305–2312. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4DeMeyer S，Gong J Z，Suwandhi W，van Pelt J，Soumillon A，Yap S H。乙型肝炎病毒（HBV）感染的器官和物种特异性：一篇文献综述，特别提到HBV优先附着于人类肝细胞。《病毒性肝炎杂志》。1997;4:145–153.[公共医学][谷歌学者] 5Doms R，W，Peiper S C.拿着万能钥匙的不速之客：HIV如何使用趋化因子受体进入细胞。病毒学。1997;235:179–190.[公共医学][谷歌学者] 6Eng F J、Novikova E G、Kuroki K、Ganem D、Fricker L D.gp180是一种结合鸭乙型肝炎病毒颗粒的蛋白质，具有金属羧肽酶D样的酶活性。生物化学杂志。1998;273:8382–8388.[公共医学][谷歌学者] 7Fehler，F.、S.Seitz和H.Schaller。未发布的数据。
8Feng Y，Broder C C，Kennedy P E，Berger E A.HIV-1进入辅因子：七跨膜G蛋白偶联受体的功能cDNA克隆。科学。1996;272:872–877.[公共医学][谷歌学者] 9Ganem D.Hepadnaviridae公司。In:Fields B N，Knipe D M，Howley P M，编辑。菲尔德病毒学。第3版，第2卷。宾夕法尼亚州费城：Lippincott-Raven；1996年，第2703–2737页。[谷歌学者] 10Ishikawa T，Ganem D.大病毒包膜蛋白的前S结构域决定了禽乙型肝炎病毒的宿主范围。美国国家科学院程序。1995;92:6259–6263. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Ishikawa T，Kuroki K，Lenhoff R，Summers J，Ganem D。宿主细胞表面糖蛋白与鸭乙型肝炎病毒前S蛋白结合的分析。病毒学。1994;202:1061–1064.[公共医学][谷歌学者] 12Jilbert A R，Miller D S，Scougall C A，Turnbull H，Burrell C J。低剂量病毒接种后鸭乙型肝炎病毒感染动力学：新生鸭中有一个病毒基因组具有传染性。病毒学。1996;226:338–345.[公共医学][谷歌学者] 13Klingmüller U，Schaller H.Hepadnavirus感染需要病毒前S结构域和特定肝细胞受体之间的相互作用。《维罗尔杂志》。1993;67:7414–7422. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Köck J，Borst E M，Schlicht H J。鸭乙型肝炎病毒通过内吞作用进入肝细胞，但不需要病毒通过酸性细胞间室。《维罗尔杂志》。1996;70:5827–5831. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Kuroki K，Cheung R，Marion P L，Ganem D.一种结合禽乙型肝炎病毒颗粒的细胞表面蛋白。《维罗尔杂志》。1994;68:2091–2096. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Kuroki K、Eng F、Ishikawa T、Turck C、Harada F、Ganem D.gp180是一种结合鸭乙型肝炎病毒颗粒的宿主细胞糖蛋白，由羧肽酶基因家族的一个成员编码。生物化学杂志。1995;270:15022–15028.[公共医学][谷歌学者] 17Letourneur F，Klausner R D.一种新的二亮氨酸基序和一种基于酪氨酸的基序独立地介导溶酶体靶向。单元格。1992;69:1143–1157.[公共医学][谷歌学者] 18Li J S，Tong S P，Wands J R。120千道尔顿前S-结合蛋白作为鸭乙型肝炎病毒候选受体的表征。《维罗尔杂志》。1996;70:6029–6035. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Mabit H、Vons C、Dubanchet S、Capel F、Franco D、Petit M A。用于乙型肝炎病毒受体研究的原代培养的正常人肝细胞。肝素杂志。1996;24:403–412.[公共医学][谷歌学者] 20Molloy S S、Thomas L、VanSlyke J K、Stenberg P E和Thomas G。呋喃前蛋白转化酶的细胞内转运和激活：TGN定位和细胞表面再循环。EMBO J。1994;13:18–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20a之间。Pelchen-Matthews A，Armes J E，Griffiths G，Marsh M.淋巴细胞和非淋巴细胞中CD4的差异内吞作用。《实验医学杂志》。1991;173:575–587. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Ponnambalam S、Girotti M、Yaspo M L、Owen C E、Perry A C、Suganuma T、Nilsson T、Fried M、Banting G、Warren G。大鼠TGN38的灵长类同源物：初级结构、表达和功能意义。细胞科学杂志。1996;109:675–685.[公共医学][谷歌学者] 22Powell R M，Ward T，Evans D J，Almond J W。回声病毒7及其受体衰变加速因子（Cd55）之间的相互作用：a颗粒形成中次级细胞因子的证据。《维罗尔杂志》。1997;71:9306–9312. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Rigg R J，Schaller H。鸭乙型肝炎病毒感染肝细胞并不依赖于低pH值。《维罗尔杂志》。1992;66:2829–2836. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Song L，Fricker L D.牛垂体羧肽酶D（一种新型羧肽酶类E酶）的纯化和表征。生物化学杂志。1995;270:25007–25013.[公共医学][谷歌学者] 25Song L，Fricker L D。金属羧肽酶D的可溶性和膜结合形式的组织分布和表征。生物化学杂志。1996;271:28884–28889.[公共医学][谷歌学者] 26Sprengel R，Kaleta E F，Will H。苍鹭特有乙型肝炎病毒的分离和鉴定。《维罗尔杂志》。1988;62：3832–3839。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Tan F，Rehli M，Krause S W，Skidgel R A.人类羧肽酶D的序列显示它是具有三个串联活性位点域的调控羧肽酶类的成员。生物化学杂志。1997;327:81–87. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Tong S，Li J，Wands J R.鸭乙型肝炎病毒与170k道尔顿细胞蛋白之间的相互作用通过前S区的中和表位介导，并在病毒感染期间发生。《维罗尔杂志》。1995;69:7106–7112. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Tuttleman J S，Pugh J C，Summers J W。鸭乙型肝炎病毒原代肝细胞培养物的体外实验感染。《维罗尔杂志》。1986;58:17–25. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Urban S、Breiner K M、Fehler F、Klingmüller U、Schaller H.禽乙型肝炎病毒感染是由一个不同的前S亚结构域与细胞受体gp180的相互作用引起的。《维罗尔杂志》。1998;72:8089–8097. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Urban S、Kruse C、Multhaup G。禽乙型肝炎病毒受体的一种可溶性形式：受体-配体复合物的生化特征和功能分析。1998年提交出版。[公共医学][谷歌学者] 32南部城市。未发布的数据。
33Varlamov O，Fricker L D.金属羧肽酶D在AtT-20细胞中的细胞内转运：定位于跨高尔基网络并从细胞表面再循环。细胞科学杂志。1998;111:877–885.[公共医学][谷歌学者] 34Weiss R A.受体分子阻断HIV。自然。1988;331:15.[公共医学][谷歌学者] 35Wickham T J、Mathias P、Cheresh D A、Nemerow G R。整合素αvβ3和αvβ5促进腺病毒内化，但不促进病毒附着。单元格。1993;73:309–319.[公共医学][谷歌学者] 36Xin X，Varlamov O，Day R，Dong W，Bridgett M M，Leiter E H，Fricker L D。编码大鼠羧肽酶D的cDNA的克隆和序列分析。DNA细胞生物学。1997;16:897–909.[公共医学][谷歌学者] 
