细胞受体的鉴定及其与病毒颗粒在分子水平上的相互作用的表征是基础病毒学和医学病毒学的一个主要重点，为针对多种病毒病原体，如流感病毒、小核糖核酸病毒、，疱疹病毒、腺病毒和人类免疫缺陷病毒(27,41). 尽管做出了重大努力，但对乙型肝炎病毒（HBV）的认识还没有达到一个可比的水平，HBV是一个小型的包膜DNA病毒家族，以一种主要的人类病原体为原型，导致哺乳动物和鸟类的急慢性肝感染(25). 缺乏对人类HBV（HBV）进入机制的了解反映了由于肝病毒的宿主范围狭窄和组织嗜性导致的主要实验困难，这限制了对人类肝细胞原代培养物感染的研究。能够支持转染病毒DNA基因组产生病毒的细胞株是可用的，但对HBV感染是难治的，因为它们缺乏细胞受体，也可能缺乏启动感染所必需的其他特性(13). 因此，目前只有间接证据支持这样的假设，即HBV感染是由与病毒特异性肝细胞受体的相互作用引起的。在与病毒包膜蛋白或包膜衍生肽的结合研究中，许多蛋白质被认为是候选受体（有关最近的总结和综述，请参阅参考文献2). 然而，由于原代人肝细胞在可复制感染的状态下不容易获得(8,22)，所有这些初步结果仍有待于感染实验的直接证据的补充。
鸭乙型肝炎病毒（DHBV）动物模型取得了实质性进展，相比之下，该模型允许用家畜培养的原代鸭肝细胞（PDHs）进行系统感染实验(38). 特别是，与已知的HBV表面蛋白相比，人们对禽肝炎病毒表面蛋白在细胞粘附和进入中所起的作用了解得更多。在DHBV中，有两种非糖基化包膜蛋白嵌入脂质包膜：主要的S蛋白，一种由167个氨基酸（aa）组成的跨膜蛋白，提供80%的表面蛋白含量，以及较大的L蛋白（大表面蛋白或前S/S多肽），其中S蛋白由161个氨基酸的亲水性前S结构域N末端延伸(31). 相比之下，HBV编码三种糖基化包膜蛋白，最初被指定为表面抗原或S抗原。DHBV的两个包膜蛋白也存在于无核衣壳类病毒颗粒（亚病毒颗粒[SVPs]）中，其比率与病毒粒子中的比率相当。与所有肝病毒感染一样，DHBV SVP是由受感染细胞和成熟病毒共同分泌的，分泌量约为成熟病毒的1000倍。因此，SVP为旨在阐明肝病毒摄取的基本特征的结合和感染研究提供了一种有价值的、现成的病毒替代品。通过使用该工具，在感染竞争和PDH结合竞争实验中获得了可滴定细胞DHBV受体存在的初步证据。此外，通过使用酵母中产生的仅含一个包膜蛋白的重组SVP，L蛋白的前S结构域被鉴定为对受体相互作用至关重要。从这些数据可以得出结论，DHBV感染是由病毒颗粒通过表面暴露的前S结构域与肝细胞表面受体分子的特异性附着引起的(17).
其他一些观察结果表明，表面暴露的亲水性前S结构域是决定肝病毒宿主范围狭窄的主要因素，也强调了前S结构区对DHBV感染早期发生过程的重要性。根据禽和正己烷病毒前S基因产物之间的选择性高序列差异，初步预测了前S在宿主限制中的作用(34). 最近在伪型鹭类乙型肝炎病毒（HHBV）感染实验中获得了支持这一假设的证据，该实验表明，用含有DHBV前S序列的嵌合L蛋白补充HHBV颗粒后，鸭肝细胞的允许性增加了100倍(4,14).
尽管这些观察结果表明DHBV前S结构域包含病毒配体，但迄今为止，鸭肝细胞表面的相互作用细胞伙伴仍然难以捉摸。唯一有希望的候选蛋白质是gp180(18)，也称为p170(37)，一种约180kDa的膜相关糖蛋白，通过其对DHBV L蛋白或重组前S融合蛋白的高亲和力鉴定。然而，gp180在其他相关性质上与DHBV受体的预期规格不相关，该受体与禽肝病毒的组织嗜性或窄宿主范围相匹配：（i）gp180大量存在于不支持DHBV感染的鸭组织中(18,37); （ii）gp180被证明与HHBV的前S多肽无差别地结合(15)，一种不能感染北京鸭的病毒(33); 和（iii）gp180尚未显示在转染LMH细胞时赋予DHBV感染的易感性，LMH细胞是一种对感染难治但能够在转染基因组DHBV时产生病毒的鸡肝癌细胞系。因此，与DHBV感染起始有关的分子和机制仅部分了解，细胞受体单位仍不清楚。
在本报告中，我们讨论并解决了其中一些相关问题。通过在感染竞争实验中详细描述DHBV前S结构域，前S亚结构域对于感染来说是必要的，但并不足够。以及相关研究的数据(1)本研究提供证据表明，肝病毒的摄取至少分两个步骤进行：首先，DHBV与一个初级受体分子结合，我们建议该受体分子为gp180，作为一种低物种特异性受体复合物的组成部分，并与所有禽肝病毒共有；随后，与第二受体（可能是宿主范围的主要决定因素）的未经确认的相互作用导致核衣壳释放和生产性感染。
材料和方法
质粒构建物。
重组表达前S多肽的质粒大肠杆菌通过将相应的编码序列插入稍微修改过的表达载体pQE 8（Qiagen）中构建，如图。A.为此目的，来自DHBV亚型3、16或26的前S编码基因片段(24,34,35)，HHBV亚型4(33)和HBV亚型(7)通过PCR从模板质粒中扩增Pfu公司聚合酶（Stratagene）和寡核苷酸引物引入巴姆HI站点之前和千磅编码序列后的I位点（图。A） ●●●●。DHBV DNA模板（26亚型）编码具有内部缺失突变的L蛋白(6)由Hans Will（德国汉堡）提供。
中预S-编码序列的表达式大肠杆菌重组蛋白的纯化。（A） 将前S编码序列插入经千磅我/Hin公司材料和方法中所述的dIII连接器（装箱序列）。显示了编码全长pre-S和S区域的前4 aa的构造。数字801和1295表示亚克隆片段的第一个和最后一个核苷酸，其后是终止密码子（下划线）。六个氨基末端组氨酸残基和六个额外的载体编码氨基酸显示在核苷酸序列上方的一个字母代码中。（B） 镍亲和层析2+-次氮基三乙酸柱。从重组人的总细胞裂解液中纯化六组氨酸前S融合蛋白大肠杆菌如材料和方法中所述，此处显示的是从aa 1到119的DHBV前S片段。如图所示，使用0至250 mM的咪唑梯度进行洗脱。合并分数用括号标记。外径280280nm处的光密度。（C） 从图B所示的亲和柱洗脱的组分的银染SDS凝胶。标记蛋白的分子量显示在右侧。（D） 在Superdex 200色谱柱（法玛西亚）上重新命名的DHBV pre-S的洗脱曲线。V（V）0以及甲状腺球蛋白（670 kDa）、丙种球蛋白（158 kDa12（1.3 kDa），用于校准，显示在顶部。
重组前S多肽的表达、纯化和排阻色谱大肠杆菌。
大肠杆菌用各自的表达质粒转化M15pREP4细胞（Qiagen），并在1升TB培养基（每毫升含100μg氨苄西林和25μg卡那霉素）中生长至0.8至1.0的光密度（λ=600 nm）。用IPTG（异丙基-β）诱导基因表达-d日-硫代吡喃半乳糖苷）。诱导后3 h，通过4000×克用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细菌颗粒20分钟，并将其储存在−20°C下，或立即用25 ml溶解缓冲液（6 M盐酸胍，100 mM NaP）孵育溶解我，10 mM Tris，pH 8.0）。通过10万倍离心澄清裂解液克持续15分钟，将上清液涂敷在镍上2+-腈三乙酸琼脂糖（Qiagen）柱（床体积，8ml）连接至快速蛋白质液相色谱系统（Pharmacia）。用7 M尿素–100 mM NaP平衡后我–10 mM Tris（pH 8.0），在pH 6.3下洗脱非特异性结合的蛋白质。组氨酸标记的前S多肽的洗脱是通过线性咪唑梯度从0到250 mM咪唑在10到15个床层体积中实现的。收集3ml的组分，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。将含有纯化前S多肽的组分混合，然后立即按如下所述进行透析或在−20°C下冷冻保存。
将用于感染竞争实验的前S多肽与以下含盐和尿素浓度降低的缓冲液进行逐步透析，以完全去除任何微量变性剂：（i）4 M尿素–50 mM NaP我pH 6.0至6.3；（ii）2 M尿素–20 mM NaP我，pH值6.3；和（iii）20 mM NaP我pH值为6.3（5升三次）。根据各自的理论消光系数，从280nm处的吸光度计算蛋白质浓度。透析后通过SDS-PAGE控制所有蛋白的完整性。
在连接至快速蛋白质液相色谱系统（Pharmacia）的校准Superdex 200色谱柱（1.6×60 cm；Pharmacial）上对DHBV前S进行凝胶过滤，并在5%蔗糖–150 mM NaCl–25 mM NaP中进行平衡我pH 7.0（温度，4°C；流速，2.2 ml/min；样品体积，0.5 ml）。用甲状腺球蛋白（670 kDa）、丙种球蛋白（158 kDa12（1.3千Da）。
gp180结合竞争试验。
制备DHBV前S–Sepharose和肝细胞提取物，并按照其他说明进行结合反应和Western blot分析(1). 作为竞争对手，将DHBV前S多肽或DHBV阳性鸭血清加入到结合反应混合物中。根据血清中DHBV DNA含量估计DHBV L蛋白的量，假设每个含有DNA的病毒粒子有1000个SVP，每个SVP有20个L蛋白分子(17).
化学合成DHBV前S多肽。
合成的多肽如下：DPS 1（aa 60～139），QNQGAWPAGAGRVGLSNPTPQEI PQPQWTPEEDQKAREAFRYQEERPPETTIPSSPPQWKLQPGDP LLGNQSLLE；DPS 3（aa 80至139），PQEIPQPQWTPEEDQKAREAFRRYQEERPPETTIPSSPPQWKLQPGDDPLLGNQSLLE；DPS 4（aa 98至139），EAFRRYQEERPPETTIPPSSPPQWKLQPGDDPLLGNQSLLF；DPS 6（aa 115至139），PPSSPPQWKLQPGDDPLLGNQSLLE；DPS 7（aa 82至121），K（K）EIPQPQW速度QKAREAF科威特航空公司EERPPETTTIPSSPPQ；DPS 9（aa 82至121），K（K）EIPQPQ公司YAEDD公司DQKAREAFRRYQEERPPETTIPSPSPPQ；DPS 12（aa 82至121），K（K）EIPQPQW速度QKAREAFRRYQEERPPETTIPPSSPPQ；和DPS 13（DPS 12加VP1重复四次）(K（K）EIPQPQW速度QK AREAFRRYQEERPPETTIPPSSPPQK（K）)4K（K）2LRGDLQVLAQKVARTL公司加利福尼亚州多肽FMDV VP 1（aa 144至159）（LRGDLQVLAQKVARTL）作为对照。DHBV亚型16氨基酸序列的变化以粗体表示。在竞争实验中，将多肽重新悬浮在PBS中，并以16至160μM的浓度使用。
蛋白质分析。
根据Laemmli的方法，用15%聚丙烯酰胺-双丙烯酰胺进行SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE(20)Schägger和von Jagow(30). 在加载之前，将蛋白质溶解在SDS样品缓冲液中并煮沸5分钟。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝R250直接染色，或固定在30%乙醇–10%乙酸中，并用银染色，如前所述(12).
DHBV和HHBV SVP的制备。
用最初开发的HBV检测方法从感染雏鸭的血清中分离出DHBV的SVP(11). 病毒经紫外线照射灭活。以碳酸酐酶和重组DHBV前S多肽为标准，用SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定SVP中病毒包膜蛋白的浓度。如前所述，从转染HHBV亚型4超长基因组的LMH细胞培养上清液中获得HHBV病毒颗粒(33).
PDH的制备和感染竞争试验。
如前所述制备和培养PDH(29). 用于感染竞争分析，8×105在12孔板中培养3至8天的细胞感染了4×107在存在或不存在灭活SVP或重组前S多肽的情况下，含有DNA的DHBV颗粒（通过DNA斑点印迹法测定）。对于后者，在150μl 20 mM NaP中储备溶液我（pH 6.2）补充350μl含有感染性DHBV血清的维持培养基，并在37°C下孵育12小时。用PBS冲洗细胞两次，然后再培养9天。在第5天到第9天收集培养上清液。病毒颗粒以100000×克1h后，重新悬浮在100μl PBS中，并通过DNA斑点印迹定量。10万×克自旋蛋白用于免疫斑点印迹法测定鸭乙型肝炎病毒e抗原(29). 所有分析均使用分子动力学磷成像仪进行分析。
结果
重组DHBV前S多肽竞争DHBV感染。
SVP对DHBV感染的抑制作用取决于大包膜蛋白前S结构域的存在(17). 为了测试与L蛋白残基1至161相对应的分离前S多肽是否足以引起这种效应，在大肠杆菌.通过PCR扩增包含相应阅读框的DNA片段，并将其亚克隆到细菌表达载体中，以使其氨基末端先于包含六组氨酸标签的12-aa先导序列（图。A） ●●●●。利用该系统，可获得高产量的重组蛋白（约20毫克/升大肠杆菌但在大多数情况下，它们被发现位于包涵体中。因此，通过亲和层析纯化His标记多肽是在变性条件下常规进行的（见材料和方法）。这一单一纯化步骤（如图所示，DHBV前S多肽从aa 1到119。通过SDS-PAGE和银染色判断，B和C）产生了基本纯净的多肽。通过对混合峰组分的逐步透析去除变性剂。在此过程中，只发生了少量沉淀，观察结果表明，在去除变性剂的过程中没有发生明显的蛋白质聚集。二维（2D）核磁共振分析数据证实了这一结论(40)表面等离子共振光谱（BIAcore）也表明DHBV前S分子结构均匀，没有聚集(39). 全长重组DHBV前S多肽代表了正确折叠的分子的均匀群体，这也通过其在Superdex 200柱上凝胶过滤中作为单峰的迁移来确定（图。D） ●●●●。观察到的表观分子质量（46 kDa）大大超过了177-aa多肽（19822 Da）的计算质量，这已通过电喷雾质谱法证实，表明DHBV前S多肽可能在所选条件下形成二聚体。然而，在变性剂（如7 M尿素或6 M盐酸胍）的存在下，在校准凝胶过滤中未观察到洗脱位置的变化（数据未显示），这表明DHBV前S多肽很可能是作为单体存在的，其表观分子量的增加是由非小叶结构引起的。
为了检测重组DHBV前S多肽是否具有生物活性，在之前使用L蛋白作为DHBV SVP的一部分进行的感染竞争试验中对其进行了测试(17). 在存在越来越多的前S多肽的情况下，用DHBV感染PDH，并通过测定分泌到培养基中的DHBeAg的相对量来测定感染抑制作用(29). 获得的结果（图。)证明了大肠杆菌-衍生的DHBV全长前S多肽（16亚型）以浓度依赖的方式影响DHBV感染，在所选条件下，浓度为0.4至0.8μM时，抑制率达到50%。DHBV亚型3和26的前S多肽分别有7和15个氨基酸不同，与DHBV 16亚型的前S蛋白具有相同的特异性竞争活性。除非另有规定，否则在所有实验中都使用了子类型16。
重组DHBV前S多肽对DHBV感染的竞争。PDH（8×105)感染了4×107DHBV颗粒在浓度增加的情况下大肠杆菌-衍生DHBV前S蛋白（16亚型）。通过分泌到培养基中的DHBeAg的免疫斑点印迹分析来确定感染后第5天和第9天之间的病毒复制，并以未压实对照感染值的百分比表示（有关详细信息，请参阅材料和方法）。每个点代表三个独立实验的平均值；条形图表示标准偏差。
为了排除感染竞争是由前S多肽与病毒颗粒的相互作用而不是与细胞表面受体的相互作用引起的可能性，我们培养了碘化DHBV前S多肽类(125I-DpreS），并在校准过的Superose 12HR凝胶过滤柱上分析成分。正如预期的那样，SVP在空隙体积中洗脱，而125I-DpreS仅在46 kDa洗脱，无聚集形成，无论是否存在SVP（数据未显示）。综上所述，这些结果表明DHBV前S多肽通过与细胞表面受体的相互作用足以进行竞争，此外，已知前S的翻译后修饰发生在动物细胞中，但不发生在大肠杆菌（例如，肉豆蔻酰化和磷酸化[9,23])不是这种抑制的先决条件。
末端缺失突变体将85-aa前S多肽定义为高效受体相互作用所必需的。
为了描述竞争活动所需的DHBV前S结构域内的区域，我们从适当删除的前S阅读框中产生了末端截短的前S多肽。测试的9个突变体示意图如图所示。A： 三个羧基末端缺失的突变体（DpreS1-130、DpreS1-119和DpreS1-99）、三个氨基末端缺失的突变（DpreS22-165、DpreS23-165和DpreS52-165）和三个缺乏DHBV前S的C末端和N末端部分的组合突变（DpreS52-130、D preS23-130和DpreS30-115）。如图所示，纯化突变蛋白并对其进行表征。B和C，然后与全长DpreS1-165作对照，测试它们与DHBV感染竞争的能力。该分析的DHBeAg免疫斑点印迹结果如图所示。B、 上述缺失突变体的生物活性如图所示。A.去除前12或23 aa（DpreS12-165和DpreS23-165）（第5和第6行）以及删除前S（DpreS-130和DpreS1-119）的最后31或42 aa（第2和第3行）并没有显著改变感染竞争，观察结果表明，两个末端的各自氨基酸对前S活性是不必要的。通过检测结合末端缺失的多肽DpreS23-130（第9行）证实了这一结论。再次发现该化合物与前S1-165参考蛋白（第1行）活性相同。进一步缩短DpreS30-115的两个末端仍然导致具有完全抑制活性的前S多肽（第10行），而具有更广泛缺失的前S链，如DpreS1-99、DpreS52-165或DpreS52-130，无法与DHBV感染竞争（第4、7和8行）。
末端缺失的DHBV前S多肽与DHBV感染的竞争。PDH（8×105)感染4×107在全长或末端缺失的重组DHBV前S多肽浓度增加的情况下，含有DNA的颗粒。（A） 测试的氨基和羧基末端缺失突变体示意图。左边的数字表示多肽的极限，用条形图表示。注意，整个前S序列包括aa 1至161（图。A） ●●●●。浅灰色条对应于具有感染抑制作用的多肽，如全长多肽（aa 1至165）；深灰色条代表失去活性的多肽突变体。（B） DHBeAg斑点杂交分析从感染后第5天到第9天收集的PDH培养基中，存在面板A中描述的前S多肽。多肽浓度显示在顶部。DHBeAg的定量如材料和方法中所述。每个点对应一个12孔培养板的单孔。显示了每种浓度的两个独立实验。相对于第1行中的参考（在第2行和第10行中可见），竞争活性的明显差异是制剂依赖性的，并且在使用另一种多肽制剂的独立实验中不能再现。
图中所示的所有末端缺失都观察到了这种明显的差异。即使多肽浓度高达10μM（未显示）。相比之下，通过两个额外的缺失突变体DpreS38-115和DpreS43-115获得了中间活性（尽管大大降低）。这些多肽显示出大约15倍的抑制能力，因为50%的抑制需要8μM的蛋白质浓度（未显示），这表明aa 30和51之间的前S序列包含有助于前S受体有效相互作用的元素。综上所述，这些数据将前S序列（aa 30至115）中心的85-aa结构域定义为最小的、完全活性的竞争多肽。这种最小的竞争对手与全长前S蛋白在特定活性上没有可检测到的差异，这是在许多感染竞争实验中确定的。
受体结合域内的短缺失消除了前S竞争。
为了确定最小竞争对手中对前S受体相互作用至关重要的序列元素，通过测试Fernholz最初构建的一系列内部前S缺失突变体，扩展了上述竞争分析(6)PCR扩增后亚克隆到pQE表达载体中。如材料和方法所述，纯化突变蛋白并用于感染竞争分析。通过感染后细胞培养上清液的SDS-PAGE和Western blotting确定多肽在感染竞争中的稳定性。
如图所示。（第2行和第9行），受体结合域外的缺失，如DpreSΔ128-139和DpreS△22-30中的缺失，并不影响前S竞争，这证实了前S链的末端序列对我们的分析确定的受体结合没有实质性贡献。相反，更出乎意料的是，影响中央前S结构域各个部分的缺失都会导致感染抑制的完全丧失，如图所示。对于突变体DpreSΔ107-125、DpreS△101-109、DpreS-Δ85-96、DpreS/Δ74-84、DpreS.Δ62-73和DpreSδ52-61（第3行至第8行）。即使DpreSΔ62-65和DpreS△67-70中删除了4-aa，竞争能力也会被废除（数据未显示）。这种对基本上覆盖所有结合域的内部缺失的敏感性表明，上述定义的DHBV前S亚域与其细胞受体在分子水平上的相互作用是由一个确定的三级结构而不是序列元素的拼凑构成的。
内部缺失的前S多肽与DHBV感染PDHs的竞争。（A） 突变多肽（DHBV前S亚型26）示意图。删除内容通过条形图中的间隙显示。浅灰色条表示蛋白质突变体，其行为类似全长前S；深灰色的条状物代表失去抵抗感染能力的蛋白质突变体。通过分析末端缺失的DHBV前S多肽确定的最小竞争区域（aa 30至115）显示为方框。注意，DHBV前S亚型26在位置146处编码额外的氨基酸。因此，全长蛋白包含166个氨基酸。（B）与全长DHBV pre-S（第1行）相比，在存在不同内部pre-S突变体（第2行至第9行）的情况下，来自PDH的培养基的免疫斑点印迹分析。DHBeAg的定量如材料和方法中所述。显示了每种浓度的两个独立实验。
40-aa核心DHBV前S序列的低相互作用电位随着寡聚化而增加。
虽然对绝大多数末端和内部缺失进行了测试，获得了明确的结果，但如上所述，在构建物DpreS38-115和DpreS43-115中观察到了一些残余活性。这表明，最小结合域的N末端部分虽然有助于结合，但对前S受体相互作用并不是严格必要的。早期一项使用一系列化学合成DHBV前S多肽的感染竞争研究结果支持了这一解释(16). 在这些实验中，总结如下表测试了一种80肽，包含DHBV前S的aa 60至139，以及一系列相关肽，这些肽在20 aa的步骤中被最终缩短。含有aa 60至139（DPS 1）、80至139的DHBV前S多肽（DPS 3）和82至121（DPS12）的竞争活性仅在160μM（所用的最高浓度）下可重复检测，这大约是含有最小竞争序列（pre-S aa 30至115）的重组DHBV pre-S多肽半最大抑制所需浓度的200倍。
表1
| 肽（aa）一 | 活动(K（K）我，微米）b条 |
|---|
| DPS 1（60–139） | +（ND） |
| DPS 3（80–139） | +（ND） |
| DPS 4（98–139） | −（ND） |
| DPS 6（115–139） | −（ND） |
| DPS 7（82–121） | −（ND） |
| DPS 9（82–121） | −（ND） |
| DPS 12（82–121） | + (100) |
| DPS 13（[82–121]4VP1） | + (4) |
| FMDV VP1（144–159） | −（ND） |
该分析的结果确定了位于80和121位之间的核心前S序列，该序列与初始的80聚体具有相同的活性，但对从任一端去除额外的20个氨基酸以及对突变改变敏感，分别改变核心序列中5或4个氨基酸的嵌段。有趣的是，在化学合成过程中，通过与支链载体的连接，核心40-mer的竞争活性在四聚反应后增加了40倍以上。利用这种四聚体多肽，在约4μM肽单体上可实现对DHBV感染的半最大抑制（表). 这些数据表明，与肝细胞表面的几个受体分子同时协同作用，可能会增强与单体核心40-mer检测到的低亲和力。
SVP中的前S结构域比单体前S多肽竞争更有效。
在上述实验中，我们分析了重组DHBV前S链，表明其处于单体非聚集状态（图。D） 与细胞表面受体的相互作用。合成前S肽的感染竞争表明配体齐聚增强了竞争能力。因此，测定作为DHBV颗粒表面L蛋白一部分的DHBV前S链的比活性很有意义。这些实验与图中所示的实验类似。对于重组前S多肽，使用已经相对于重组多肽的前S含量标准化的SVP制剂。在三个独立的稀释系列中，发现需要24、56和36 nM颗粒相关前S蛋白才能50%抑制DHBV感染。考虑到约一半的前S畴未暴露在颗粒表面上(10,36)这些数据表明，与重组DHBV前S链相比，颗粒相关的前S链显示出大约30倍的活性（0.6μM用于半最大抑制[图。]). 考虑到前S多肽的生物物理性质，另一种解释是，只有一小部分重组前S多酚被正确折叠，这似乎极不可能，如图1所示。D。
在一项结合竞争实验中，通过比较前S链与gp180的亲和力，进一步证明了我们制备的重组多肽在结构上均一，在功能上与天然DHBV前S链等效的假设，我们有充分证据表明，鸭糖蛋白是禽肝炎病毒的细胞受体（见下文和参考文献1). 在这个实验中（图。)在来自去污剂破碎SVP的DHBV L蛋白中，重组前S和前S结构域对gp180的亲和力没有显著差异。因此，我们得出结论，颗粒相关前S链的活性显著增强可能反映了它们在病毒颗粒表面的特殊空间排列，也可能反映了颗粒与肝细胞上不止一个受体分子相互作用的能力。
重组DHBV前S多肽结合gp180的亲和力与颗粒衍生DHBV L蛋白相当。显示了在竞争性游离DHBV前S多肽（DpreS）或来源于DHBV感染小鸭血清的DHBV L蛋白（L蛋白）浓度增加的情况下，与固定化DHBV的前S多多肽结合的蛋白质印迹检测gp180。车道上方的数字表示gp180与固定化DHBV pre-S结合期间存在的自由竞争物的数量。gp180的特异带显示在右侧。
HHBV前S多肽抑制DHBV感染。
据推测，禽肝炎病毒DHBV和HHBV之间的宿主区分是相应前S结构域序列转移的结果。事实上，DHBV和HHBV前S结构域的氨基酸序列相差50%，这表明在受体相互作用的水平上存在差异（见图。). 为了测试这种物种特异性差异是否确实可以检测到大肠杆菌-我们分析了衍生的HHBV前S多肽以及转染LMH细胞产生的HHBV-SVP对DHBV感染的竞争性干预能力。重组HBV前S多肽是根据禽前S蛋白的方案制备的，用于代表与DHBV前S序列没有显著同源性的较远相关的哺乳动物肝病毒(34).
DHBV（第16亚型，上排）和HHBV（第4亚型，下排）前S结构域氨基酸序列的比较。氨基酸位置由行旁的数字表示。保存的氨基酸被装箱。HHBV pre-S序列中的插入显示在括号中。代表受体结合结构域（aa 30至115）的最小竞争区由DHBV前S序列顶部的条表示。
图A显示了在存在竞争性HHBV pre-S、DHBV pre-S或HBV pre-S的情况下，来自感染DHBV的PDH细胞的DHBeAg免疫斑点印迹的结果。正如预期的那样，HBV pre-S多肽没有竞争。然而，HHBV前S能有效抑制DHBV感染。事实上，在我们的检测灵敏度范围内，未检测到HHBV和DHBV前S多肽之间的差异。HHBV SVP感染抑制试验结果证实了两种一级序列明显不同的多肽之间的功能等效性。如图所示。B、 HHBV SVP表现出与DHBV SVP相当的抑制作用，在前S浓度约为30 nM HHBV L蛋白时达到50%的抑制作用。因此，我们得出结论，DHBV和HHBV与各自宿主肝细胞上密切相关的初级受体分子相互作用。因此，HHBV和DHBV生产性感染的宿主特异性存在显著差异，导致HHBV对PDHs的感染性降低100倍(4)这一定与病毒颗粒与细胞表面初始高亲和力结合后病毒摄取的一个步骤有关。
DHBV感染与异源前S蛋白的竞争。感染比赛按照图中图例的描述进行。和（A）在存在HHBV前S多肽（HepreS）、DHBV前S肽（DpreS）和HBV前S-多肽（HupreS）或缓冲液的情况下，对感染DHBV后5至9天PDH培养基进行免疫斑点杂交分析。多肽浓度显示在顶部。对于每个浓度，显示了两个独立的测量值。（B） HHBV SVP感染DHBV的竞争。分泌的DHBeAg数量以未经编码的对照感染值的百分比表示。
讨论
通过在感染竞争试验中使用重组DHBV前S多肽，我们表征了肝病毒感染中功能重要的病毒-细胞表面相互作用。我们进行了一些观察，这些观察大大有助于我们了解肝病毒感染早期关键事件的分子机制。
研究发现，与细胞表面受体的有效相互作用需要约80 aa的异常延伸结构域，该结构域跨越DHBV前S链的约一半。这个功能性定义的受体相互作用域对内部缺失高度敏感，这表明它需要完整性才能形成一个特殊的3D结构，其中关键残基与受体相互作用，并且不像其他一些病毒那样由短的一级序列基序来表示(41)最初也建议用于HBV(26). 在校准凝胶过滤中，前S多肽的表观分子量异常高也表明前S结构域中存在特殊的3D结构，如图所示。D.由于受体相互作用域外的缺失对感染竞争没有影响（图。，第2行和第9行），该结构域似乎在前S部分内独立折叠。我们目前正在建立该领域的3D结构(40)，这可能允许我们破译对受体相互作用重要的常见结构基序。我们还注意到，定义为受体相互作用的结构域（aa 30至115）包含在连接子扫描突变定义的区域内，该区域对DHBV感染至关重要，但对病毒形成不重要（aa 6至114）(21).
另一个有趣的观察结果是，SVP上的前S结构域的抑制潜力比来自大肠杆菌然而，重组前S多肽和单体DHBV L链与gp180的相互作用同样良好（图。)DHBV受体蛋白如下所述。因此，SVP在感染竞争中的活性增强很可能反映了前S链的有序2D排列，作为颗粒表面膜锚定L蛋白的一部分。如核心前S多肽的低聚物所观察到的那样，这种呈现可能会促进前S受体的协同作用（表). 根据我们目前的实验，我们不能排除的一种可能性是，前S结合通过涉及L蛋白S部分、S蛋白亚基或DHBV包膜磷脂的病毒-细胞相互作用而稳定。
最后，令我们非常惊讶的是，感染竞争活性不受HHBV前S结构域中50%氨基酸差异的影响（图。). 该观察结果进一步支持了结构元素在前S受体相互作用中起主导作用的模型。此外，关于宿主歧视，它推翻了病毒对接是导致DHBV和HHBV宿主范围不同的主要歧视性事件的假设，尽管减少病毒与宿主细胞的结合，降低对DHBV感染的敏感性，表明这一步骤也可能在宿主特异性中发挥作用(28). 有趣的是，与DHBV前S相比，HHBV前S的氨基酸序列在受体结合域的边界上包含两个插入（图。). 该观察结果表明，结构元素而非序列元素具有进化保守性，从而在表面表位中提供了高度的变异性，从而避免了宿主防御系统的识别。
符合上述主要受体定义的候选细胞受体是糖蛋白gp180，这是一种被归类为羧肽酶D家族成员的跨膜蛋白(19,32). 支持gp180可能是我们通过功能性分析处理的分子这一观点的是对DHBV感染（本报告）或物理gp180结合竞争所需的前S氨基酸序列的比较：使用相同的一组内部缺失突变体，我们观察到前S的重要功能部分（aa 30到115）几乎与前S结合所需的结构域重叠(1). 在类似的方法中，结果与我们的定量结果基本一致，Ishikawa等人(15)早先已将gp180结合位点映射到aa 43至108，而Tong等人则将其映射到了aa 87至102(37). 此外，我们对一种不区分HHBV和DHBV的细胞表面受体的功能表征解决了由Ishikawa等人最初报道的令人困惑的观察结果引起的冲突(15)HHBV pre-S也与鸭gp180结合，我们通过在类似分析中包括苍鹭gp180证实并扩展了这一点(1). 最后，这份补充报告(1)通过共焦显微镜清楚地证明，gp180介导细胞对DHBV颗粒的摄取，而且gp180是一种高尔基滞留蛋白，可往返于质膜。考虑到这种动态受体呈现，似乎不可能使用高温下感染竞争的数据（如本文和之前的研究所述[17])可靠评估细胞表面病毒结合位点的数量。
综合这些数据，我们认为肝病毒的细胞摄取至少包括两个步骤，涉及不同的前S决定簇，这些前S决定因子对宿主歧视有不同的贡献。最初的步骤显然涉及一个定义的前S亚结构域与gp180的相互作用，gp180是一种几乎没有物种特异性的主要受体，至少在这里研究的两种远亲禽病毒之间是如此。最初的结合事件之后是与目前未知成分的物种特异性相互作用，可能涉及前s的更多氨基末端部分(14). 人类免疫缺陷病毒存在二级共受体水平的病毒进入歧视，不同菌株与CD4结合，但在感染中使用不同的趋化因子受体作为强制性辅因子(三,5). 类似地，gp180似乎只是复杂病毒进入机制的第一个组成部分，该机制包含一个额外的（但未知的）共受体和细胞因子，从而完成病毒感染。
