在缺乏血清中和抗体的情况下预防致命性脑心肌炎病毒感染^†

病毒库存。

心脏病毒EMCV株Rueckert和vMC₂₄[弱毒Mengo病毒株在5′-非编码区多（C）区部分截断；其他人在早期出版物中称为pM16(9,10)]由Ann C.Palmenberg（威斯康星大学麦迪逊分校）提供。库存通常为10⁷到10¹⁰每毫升蔗糖纯化病毒制剂的PFU。

病毒接种。

将幼鼠腹腔内接种（i.p.），接种范围为（10²到10⁸EMCV或vMC的PFU）₂₄在1.0 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。接种后≥2周，一些vMC₂₄-接种小鼠腹腔注射10⁴EMCV的PFU以证明免疫效果。被感染的小鼠表现出典型的心脏病毒疾病症状，如共济失调、体重减轻、步态异常、肢体瘫痪或瘫痪，并进展到完全静止状态，则被视为濒死并被摧毁。

抗体。

产生针对CD4（TIB 207；大鼠免疫球蛋白G2b和CD8（TIB 210；大鼠抗体G2b）的单克隆抗体的杂交瘤是从美国类型培养物收集中获得的。未经处理的腹水积水数值/数值根据制造商的说明，使用脂质清除溶液（Clinetics，Tustin，Calif.）对BALB/c小鼠进行治疗，对其进行热灭活、过滤消毒，并将其储存在−70°c下。

细胞培养。

RHAβ^−/−脾细胞（vMC₂₄免疫或幼稚）与活EMCV或vMC混合培养₂₄和人类重组interleuk-2 IL-2（Hu-rIL-2；Hoffmann-La-Roche Inc.，Nutley，N.J.）。培养方案包括两个阶段，抗原特异性激活导致IL-2受体表达上调，随后激活细胞的IL-2依赖性扩增，如前所述(29). 免疫脾细胞的单细胞悬浮液是通过在无血清的冷冻RMPI 1640中通过铁丝网挑逗器官制备的，污染的红细胞通过低渗休克进行溶解。使用Lymphoprep（Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway）分离活细胞，然后在PBS中洗涤三次。重悬于补充有2%热灭活的同基因正常小鼠血清的RPMI 1640中的细胞在2.5×10⁶至5.0×10⁶75-cm直立细胞/ml²烧瓶（Costar 3275；Costar Corp.，Cambridge，Mass.），用2.5×10刺激⁷至5.0×10⁷活病毒的PFU（每细胞感染10个PFU的多重性）。培养物在37°C、5%CO的增湿环境中培养₂持续3天，然后添加胎牛血清（FCS）（10%，最终浓度）和Hu-rIL-2（25 U/ml，最终浓度。

流式细胞术分析。

用流式细胞术检测细胞表面标记物的表达。所有抗体均为异硫氰酸原荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）偶联物（PharMingen，San Diego，CA）。使用了以下试剂：大鼠抗小鼠CD4-PE、大鼠抗鼠CD8-FITC、仓鼠抗小鼠T细胞受体α/β链-FITC、大鼠抗小鼠CD25（IL-2受体α链）-PE、仓鼠抗鼠CD69（极早期激活抗原）-PE，大鼠抗老鼠CD71（转铁蛋白受体）-PE和仓鼠抗鼠CTLA-4–PE。将洗涤后的细胞重新悬浮在含有1%牛血清白蛋白（BSA）和0.2%叠氮化钠（染色缓冲液）的PBS中。双色免疫荧光染色通过孵育10⁶96周U型底部微孔板（Costar 3799；Costar）中单个微孔中的细胞与相关单克隆抗体在冰上放置45分钟。培养后，用冷冻染色缓冲液清洗细胞三次，并用1%多聚甲醛固定。使用FACScan和CELLQuest软件（Becton Dickinson）进行流式细胞术分析。淋巴细胞群首先通过大小（正向散射）和复杂性（侧向散射）的物理特性进行门控；然后10000 CD8⁺-染色细胞被选通并分析表面标记物的表达。

被动转移和致命EMCV挑战。

通过微中和试验测定中和血清抗体滴度，并表示为最大稀释倍数的倒数，以提供HeLa细胞单层对vMC的完全保护₂₄根据特定的病毒接种(9). 2周前用10⁷vMC的PFU₂₄滴度为2048。在腹腔注射10μl免疫血清24小时前，给受体小鼠静脉注射500μl免疫血浆⁴EMCV的PFU。被动转移受者的中和抗体水平由EMCV攻击前4小时获得的血清测定，范围在512到1024之间。

体外T淋巴细胞耗竭。

脾细胞（5×10⁷/ml）用适当的单克隆抗体（用含有0.3%BSA的RPMI 1640稀释1:100的腹水）在冰上处理1小时，然后在37°C下在1:10稀释的兔补体（Low-Tox-M；Cederlane Laboratories，Hornby，Ontario，Canada）中培养1小时。通过台盼蓝排除法测定细胞活力。流式细胞仪分析对去细胞前后的细胞进行检测，以确定该方法的疗效；抗CD8+补体的一个周期能够使CD8耗竭>97%⁺T细胞亚群。

体内T淋巴细胞耗竭。

通过抗体治疗，体内T淋巴细胞亚群减少(43). 简言之，在第-2天和第0天静脉注射1 mg抗CD4（克隆GK1.5）或抗CD8（克隆2.43）腹水或两者。根据流式细胞术分析（数据未显示），抗体治疗导致第0天每个试验组代表动物的特异性T淋巴细胞亚群耗竭≥98%。消耗殆尽的小鼠随后用10⁴第0天EMCV i.p.的PFU。经粗略检查，接受抗体治疗的对照小鼠未表现出不良反应。

CTL靶细胞的制备。

新鲜RPMI 1640中重新悬浮的MC57细胞–10%FCS在CTL试验前24小时感染EMCV（每个细胞10个PFU）。通过添加100μCi Na标记细胞⁵¹铬氧化物₄（储备浓度，1 mCi/ml）并在37°C和5%CO中培养90分钟₂。这些⁵¹用PBS清洗铬标记靶三次，再悬浮在1.0 ml培养基中，然后计数。对照靶细胞是未感染的MC57细胞，以与感染靶相同的方式标记。

CTL分析。

培养7天后，收集活细胞并用作CTL效应器。对效应细胞进行两次系列稀释，一式三份。⁵¹Cr标记的靶细胞（10⁴将每0.1 ml细胞）添加到96周U形底部微孔板中的所有微孔中，最终效应物与靶（E:T）的比率为200:1、100:1、50:1、25:1、12.5:1和6.25:1。标记细胞的放射性自发释放是通过单独培养目标细胞获得的。通过用2%十二烷基硫酸钠溶解靶细胞来确定放射性的最大释放。板材以200倍的速度旋转克2分钟，并在37°C和5%CO中培养5小时₂。培养后，在800×克持续4分钟，并评估100μl培养上清液⁵¹γ计数器中的Cr释放（LBK-Wallac 1272 CLINIGAMMA；LBK-Wallab，Turku，芬兰）。计算重复井的平均值，结果表示为压井百分比，计算为[（实验计数−自发计数）/（最大计数−自然计数）]×100。病毒感染和未感染对照组的平均自发释放量介于最大放射性释放量的10%至20%之间。在一些实验中，效应细胞群在体外被处理以耗尽CD8⁺或CD4⁺T细胞，或仅补体，在用于CTL分析之前。

vMC公司₂₄-诱导病毒血症。

尽管vMC的精确衰减机制₂₄尚不确定，正常小鼠在接种后2周内清除CNS中的病毒，并且没有表现出心脏病毒病症状(9). 自RHAβ^−/−小鼠持续表现出致命的vMC₂₄-诱发的心脏病毒病（图。​（图1），1)，我们测定了垂死小鼠血清和大脑中的病毒滴度。天真的老鼠接受了10次⁴任一vMC的PFU₂₄或EMCV静脉注射，并监测心脏病毒疾病症状的发展。作为阳性对照，所有感染EMCV的小鼠菌株都出现了疾病症状，并在第5天到第6天进展到垂死状态，与血清中可测量的病毒滴度一致，范围为4×10²至40×10²PFU/ml（表​（表1）。1). 同样感染野生型Mengo病毒的幼鼠在第5-7天死亡（数据未显示）。所有菌株感染vMC的小鼠₂₄保持临床健康的患者显然解决了免疫性病毒血症，这反映在他们的血清中没有可检测的病毒。健康的vMC大脑中没有病毒滴度₂₄-感染的RHAβ^−/−小鼠进一步证实了它们清除感染的能力。如预期，vMC₂₄-RHAβ诱导的心脏病毒病^−/−小鼠与血清相关（范围0.1×10²至40×10²PFU/ml）和大脑（范围，6×10⁵至100×10⁵PFU/g脑匀浆）病毒滴度。

对致命EMCV挑战的抵抗力。

vMC免疫健康免疫小鼠₂₄具有高水平的中和抗体滴度，对致命的EMCV攻击具有抵抗力(9,29). 自RHAβ^−/−缺乏CD4的小鼠⁺T细胞依赖性体液反应(15)但可以解决vMC₂₄感染，我们检查了vMC₂₄-免疫RHAβ^−/−小鼠可以抵御致命的EMCV攻击。尽管一些动物死于vMC₂₄-诱导的心脏病毒病，大部分RHAβ^−/−接种10只小鼠⁴vMC的PFU₂₄存活（图。​（图1）1)似乎已经清除了病毒（表​（表1），1)这表明这些小鼠可能已经产生了有效的免疫反应。小鼠受到致命的10次攻击⁴免疫后21天腹腔注射EMCV的PFU。所有对照组C57BL/6和β₂米^−/−小鼠在vMC中存活₂₄免疫，并免受致命的EMCV攻击（图。​（图2），2)而所有未免疫的幼年小鼠在第5-7天死于EMCV诱导的心脏病毒病。同样，少量（七分之二）RHAβ^−/−vMC导致小鼠死亡₂₄免疫；更有趣的是，五分之四的vMC₂₄-免疫RHAβ^−/−小鼠在致命的EMCV攻击下存活下来。总体而言（未显示数据），存活vMC的85%以上₂₄-免疫RHAβ^−/−小鼠受到保护，免受致命攻击，表明存在保护性免疫反应。类似地，RHAβ^−/−接种10只小鼠⁴vMC的PFU₂₄被保护免受致命的野生型Mengo病毒攻击（数据未显示）。

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图2

vMC24免疫RHAβ的致命EMCV攻击^−/−老鼠。幼鼠（株C57BL/6，β₂米^−/−和RHAβ^−/−)用10⁴实时vMC的PFU₂₄。在免疫后第21天，存活小鼠受到10只致命的攻击⁴EMCV i.p.的PFU，并监测致命性心脏病毒疾病的发展。非免疫对照组在第21天也受到类似的挑战。数据代表了四个实验。

vMC中的血清中和抗体滴度₂₄-免疫小鼠。

鉴于vMC令人惊讶的观察结果₂₄-免疫RHAβ^−/−小鼠在致命的EMCV攻击下存活下来（图。​（图2），2)，我们检测了vMC中不太可能存在的血清中和抗体₂₄-免疫RHAβ^−/−老鼠。vMC后14天₂₄免疫后，从用于图。​图22并通过微中和试验评估中和抗体滴度。如预期，C57BL/6和β₂米^−/−由于vMC，小鼠具有中和抗体的保护性滴度₂₄免疫接种（表​（表2）。2). 效价从128到512不等，之前的水平表明足以抵御致命的EMCV攻击(29). 这些小鼠受到5×10的致命攻击⁴免疫后第21天检测EMCV的PFU，13天后重新评估血清滴度。类似报道(29)，在EMCV攻击后观察到增强的血清中和滴度，其升高范围为256到1024。

遵循vMC₂₄免疫，存活RHAβ^−/−小鼠未表现出可检测到的血清中和抗体滴度，这与早期的报告一致，即MHCⅡ类缺陷小鼠对TMEV缺乏明显的体液反应(31)，另一种心脏病毒。事实上，vMC₂₄-免疫RHAβ^−/−在没有可检测到的中和抗体的情况下，小鼠存活了致命的EMCV攻击（表​（表2）2)提示这些小鼠具有非体液代偿性保护性免疫反应。

体内CD8耗竭⁺淋巴细胞。

CD8的最新特征⁺MHCⅡ类缺陷小鼠存在淋巴细胞依赖性效应器机制(10,18,31,45,46)再加上我们发现vMC₂₄-免疫RHAβ^−/−在没有中和抗体的情况下保护小鼠（表​（表2），2)，促使我们研究CMI参与的可能性。被动转移500μl免疫血清的所有三种幼年小鼠菌株都能免受致命的EMCV攻击（图。​（图3）。三). 这种保护可能由这些小鼠中仍然存在的中和抗体介导，在vMC中保持不变₂₄-免疫C57BL/6和β₂米^−/−体内CD4后的小鼠⁺或CD8⁺T淋巴细胞耗竭。vMC24免疫RHAβ^−/−小鼠未受到抗CD4的影响⁺T淋巴细胞治疗，因为这些小鼠很少或没有CD4⁺T淋巴细胞。有趣的是，CD8的消耗⁺vMC中的T淋巴细胞₂₄-免疫RHAβ^−/−六只小鼠中有五只小鼠取消了保护，清楚地表明CD8⁺T淋巴细胞在免疫保护中至关重要。所有缺乏CD4的幼年小鼠菌株⁺或CD8⁺T淋巴细胞在EMCV攻击后死亡（数据未显示）。

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图3

体内T淋巴细胞亚群耗竭。幼鼠（株C57BL/6，β₂米^−/−和RHAβ^−/−)用10⁴vMC的PFU₂₄以10分致命挑战⁴EMCV免疫后第21天腹腔注射的PFU。在某些情况下，免疫小鼠的CD4被耗尽⁺或CD8⁺如材料和方法所述，在致命激发前使用抗体治疗T淋巴细胞。耗竭导致体内特异性T淋巴细胞亚群减少>98%。一些非免疫对照组在激发前24小时静脉注射500μl免疫血清（滴度>2048）。数据代表了三个实验。

vMC的细胞溶解活性₂₄-免疫RHAβ^−/−脾细胞。

我们(29)和其他(5,11)此前已证明CD4介导的体外CTL活性⁺和CD8⁺分别使用vMC的T淋巴细胞效应物₂₄-免疫小鼠脾细胞。此外，最近的一份报告(31)体外CD8描述⁺RHAβ中T淋巴细胞CTL活性^−/−小鼠对抗密切相关的心脏病毒TMEV。因此，我们测定了vMC的细胞溶解潜能₂₄-免疫RHAβ^−/−脾细胞。RHAβ^−/−采集免疫脾细胞并用活vMC进行大量培养₂₄或EMCV 7天（参见材料和方法），然后再用于CTL分析。活体vMC产生的脾效应器₂₄在100:1的比率下，EMCV感染的MC57靶点的特异性裂解率为35%，非感染靶点的杀伤率仅为17%（图。​（图4A）。4A） ●●●●。类似地，EMCV产生的效应器分别显示45%和19%的受感染和未受感染靶点裂解（图。​（图4B）。4B） ●●●●。CD8耗尽⁺CTL试验前的T淋巴细胞显著降低了vMC对病毒感染靶点的细胞溶解活性₂₄-和EMCV产生的效应器种群，令人信服地证明了CD8⁺T淋巴细胞依赖性溶解机制。作为RHAβ^−/−小鼠没有CD4⁺T细胞，vMC的细胞溶解活性₂₄-CD4治疗对EMCV产生的效应器的影响最小⁺T细胞耗竭。同样，补体单独治疗不会影响两个效应组的细胞溶解活性（数据未显示）。

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图4

vMC的细胞溶解活性₂₄-免疫性RHAβ^−/−脾细胞。vMC公司₂₄-免疫脾细胞与活vMC培养₂₄（A） 或EMCV（B），并在CTL分析中以不同比例用作效应细胞⁵¹Cr标记的EMCV感染MC57靶细胞。在某些情况下，效应细胞的数量会耗尽CD8⁺CTL分析前的细胞。流式细胞术测定，衰竭有效率>97%。这些数据代表了三个实验。

CD8表达激活标记⁺T淋巴细胞。

最近的一项研究(37)报告称已启动CD8⁺T淋巴细胞在体外对抗原具有高反应性，并且与幼稚细胞相比，不同地表达各种细胞表面活化标志物。因此，作为CD8的推论⁺T淋巴细胞参与vMC的保护₂₄-免疫RHAβ^−/−小鼠，我们对RHAβ的活化标记表达进行了表型特征分析^−/−CD8（CD8）⁺活体vMC批量培养中的T脾细胞₂₄.

我们使用植物血凝素刺激的CD8⁺来自原始RHAβ的T细胞^−/−小鼠作为阳性对照，因为T淋巴细胞的有丝分裂刺激诱导几种细胞表面活化分子的表达上调(三,19). CD25表达的平均荧光强度（MFI）比较表明，CD8⁺来自vMC的T细胞₂₄-免疫性RHAβ^−/−在用同源免疫原刺激后，小鼠（MFI=100）表达了该细胞表面活化标记物的升高水平（表​（表3）三)与来自原始RHAβ的细胞相比^−/−小鼠（MFI=58）。此外，16%的vMC₂₄-免疫性RHAβ^−/−CD8（CD8）⁺T细胞表达高水平的CD25，而CD8仅为7%⁺来自原始RHAβ的T细胞^−/−用病毒体外刺激小鼠。对CD69、CD71和CTLA-4表达的评估显示，在vMC之间，MFI模式和表达高水平激活标记的细胞百分比相似₂₄-免疫和天然RHAβ^−/−CD8（CD8）⁺T细胞。这些观察结果可能反映了病毒特异性CD8的频率增加⁺RHAβ中的T淋巴细胞^−/−小鼠跟随vMC₂₄免疫，以及引物CD8的抗原依赖性高反应⁺T淋巴细胞在体外，导致表面活化分子的表达升高。

我们感谢A.C.Palmenberg慷慨赠送vMC₂₄Marchel Goldsby-Hill在项目期间提供了宝贵的技术支持和有用的建议，D.Mathis允许我们使用MHC II级缺陷RHAβ^−/−老鼠。

这项工作得到了农业与生命科学学院、美国农业部国家需求研究计划90-38420-5254和国防部DAAH 04-96-1-0126的支持。