EB病毒即刻早期基因产物BRLF1在病毒裂解周期中与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用

摘要

EB病毒（EBV）是一种淋巴营养型人类γ-疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症的病原体，与多种淋巴恶性肿瘤相关，包括伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金病和免疫功能低下人群的淋巴增殖性疾病（参考文献综述38). EBV似乎也是鼻咽癌上皮癌的主要病原体(54).

原代B细胞的感染主要是潜伏性的，只有一部分病毒基因被表达。感染后，细胞迅速进入增殖期，最终永生。永生过程需要六个潜伏相关基因，即Epstein-Barr核抗原（EBNA1、-2、-3A、-3C和-LP）和潜伏膜蛋白1。潜伏感染细胞中的病毒基因组被维持为一个由宿主聚合酶复制的环状上位体(41).

EBV驱动的细胞永生化机制尚不完全清楚，但似乎与小型DNA肿瘤病毒不同。腺病毒(55,78,80)，乳头瘤病毒(19,45,77)和猴病毒40(17,45,55)它们都编码病毒癌蛋白，在功能上使肿瘤抑制基因产物p53和Rb失活(43,46,74). Rb失活间接刺激细胞增殖(79)而p53的协同失活阻止了凋亡途径的诱导(59). 小DNA肿瘤病毒协同灭活肿瘤抑制基因被认为可以促进细胞中S期的诱导，这是病毒DNA复制所必需的。增殖信号的诱导和凋亡信号的抑制可导致无限制的细胞增殖，在某些情况下，还可导致细胞转化。相反，EB病毒的转化以潜伏感染为特征；裂解病毒DNA复制被认为不会发生在注定要永生的细胞中，并且永生细胞中也不会产生病毒。

据报道，EBV潜伏基因产物EBNA3C（也称为EBNA6）可在体外结合Rb，并通过以下途径促进大鼠胚胎成纤维细胞的转化ras（拉斯维加斯）.EBNA3C还激活了B-我的弟弟启动子以E2F依赖的方式启动，这表明EBNA3C可以使Rb失活，释放游离E2F(49). 据报道，第二种EBV基因产物EBNALP（EBNA5）可在体外结合p53和Rb，并在细胞内与Rb共定位(64,65). 这种相互作用的功能意义尚不清楚(35,64). EBNA3C和EBNALP都缺乏与Rb囊结合的其他病毒蛋白中发现的LXCXE基序。如果这些潜伏期基因能够在体内结合Rb，则可能有助于细胞转化；然而，病毒DNA合成，发生在生产性感染细胞中，不会受到影响。

与B细胞的潜伏感染不同，上皮细胞的EBV感染通常是多发性的，并导致细胞溶解。然而，免疫抑制可能会触发潜伏感染的B细胞中病毒的重新激活，从而导致生产性感染(48). 通过用佛波酯治疗潜伏感染的细胞，可以模拟病毒基因表达向复制模式的转变(16,84)或免疫球蛋白G（IgG）抗体(66). 激活后，两个关键的EBV早期（IE）裂解基因BZLF1和BRLF1表达(5,68). 这些基因编码反式激活因子，激活病毒和细胞启动子，并导致病毒基因表达的有序级联(6,20——22,29,31,37,57). 仅表达BZLF1基因产物Z（也称为Zta或EB1）就足以激活EBV裂解级联反应(12——14,25,69). 最近的研究表明Z参与细胞增殖的调节。Z可以结合p53并使p53介导的反式激活功能失活(83)Z在一些上皮性肿瘤细胞系中的表达导致G₀/G公司₁以p53依赖的方式逮捕。这些细胞中Z的表达也导致细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21和p27的上调，从而导致Rb低磷酸化形式的积累(8).

与Z一样，BRLF1基因产物R（Rta）也是一种反式激活因子，可以单独或与Z一起激活病毒和细胞启动子(11,12,15,24,28,31,37,44,53). 最近，有研究表明，BRLF1可以激活潜伏感染上皮细胞系中的裂解基因表达(81). 605-氨基酸（aa）R蛋白包含两个反式激活结构域和一个N末端DNA结合和二聚化结构域(29,44). R可以通过结合特定的DNA序列（一种R反应元件）激活启动子(29,44)间接地，可能通过激活或招募细胞转录因子(42,81,82). 以后一种方式激活的启动子包括BRLF1本身(57,82)，人类免疫缺陷病毒长末端重复(52)和c-myc公司(26). 最近的数据表明，负责裂解病毒DNA复制的EBV DNA聚合酶的启动子也被R通过转录因子USF和E2F间接激活(42).

Rb蛋白通过结合和抑制细胞转录因子的活性来抑制细胞增殖，尤其是E2F蛋白家族，该家族激活了细胞DNA复制中重要的基因(2,47). 活性的低磷酸化Rb可以隔离E2F，阻止细胞进入S期。细胞周期素依赖性激酶复合物磷酸化Rb使Rb失活并释放E2F，E2F随后激活DNA合成基因的启动子(1,40). 由小DNA肿瘤病毒编码的病毒癌蛋白可以与磷酸化不足的Rb结合并取代E2F，从而驱动细胞增殖（参考文献综述75).

我们假设，由于R可以通过招募或激活其他转录因子（包括E2F）间接激活一些启动子，R可能会与Rb蛋白相互作用并取代相关转录因子。在这项研究中，我们发现R在病毒重新激活后的早期特异性结合Rb蛋白。这种相互作用仅限于诱导后的早期，与Rb中E2F1的释放在时间上相关。

材料和方法

结果

R在体外与Rb结合。

由于EBV IE蛋白Z可以结合p53并使其功能失活(81)，我们研究了第二个EBV IE蛋白R是否可以与Rb蛋白相互作用。放射性标记的R、Rb和E2F蛋白在网织红细胞裂解物中表达，然后与等量的细菌表达的GST融合蛋白孵育，如考马斯染色所判断的那样。正如预期的那样，阳性对照GSTE2F（图。​（图1A，1A、 特别沉淀放射性标记的Rb，以及病毒融合蛋白GSTR（车道7）。Rb不与单独的珠子、GST负载的珠子（第3和第4通道）或GSTEBNA2（一种EBV潜伏期蛋白，用作阴性对照（第6通道）相互作用。令人惊讶的是，GSTE2F可以同时沉淀共翻译的R和Rb蛋白（通道8）。这是意料之外的，因为大多数与Rb相互作用的蛋白质，如E2F，都会特异性地结合其口袋区域，而另一种Rb结合蛋白，如病毒癌蛋白的存在，通常会导致E2F的置换(75). 这些结果表明，R可能在E2F结合囊区外结合Rb，或者R可能直接与E2F相互作用。

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图1

EBV R蛋白在体外与Rb结合。与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠（Pharmacia）相关的细菌表达的GST融合蛋白与³⁵用Rb、R或E2F DNA编程的S-标记网织红细胞裂解物在4°C下1小时。（A）³⁵S-标记Rb（第2道）与单独的珠子（第3道）、GST-载珠（第4道）或GSTEBNA2孵育，作为阴性对照（第6道）。GSTE2F（5号车道）和GSTR（7号车道）以玻璃标记的Rb为界。GSTE2F与共翻译的R和Rb蛋白孵育（通道8）。（B） 放射性标记的R或E2F蛋白与与谷胱甘肽珠相连的GST蛋白孵育。车道3和7，仅珠子；泳道4和8，商品及服务税；车道5和9，GST5′Rb（aa 1至380）；泳道6和10，GST3′Rb（aa 377至928）；11号车道，GSTR；GSTE2F第12车道。玻璃体标记的R和E2F蛋白的直接负载分别显示在通道1和通道2中。（C） GST融合蛋白与³⁵S标记E2F-1蛋白。通道1，直接装载E2F蛋白；通道2至4、E2F单独孵育珠、GST负载珠和GST5′Rb。GST3′Rb沉淀E2F（车道4），但GSTR没有（车道5）。与等量Rb和E2F蛋白孵育的GSTR如第7栏所示。

为了解决这个问题，并测试是否可以证明R和Rb的相互作用，测试了GST5′Rb（aa 1至380）和GST3′Rb，aa 377至928与放射性标记R或E2F蛋白的相互作用。放射性标记的R蛋白能够与GSTR形成二聚体（图。​（图1B，1B、 车道11），并由5′Rb沉淀，但不是3′Rb，其中包含口袋区域（车道5和6）。R没有与珠子或GST单独相互作用（第3和第4道），也没有直接绑定E2F（第12道）。由于R和E2F结合Rb的不同区域，这一结果与Rb可以与R和E2F同时相互作用的观察结果一致。更重要的是，泳道9和10显示GST Rb构建如预期进行：E2F仅由含有口袋结构域的3′Rb沉淀，而不是由5′Rb沉淀（泳道9和10）。Rb（通道5）沉淀的R双链可能是由于R的翻译后修饰或由于内部起始或部分蛋白质降解导致的截短形式。

为了证实R不能直接与E2F相互作用，用放射性标记的E2F蛋白孵育GSTR。阳性对照GST3′Rb沉淀E2F蛋白（图。​（图1C，1C、 车道5），但不通过GSTR（车道6）。E2F并非仅通过珠子、GST或GST5′Rb沉淀（通道2至4）。GSTR仅从放射性标记E2F和Rb的混合物中沉淀Rb蛋白（第7道），表明GSTR蛋白确实具有功能。与GSTR结合的另一条带被认为是Rb的降解产物，因为它的迁移速度比E2F更快。图中的结果。​图1C，1C、 车道7与图中的不同。​图1A，1A、 第8车道，观察到R、Rb和E2F三方复合体。这些差异可能是由于网织红细胞裂解物在早期实验中是共翻译的（图。​（图1A）1A） 但图中没有。​图11C、。

综上所述，这些数据表明R可以在体外结合Rb，并且R的结合发生在Rb囊外。这种相互作用可能不是由E2F介导的，因为R没有直接与E2F相互作用，但有可能形成包含R、Rb和E2F蛋白的复合物。

EBV R蛋白从诱导的Akata细胞共沉淀Rb。

为了确定这些蛋白在体内是否相互作用，与BL细胞进行联合免疫沉淀。Akata是一种潜在EBV感染的BL株，表达IgG；病毒复制可以通过表面免疫球蛋白与抗体交联而重新激活。病毒裂解周期基因的诱导是快速和同步的，发生在50%至75%的细胞中(66,68).

在IgG诱导后从Akata细胞中收集样品，并制备蛋白裂解物。用识别R蛋白的R2抗体免疫沉淀蛋白质（600μg）；用SDS-PAGE分离复合物，然后用抗体C-15X进行免疫印迹，该抗体是一种可识别所有形式Rb蛋白（圣克鲁斯）的多克隆血清。诱导后6和12小时，R特异性共沉淀Rb（图。​（图2A，2A、 车道5和6）。R2抗体不会从不表达R的未诱导细胞中沉淀Rb蛋白（通道4），也不会从放射性标记的网织红细胞裂解物（通道2）沉淀Rb。R和Rb的相互作用仅限于诱导早期；诱导后24小时未检测到（图。​（图2A，2A、 车道7至9）。

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图2

EBV R蛋白在诱导的Akata细胞中沉淀Rb。用每毫升0.1毫克抗IgG（Sigma）处理感染EBV的Akata细胞，并在诱导后的不同时间（每小时）采集样本。（A） 用R2抗血清（1:100）免疫沉淀Akata蛋白裂解物样品，然后用C-15X抗体（1:5000；Santa Cruz）检测Rb。所示为在0、6、12、24、36或48小时（通道4至9）诱导的体外翻译Rb（通道2）和Akata样品的体外翻译的Rb蛋白（通道1）和未诱导的Akata蛋白（通道3）的蛋白质印迹和免疫沉淀（IP）。（B和C）用抗体8C12（1:10）（B）或Rb-特异性抗体C-15X（C）探测诱导和未诱导Akata蛋白样品的蛋白质印迹。

对同一时间段的裂解产物进行Western blot分析，以直接检测R和Rb蛋白。正如预期的那样，在未诱导的Akata细胞中没有检测到R蛋白，但在诱导后6小时很容易检测到（图。​（图2B）。2B） ●●●●。Rb蛋白水平在诱导和未诱导的Akata细胞中保持不变（图。​（图2C）。2C） ●●●●。显然，R和Rb在早期的相互作用是特定的，并且在后期缺乏复合物的形成并不受这两种蛋白质的可用性的限制。蛋白质的翻译后修饰或栓系蛋白的可用性可能有助于调节R-Rb相互作用。

EBV感染的Akata细胞中的裂解周期诱导，Rb-E2F1复合物被破坏。

为了确定诱导后Akata细胞中结合低磷酸化Rb的E2F1是否与Rb相关，Akata蛋白裂解（与图。​图2）2)用Rb-特异性抗体AB-1免疫沉淀，并检测复合物中的E2F1蛋白。E2F1在未诱导的Akata细胞中与Rb结合（图。​（图3A，三A、 通道2），但在诱导后6和12小时从Rb释放（通道3和4）。复合体在24小时后重新结合（第5车道）。因此，Rb释放E2F的动力学与R和Rb结合的动力学平行。Rb-E2F复合物在48小时（通道7）再次解离，与R结合无关，这可能反映了细胞周期相关的事件，如Rb磷酸化。

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图3

EBV感染的Akata细胞中Rb和E2F的相关性。在抗IgG诱导后的不同时间收集Akata细胞蛋白样品（p.i.小时）。（A） 用Rb蛋白抗体（AB-1；致癌科学）免疫沉淀200μg等分的裂解物（IP）。通过SDS-PAGE对复合物进行拆分，并探测E2F1蛋白（KH95；Santa Cruz）。通道1，50μg Akata裂解液中的总E2F1蛋白；通道2至7，用Rb特异性抗体进行免疫沉淀。（B） Akata蛋白样品用R2抗体免疫沉淀，然后用E2F1蛋白抗体免疫印迹（2到7道）。检测E2F1蛋白的未诱导的Akata裂解物的直接负载显示在泳道1中。（C） 用E2F1抗体sc193（1:100；Santa Cruz）对Akata裂解液样品（100μg）进行免疫印迹。

体外数据表明，在某些情况下可能会形成R、Rb和E2F蛋白的复合体。为了确定R是否可以在体内直接结合E2F，或者如果R-Rb结合可能包括E2F，用R特异性抗体R2免疫沉淀诱导细胞的Akata蛋白，并用E2F1抗体探测复合物。图​图3B，三B、 通道1，直接在未诱导的Akata细胞裂解液中显示E2F1蛋白。在任何诱导的Akata裂解物样品中，E2F蛋白均未与R共沉淀（通道2至7）。这些数据表明，R不直接与E2F1结合，并证实R-Rb关联不依赖于E2F。

接下来，通过Western blot分析测定Akata裂解物中的总E2F蛋白。在IgG交联后的0、3、6、12和24 h收获Akata细胞，并制备全细胞裂解物。用抗体sc193（1:100）进行免疫印迹分析（图。​（图3C）。三C） ●●●●。E2F水平在裂解周期诱导后的早期似乎增加（图。​（图3C）。三C） ●●●●。因此，E2F-Rb复合物在诱导后6和12小时消失，见图。​图3A，三A、 不是因为E2F蛋白水平下降。

裂解循环诱导后R和Rb的磷酸化。

由于Rb是一种磷酸化蛋白，R可能被磷酸化，我们研究了在Akata细胞中诱导裂解周期后R和Rb的磷酸化状态。如上所述，通过IgG交联诱导Akata细胞，在诱导后的指定时间采集样品，并制备蛋白裂解物。为了区分不同迁移形式的蛋白质，我们通过SDS-PAGE在选定的条件下分离蛋白质裂解物样品，以增强所需蛋白质的分离，然后进行免疫印迹分析。为了检测Rb，在7%聚丙烯酰胺凝胶上分离25μg裂解液。将该蛋白转移到Immobilon膜上，并用抗体C-15X进行检测。用10%聚丙烯酰胺凝胶分离200μg蛋白质后，用抗体8C12（1:100）检测R。检测到两种蛋白的多种形式。在未诱导的Akata细胞中检测到至少两种形式的Rb（图。​（图4A，4A、 车道1）。诱导后3小时，几乎所有Rb蛋白都磷酸化不足（通道2）。诱导后6小时（第3车道），一种迁移速度较慢的铷开始积累，随后成为铷的主要形式（第4车道至第8车道）。推测Rb结合蛋白在诱导后的早期会优先与Rb相互作用。

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图4

Akata细胞裂解诱导后R和Rb的磷酸化。用SDS-PAGE分离诱导后不同时间（p.i.小时）的诱导Akata细胞的总蛋白裂解物样品，然后探测Rb（A）或R（B）蛋白。（C） 在免疫印迹分析之前，用lambda磷酸酶（新英格兰生物实验室）孵育20μg等分试样，孵育时间为30°C。

诱导后3和6小时检测到R的快速迁移形式（图。​（图4B，4B、 车道2和3）。第二种迁移速度较慢的物种在诱导后的后期出现（第4至8车道）。为了证实R和Rb的不同迁移形式是由于磷酸化所致，我们进行了磷酸酶分析。如前所述，将20微克总裂解物与2000 U的λ磷酸酶孵育，然后进行电泳和免疫印迹分析。当样品在磷酸酶存在下孵育时，R和Rb蛋白都被还原为一个快速迁移的物种（图。​（图4C），4C） 这表明迁移速度较慢的蛋白质物种是每种蛋白质的磷酸化衍生物。

Rb相互作用需要Raa 1至201。

接下来，我们确定R蛋白的哪个区域与Rb特异性相互作用。对于定位研究，一系列含有C末端或内部缺失的突变R构建体(44)翻译并用无线电标记[³⁵S] 使用T7 RNA聚合酶（R和RΔ2-22）或SP6 RNA聚合物（Rt201、Rt356、Rt336i81、Rt515和RΔ的81-184），网织红细胞裂解物中的蛋氨酸（图。​（图5A）。5A） ●●●●。蛋白质通过凝胶电泳和放射自显影术进行分析，以确认每个翻译的蛋白质都具有预期的分子量（数据未显示）。用GST5′Rb融合蛋白沉淀放射自显影判断的同等数量的放射性标记蛋白。图​图5B5B表明，所有C末端截短的R突变体在体外与5′Rb相互作用（5到8道），但内部缺失突变体RΔ2-22（4道）不与5′R1b结合。另一个内部缺失突变体RΔ81-184也未能与Rb共沉淀（数据未显示）。

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图5

R突变体的结构和功能。（A） 地图研究中使用的R突变体的结构（Evelyne Manet慷慨捐赠）。前面描述了DNA结合和二聚体(44). （B） R质粒在体外转录和翻译[³⁵S] 蛋氨酸，使用TnT系统（Promega）。将放射性标记的R蛋白与谷胱甘肽珠（第2道）、GST-珠（第3道）或GST5′Rb（aa 1至380；第4至8道）在4°C下孵育90分钟。如文中所述，通过电泳对样品进行洗涤和分离。

这些R突变体以前用于绘制R蛋白的功能域。Manet等人(44)将R的二聚化结构域定位为aa 1至232，位于DNA结合结构域（aa 1到280）内。此外，突变体Rt201以及两个缺失突变体RtΔ2-22和Rt△81-184都缺乏二聚体和DNA结合能力(44). 因此，与Rb的相互作用不需要R的二聚体，因为突变体Rt201和Rt356i81可以沉淀Rb蛋白。

绘制Rb蛋白与R相互作用的区域。

图中的结果。​图11表明R特异性地结合到Rb结合囊外Rb的5′端，可能是因为R不包含以前在其他结合Rb囊的蛋白质中发现的LXCXE基序(46). 然而，Rb的N末端区域的可能功能最近已经被发现（参考文献中进行了综述76). 因此，与R相互作用所需的Rb区域被更紧密地映射。图中显示了一系列包含内部缺失的GST5′Rb结构（J.Horowitz慷慨捐赠）。​图6A6A类(61). 根据考马斯蓝染色（数据未显示）判断，等量的细菌表达突变蛋白与放射性标记的、在体外翻译的R蛋白孵育。如图所示。​图6B，6B、 删除Rb中的两个独立区域会干扰R的结合。删除aa 39至89（车道4）会完全中断与R的相互作用，删除aa 249至309会显著减少R的结合量（车道7）。当用放射性标记的Rt201代替全长R重复相同的实验时，结果相似（数据未显示）。这些数据表明，Rb中的aa 39至89对与R的相互作用至关重要。另一个缺失，从aa 249至309，可能是由于缺失引起的构象变化，降低了R结合。

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图6

绘制Rb中与R蛋白相互作用所需的结构域。（A） 用于本实验的GST-Rb结构是乔纳森·霍洛维茨慷慨赠予的礼物，如前所述(61). （B） 制备细菌表达的GST融合蛋白的裂解物，然后将其与文中所述的谷胱甘肽珠结合。体外翻译³⁵如图所示，S标记的R蛋白与珠、GST或GSTRb构建物孵育。结合反应后，通过SDS-PAGE分离复合物，并通过放射自显影法观察，如文中所述。

讨论

Rb和p53基因产物被鉴定为抑癌蛋白，但其作用更广泛；目前已知这些蛋白质对正常细胞增殖至关重要。因此，不足为奇的是，这些蛋白质不仅在细胞转化过程中，而且在病毒感染过程中可能成为靶点，以绕过对细胞增殖的正常控制，并建立有利于病毒DNA复制的环境。这可能是一个共同的主题，不仅在小型DNA肿瘤病毒中，也在其他DNA病毒中。人类巨细胞病毒编码一种基因产物IE2，它结合Rb并使其E2F介导的生长抑制功能失活(27,58)细胞感染这种病毒会导致DNA、RNA和蛋白质合成的快速爆发(23,62,63,70). 细胞感染1型单纯疱疹病毒导致S期E2F复合物和游离E2F增加(30).

我们实验室以前的数据表明，Rb可能是R蛋白的靶点。EBV启动子的R激活波尔基因已定位到结合转录因子USF和E2F的元件；两个位点的突变都降低了R介导的波尔(42). R以间接方式激活其他启动子(26,52,57,82). 综上所述，这些结果表明R可能通过激活细胞转录因子来激活一些启动子。启动子间接激活的一种机制是通过R和Rb蛋白的相互作用以及与Rb结合的转录因子的释放。

IE基因产物R在体外和体内都能特异性结合Rb。在用IgG抗体处理的Akata细胞中，R和Rb的相互作用在病毒裂解周期诱导后不久发生，并且仅限于诱导后的早期。诱导后24小时后，即使R和Rb水平在48小时内保持不变，也无法检测到相互作用，这表明相互作用可能通过磷酸化在翻译后进行调节。Rb活性受磷酸化调节(71)，R也可能是细胞激酶磷酸化的靶点(51). 我们在这里表明，R确实是一种磷酸蛋白，并且R和Rb磷酸化的状态随着裂解循环的诱导而变化。在未诱导的细胞中检测到多种形式的Rb，但低磷酸化形式的Rb-在诱导后3小时积累，并且Rb在诱导后的后期逐渐磷酸化（图。​（图4A4A和C）。因此，诱导可能会触发Rb的快速、短暂去磷酸化。Rb去磷酸化和随后的磷酸化的机制仍有待研究。类似地，R在诱导后首次检测到时，似乎磷酸化不足或未磷酸化；稍后，检测到磷酸化和非磷酸化形式的混合物（图。​（图4B4B和C）。因此，R和Rb蛋白的最强相互作用发生在诱导后的早期，此时两种蛋白主要磷酸化不足或未磷酸化。R和Rb复合物的破坏可能是由于R或Rb或两者的磷酸化增加所致。目前尚未精确确定Rb的哪种磷酸化形式可以与R结合，但很可能R与磷酸化不足的Rb结合，因为迄今为止，所有与Rb优先结合的蛋白质都优先与蛋白的磷酸化不足形式结合(76). 这些数据令人兴奋，因为它们表明EBV在裂解周期的早期特别针对Rb。

E2F1在潜在感染的Akata细胞中与Rb结合。这一发现表明，在这些细胞中，至少有一部分Rb蛋白被磷酸化。这一结果与淋巴母细胞系的数据形成对比，其中Rb被认为是过度磷酸化的。结果可能反映了1型（Akata）和3型（淋巴母细胞系）潜伏病毒基因表达的差异(三,7).

病毒再激活期间Rb释放E2F与R-Rb相互作用的动力学在时间上相关。推测R与Rb的结合会导致E2F的位移，从而激活病毒和细胞的E2F响应启动子，将R与增殖和/或细胞周期进展联系起来，这将是很有诱惑力的。然而，数据表明R和Rb的相互作用可能会产生额外的功能后果。

体外数据表明，R、Rb和E2F在某些情况下可能形成三元复合物（图。​（图1A1而在体内，E2F从Rb的位移与R与Rb的结合明显相关。只有当R和Rb在添加E2F之前共同翻译时，才形成所有三种蛋白质的复合物（图。​（图1A）。1A） ●●●●。因此，Rb蛋白的构象很可能随着每个结合伙伴的改变而改变，这种改变可能决定其他蛋白质是否可以与Rb结合。细胞环境，即与Rb结合的其他蛋白质，可以确定R的结合是否可以取代E2F。其他因素可能在调节Rb蛋白相互作用中发挥作用；因为R是一种磷酸蛋白，所以R的磷酸化状态可能决定是否释放E2F。尚未证明R具有任何激酶活性，因此不太可能在Rb磷酸化中发挥直接作用，但有可能R招募了在E2F置换中发挥作用的其他蛋白质。

此外，R与Rb的N末端区域特异性结合，位于E2F-结合囊外。删除aa 39至89，彻底废除了R结合，这与Rb的几个功能有关。该区域被证明有助于抑制生长活动；在SAOS2细胞增殖试验中，这对于生成扁平细胞至关重要(50). 数据表明该区域可能结合Sp1抑制剂(9,39,72,73). 该区域的缺失完全消除了Rb激活人类胰岛素受体启动子的能力(56)和胰岛素样生长因子II(39)基因通过Sp1。同一区域位于一个假定的结构域内，该结构域对Rb与p84核蛋白的结合和Rb的亚核定位很重要(18). 在aa 39至89或aa 249至309这两个区域缺失的Rb突变蛋白，其生物活性和过度磷酸化能力均受损(50). R绑定可能会特别影响其中一些功能。这两种缺失都映射了Rb家族成员中保守的外部序列。因此，R不太可能绑定p107或p130，但需要直接测试这种可能性。最近，研究表明Rb的氨基末端结合并负调控MCM7，MCM7是DNA-许可因子的组成部分，是启动复制所需的复合物(32). 这种因子可能是病毒DNA复制所必需的，并通过R结合而从Rb中取代。

Rb中的两个区域，aa 39至89和aa 249至309，可能与R相互作用，但目前尚不清楚其中一个区域是否直接受R约束。R可能与Rb的两个区相互作用，可能是通过一个位点的主要相互作用，然后是第二个位点的接触。这种相互作用发生在其他蛋白质与Rb的结合中(10,33,34,36). aa 39至89的缺失与蛋白质许多功能的丧失有关，并可能导致Rb折叠的构象变化，从而阻止R结合。同样，随着aa 249到309的缺失，R结合的减少也可能是由于Rb蛋白折叠的改变，这掩盖了R相互作用域。

Rb在R蛋白的前200 aa内结合在DNA结合和二聚结构域中。然而，R与Rb的相互作用既不需要二聚体也不需要DNA结合，因为不能形成二聚体或结合DNA的R突变体Rt201也能结合Rb(44). 然而，这一发现并不排除R二聚体与Rb结合的可能性。使用R的缺失突变体可能很难进一步绘制该区域，因为二聚化区域内的内部缺失会严重破坏蛋白质的确认。我们测试的两个缺失突变体RΔ2-22和RΔ81-184均未结合Rb，进一步的定位研究可能需要R区的点突变。

R可能是一种多功能蛋白，在病毒DNA复制中起着比先前怀疑的更大的作用。R、 单独或与Z联用，可以激活病毒启动子以调节生产性感染期间的病毒基因表达。R也可能有助于调节细胞环境以促进病毒复制。R可以激活c-myc公司，一种对增殖起重要作用的细胞基因(26). R还激活EBV基因BHRF1，这是细胞抗凋亡基因的病毒同源物bcl-2基因(28). 我们在这里表明R可以与Rb相互作用；因此，在病毒重新激活的初始阶段，R可能对细胞增殖有直接影响。

此外，R与Rb蛋白结合的区域与Rb的其他功能相关，这一结果表明，R和Rb的相互作用除了缓解Rb介导的E2F抑制外，还可能产生其他功能性后果。R、 因此，可能与其他主要IE EBV蛋白Z协同作用，Z结合p53，以控制EBV裂解感染期间的细胞环境。

鸣谢

参考文献