《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8032–8036.
乙型脑炎病毒特异性人CD4的建立及鉴定+T细胞克隆：黄病毒的交叉反应性、蛋白质识别和细胞毒性活性
,1 ,1 ,2 ,三和1,*
Hirokuni Aihara公司
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
高崎富美子
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
松谷隆吉
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
铃木良治
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
黑一郎
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
大阪山近畿大学医学院微生物系589，1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室，三Shionogi&Company Ltd.，日本大阪553
*通讯作者。现住址：日本东京新宿区富山1-23-1号国立传染病研究所病毒学1部，邮编：162-8640。电话：81-3-5285-1169。传真：81-3-5285-1169。电子邮件：pj.og.hin@enaruk公司. 1998年4月3日收到；1998年6月30日接受。
摘要
我们分析了CD4+两名6或12个月前接种日本脑炎病毒（JEV）疫苗的捐献者的T淋巴细胞反应。大量培养增殖试验表明，外周血单个核细胞（PBMC）对JEV抗原（Ag）有反应，但对西尼罗河病毒（WNV）和登革热病毒1型、2型和4型（分别为D1V、D2V和D4V）Ag也有较低水平的反应+从这两个供体的PBMC中建立了人T细胞克隆和一个亚克隆。两个克隆对WNV-Ag和JEV-Ag都有反应，而其他克隆只对JEV-Ag3有反应+T细胞克隆具有JEV特异性细胞毒活性和识别E蛋白。检测JEV特异性T细胞克隆的HLA限制性。三个克隆受HLA-DR4限制，一个受HLA-DQ3限制，还有一个克隆的HLA限制未确定。T细胞受体分析表明，这些克隆表达不同的T细胞受体，表明它们来自不同的T淋巴细胞。这些结果表明，JEV疫苗诱导JEV特异性和黄病毒交叉反应CD4+T淋巴细胞和这些T淋巴细胞识别E蛋白。然而，这些T淋巴细胞的功能和HLA限制模式是异质的。
日本脑炎病毒（JEV）是黄蜂科广泛分布于日本、中国、台湾、韩国、菲律宾、俄罗斯远东和东南亚(10,19,22). 临床表现为热性头痛综合征、无菌性脑膜炎或脑炎(三,5). 临床上公开的JEV感染会导致意识受损和四肢瘫痪。死亡发生在第5天至第9天，或发生在具有心肺影响的更长时间的过程中。死亡率为5至40%(19). 幸存者会出现神经精神后遗症，在儿童中尤为严重(17).
日本目前可用的JEV疫苗是一种从JEV感染小鼠大脑中纯化的福尔马林灭活病毒制剂(21). 这种疫苗被证明对JEV感染是安全有效的(9). 然而，人们对这种JEV疫苗表示担忧。从受感染的小鼠脑中制备疫苗需要采取生物安全预防措施。这种疫苗在发展中国家使用过于昂贵。此外，疫苗可能仍含有少量小鼠大脑成分。因此，开发新型JEV疫苗是一个有待解决的项目。
一种新的JEV疫苗应该含有能诱导对JEV感染产生强烈保护性免疫的表位。人们普遍认为，中和抗体在JEV感染的保护和恢复中发挥着重要作用；然而，T细胞介导免疫的作用尚不清楚。据报道，辅助性T淋巴细胞在血管周围浸润中占主导地位，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所代表的人群较少(15–17,19,20).
在本文中，我们报告了从接种JEV疫苗的供体获得的外周血单个核细胞（PBMC）对西尼罗河病毒（WNV）和登革热病毒以及散装培养的JEV有反应。我们建立并表征了JEV特异性人CD4+T细胞克隆。我们分析了T细胞克隆，重点是对其他黄病毒的交叉反应、细胞毒活性、病毒蛋白的识别和HLA限制。两个T细胞克隆对WNV具有交叉反应，而其他克隆仅对JEV有反应。一些克隆对表达JEV E蛋白的自体靶细胞具有细胞毒性。这是首次报道JEV特异性人类CD4+T细胞克隆。
材料和方法
病毒。
JEV（Nakayama株）由神户大学医学院的Eiji Konishi提供。如前所述，JEV在C6/36细胞中繁殖(13). 简言之，C6/36单层细胞在5个PFU/细胞的多重感染（MOI）下感染JEV，并在28°C的含有2%胎牛血清（FCS）的最低基本培养基中培养3至4天。收集上清液，并将其储存在−80°C下，直至使用。上清液的病毒滴度约为1.2×108Vero细胞斑块分析中的PFU/ml。重组痘苗病毒vP829、vP658、vP555和vP410由纽约州特洛伊的病毒发生学公司提供，vP828、vP 658和vP 555分别携带JEV中山株的prM和E基因、E和NS1基因以及prM、E和NS 1基因。vP410不含任何JEV基因。
黄病毒抗原的制备。
如前所述，从JEV感染的Vero细胞中制备JEV抗原（Ag）(12). 简言之，Vero细胞在5 PFU/细胞的MOI下感染，并在37°C的含有2%FCS的最小基本培养基中培养，直到50%的细胞显示出细胞病变效应。通过刮取细胞，在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，用0.025%戊二醛在PBS中在冰上固定15分钟，在PBS内洗涤三次，然后在3×108RPMI 1640中的细胞/ml。用Ultra S均质器VP-15S（日本柴达木省台达县）在冰上对固定细胞进行超声处理，并在1500×克在4°C下保持10分钟。收集上清液，分成等分，并在−80°C下冷冻。对照银也是从未感染的Vero细胞单层制备的。登革热病毒1型、2型、3型和4型（分别为D1V、D2V、D3V和D4V）和WNV-Ag由马萨诸塞大学医学中心的Francis A.Ennis提供。
人PBMC。
从两名健康的日本成年人（捐赠者A和捐赠者C）采集外周血样本，他们在6至18个月前接种了JEV（北京株）疫苗。几十年前，这些捐赠者还接种了JEV疫苗。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心纯化PBMC(1). 细胞在10时重新悬浮7/在RPMI 1640中加入10%FCS和10%二甲基亚砜，冷冻保存至使用。供者A的HLA分型为A2、A24；B38-B59；CW1、CW7；DRB1*0405、DRB1*0803、DQB1*0301、DQB1*0401和DPB1*0402、DPB1*1401，分别被视为DR4、DR8、DQ3、DQ4和DPw4。供者C的HLA分型为A24、A33；B52、B35；CW3；DRB1*0405、DRB1*1502、DQB1*0401、DQB1*0601和DPB1*0201、DPB1*0901，分别被视为DR4、DR15、DQ4、DQ6和DPw2。供者B的HLA分型为A24、A33；B44；DQ1、DQ3；和DR2、DR5。
PBMC在大量培养中的增殖反应。
多溴联苯胺的增殖测定如前所述进行(12). PBMC（1×105至2×105)在含有10%热灭活人类AB血清的0.2 ml AIM-V培养基（GIBCO）中与1:100至1:200稀释Ag在37°C的96周V底微量滴定板（Coster，Cambridge，Mass.）中培养7天。用1μCi的氚化胸腺嘧啶对细胞进行脉冲处理([三H] 胸腺嘧啶）在收获前18小时。它们是用多收获机收获的（弗吉尼亚州斯特林市斯科特龙公司），以及[三H] 在液体闪烁计数器中计算胸腺嘧啶掺入量。
通过限制稀释建立JEV特异性T细胞克隆。
如前所述，通过限制稀释建立JEV特异性T细胞克隆(6,23). 用JEV-Ag刺激PBMC 7天。通过限制稀释法克隆从受刺激PBMC分离的T细胞母细胞。供体A的T细胞以每孔1个细胞的速度克隆，供体C的T细胞则以每孔10个细胞的频率克隆，然后以每孔0.3个细胞的速率在96周的圆形微孔板中以每毫升0.2 ml含有10%FCS和20 U重组白细胞介素2（IL-2）的AIM-V培养基中重新克隆。丝裂霉素C（0.05 mg/ml）治疗或γ射线照射（3500 rads）自体PBMC（105)并将直径为1:200至1:400的JEV Ag添加到每个井中。每隔3至4天，从每个孔中取出0.1 ml培养基，用每ml含有10%FCS和20 U IL-2的AIM-V培养基替换。在第10至14天，对生长细胞进行Ag特异性测试。刺激指数（SI）大于2.0的克隆被认为是JEV特异性克隆，并进行了进一步研究。克隆效率低于1%。在γ射线照射或丝裂霉素C处理的PBMC（106)在每毫升含10%FCS和20 U IL-2的1.0 ml AIM-V培养基中，48个平板（日本东京磐石玻璃）。
免疫荧光染色。
总计6×104至12×104细胞在冰上用异硫氰酸荧光素标记的抗CD3、抗CD4和抗CD8（DAKO A/S，Glostrup，Denmark）染色30分钟，并在含有2%FCS的PBS中洗涤。将细胞重新悬浮在PBS中50%的甘油中，并用荧光显微镜检查。
T细胞克隆增殖试验。
T细胞克隆（1×104至2×104细胞/孔）与γ射线照射或丝裂霉素C处理的PBMC（1×105至2×10596 well V型底部微量滴定板中是否存在Ag。培养48小时后[三H] 加入胸腺嘧啶核苷（1μCi/孔），18小时后收获细胞[三H] 胸腺嘧啶核苷摄取用闪烁计数器定量。SI的计算公式为病毒Ag刺激引起的每分钟计数除以对照Ag刺激诱发的每分钟数。当（i）SI大于2.0和（ii）[三H] 胸腺嘧啶掺入量大于1000cpm。在一些实验中，将HLA-DQ或HLA-DR单克隆抗体（日本东京科斯莫生物有限公司）或小鼠免疫球蛋白G的最佳浓度添加到培养物中，以确定HLA限制性。
成立BLCL。
B淋巴细胞样细胞系（BLCL）如先前报道的那样建立(14). PBMC（1×106至2×106)在含有20%FCS、青霉素和链霉素的RPMI 1640中用1:3稀释的B95-8细胞上清液培养。B95-8细胞由Tottori大学医学院Takeshi Sairenji提供。
靶细胞的制备。
总计1×105至1.5×105将Epstein-Barr病毒转化的BLCL细胞在含有2%FCS的RPMI 1640中清洗一次，并在37°C下以10 PFU/cell的MOI感染JEV重组痘苗病毒。细胞在含有2%FCS的RPMI1640中培养2小时。细胞在含10%FCS的2ml RPMI 164024孔板中培养16至20小时。清洗受感染的BLCL，并用0.25 mCi的51在37°C条件下，将含有10%FCS的0.1 ml RPMI 1640中的Cr浸泡1小时。标记后，将细胞在含有10%FCS RPMI 1640中清洗四次，以去除未合并的细胞51Cr。对细胞进行计数并稀释至104每毫升细胞数用于细胞毒性试验。
细胞毒性试验。
如前所述，使用96-well V型底板进行分析(2,14). 将0.1 ml含有10%FCS的RPMI 1640中的效应细胞添加到10三 51Cr标记靶细胞的效应细胞/靶细胞（E/T）比率为10:1至20:1。将平板在37°C下培养5 h。采集上清液51使用自动伽马计数器（自动井伽马系统ARC-300；日本东京，阿洛卡）测量铬含量。特定百分比51Cr释放量采用公式[（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发发布）]×100（释放量以每分钟计数计算）计算。分析分三次进行，并计算三次孔的平均值。
TCR V基因使用分析和互补决定区3（CDR3）的测序。
如前所述，使用基于适配器连接PCR的微孔板杂交分析T细胞克隆对T细胞受体（TCR）V基因的使用(18). 简单地说，43个TCR-αV基因（TCRAV）和38个TCR--βV基因（TCRBV）特异性探针被固定在水溶性碳二亚胺微孔中。5′-生物素化PCR产物杂交后，如前所述进行(18)进行定量酶联免疫吸附分析，然后进行自动比色读数。
在确定T细胞克隆的TCRAV和TCRBV序列后，用规定的TCRAV-或TCRBV特异性引物和引物CA4或CB4进行20个周期的PCR，体积为50μl(18). 用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）纯化PCR产物。将纯化的PCR产物溶解在50μl蒸馏水中，并使用序列PRO（日本大阪东洋）对序列进行循环测序分析。
结果
PBMC对JEV-Ag的增殖反应。
我们首先检测了从捐赠者A和C获得的PBMC对JEV-Ag的增殖反应。这些捐赠者在6到12个月前接种了JEV疫苗。供体A和供体C的PBMC在JEV-Ag刺激后表现出显著的增殖反应，并且存在剂量-反应关系（表). 当供体A的PBMC与稀释度为1:100至1:400的JEV Ag培养时，以及供体B的PBMC和稀释度为1:80至1:320的JEV-Ag培养时，检测到高水平的增殖。因此，在接下来的增殖分析中，我们使用稀释度为1-100至1:200的JEV-Ag。
表1
供体A和供体C的PBMC对批量培养中连续稀释的JEV-Ag的增殖反应
| PBMC捐助者 | 抗原稀释 | [三H] 由以下银诱导的胸腺嘧啶掺入（cpm）：
|
|---|
| JEV公司 | 控制 |
|---|
| A类一 | 1:100 | 11622人 | 3,462 |
| 1:200 | 10,943 | 158 |
| 1:400 | 8,973 | 116 |
| 1:800 | 4,387 | 515 |
| 1:1,600 | 1,593 | 182 |
| C类b条 | 1:80 | 13,082 | 1,032 |
| 1:160 | 8,595 | 1,650 |
| 1:320 | 7,644 | 2,990 |
| 1:640 | 2,453 | 2,027 |
| 1:1,280 | 3,203 | 1,488 |
在批量培养中PBMC对其他黄病毒抗原的增殖反应。
供体A的PBMC与黄病毒Ag以1:100和1:200的最终稀释液培养7天，并且[三H] 测定胸腺嘧啶掺入量。这些PBMC在JEV-Ag刺激后增殖，在D1V、D2V、D4V和WNV-Ag刺激后增殖到较低水平（表). 供体C的PBMC在D1V、D2V、D3V、D4V和WNV-Ag刺激后增殖（数据未显示）。这些捐赠者从未去过登革热病毒和西尼罗河病毒流行的地区。因此，结果表明，JEV疫苗免疫诱导的记忆性T淋巴细胞主要是JEV特异性的，但也包括与其他黄病毒交叉反应的T细胞。
表2
供体A PBMC对JEV-Ag和其他黄病毒Ag的增殖反应一
| 银 | [三H] 胸腺嘧啶核苷掺入，单位为cpm（SI），Ag稀释度为：
|
|---|
| 1:100 | 1:200 |
|---|
| JEV公司 | 61,748 (18.0) | 43,157 (16.0) |
| D1V型 | 6,562 (2.0) | 15,214 (5.6) |
| D2V型 | 17,966 (5.3) | 14,316 (5.3) |
| D3伏 | 4,762 (1.4) | 2,728 (1.0) |
| D4V型 | 1,198 (0.4) | 16,615 (6.1) |
| WNV公司 | 7,285 (2.2) | 21,601 (8.0) |
| 控制 | 3,363 | 2,705 |
CD4增殖反应+黄病毒抗原的T细胞克隆。
我们建立了四个CD4+来自供体A PBMC和一个JEV特异性CD4的T细胞克隆A3、A19、A23和A26+通过材料和方法中所述的限制稀释，从供体C PBMC获得T细胞克隆C2及其亚克隆C2-16。这些克隆是根据对JEV-Ag的显著增殖反应水平选择的。所有克隆都具有CD3表型+CD4细胞+CD8（CD8）−，通过免疫荧光染色测定（数据未显示）。
我们检测了这些T细胞克隆对WNV、D1V、D2V、D3V和D4V Ag的交叉反应+根据对黄病毒Ag的反应，将T细胞克隆分为两组（表). （i） A19、A23、C2和C2-16对JEV Ag有反应，但对任何其他检测的黄病毒Ag无反应。（ii）A3和A26对JEV和WNV-Ag有反应，但对登革热病毒Ag无反应。克隆A3对WNV-Ag的反应低于JEV-Ag，而克隆A26对WNV Ag的反应与JEV-A相似或更高。这些结果表明JEV应答的CD4+T细胞克隆具有异质性黄病毒交叉反应性。
表3
JEV特异性CD4的增殖反应+黄病毒抗原的T细胞克隆一
| 克隆 | [三H] 用以下Ag刺激后，胸腺嘧啶掺入，以cpm（SI）计：
|
|---|
| JEV公司 | WNV公司 | D1V型 | D2V型 | D3伏 | D4V型 | 控制 | 无 |
|---|
| A3号 | 6,130 (8.0) | 1,645 (2.2) | 522 (0.7) | 647 (0.9) | 1,112 (1.5) | 707 (0.9) | 759 | 752 |
| 答19 | 1,275 (8.9) | 308 (2.1) | 105 (0.7) | 46 (0.3) | 349 (2.4) | 386 (2.6) | 144 | 218 |
| 答23 | 2,345 (10.0) | 62 (0.3) | 164（0.7） | 139 (0.6) | 81 (0.4) | 122 (0.5) | 225 | 65 |
| 答26 | 3,834 (6.9) | 7,933 (14.0) | 682 (1.2) | 822 (1.4) | 547 (1.0) | 924 (1.6) | 556 | 918 |
| 指挥与控制 | 14473（4.1） | 3886（1.0） | 3,141 (0.9) | 2,695 (0.8) | 3,360 (1.0) | 3,640 (1.0) | 3,503 | 3,626 |
| C2-16型 | 11,842 (6.3) | 1,490 (0.8) | 3,118 (1.6) | 1,879 (1.0) | 2,430 (1.3) | 2,781 (1.5) | 1,869 | 2,500 |
CD4裂解表达JEV蛋白的自体靶细胞+T细胞克隆。
CD4细胞+检测T细胞克隆的JEV特异性细胞毒活性。用vP829（一种含有JEV prM和E基因的重组痘苗病毒）感染自体BLCL，并作为CTL检测的靶细胞。JEV应答性T细胞克隆A19、A26、C2和C2-16裂解了vP829感染的靶细胞，而A3和A23没有（表).
表4
JEV应答性T细胞克隆对vP829感染靶细胞的裂解一
| 克隆 | %特定51感染以下疾病的自体靶细胞释放铬：
|
|---|
| vP829版 | vP410版本 |
|---|
| A3号 | 4 | 1 |
| 答19 | 76 | 25 |
| 答23 | 6 | 1 |
| 答26 | 59 | 0 |
| 指挥与控制 | 76 | 三 |
| C2-16型 | 48 | 0 |
CD4对JEV E蛋白的识别+T细胞克隆。
JEV特异性和JEV与WNV交叉反应性CTL克隆对感染vP829的BLCL的裂解表明，这些CTL克隆能够识别JEV的prM或E蛋白。我们检测了感染vP829、vP555（一种含有JEV prM、E和NS1基因的重组痘苗病毒）或vP658（一种含JEV E和NSI基因的重组疫苗病毒）的目标细胞的裂解，以确定识别了哪种病毒蛋白。CD4细胞+感染vP555、vP658和vP829的T细胞克隆A19、A26和C2裂解靶细胞（表). 这一结果表明，CTL克隆A19、A26和C2识别JEV E蛋白。
表5
JEV特异性CD4对JEV E蛋白的识别+CTL克隆一
| 目标细胞感染的病毒（携带JEV基因） | %特定51Cr释放方式：
|
|---|
| 答19 | 答26 | 指挥与控制 |
|---|
| vP555（prM、E和NS1） | 58 | 36 | 75 |
| vP658（E和NS1） | 42 | 27 | 52 |
| vP829（prM和E） | 47 | 40 | 71 |
| vP410（无[控制]） | 13 | 0 | 2 |
JEV特异性CD4的HLAⅡ类限制+T细胞克隆。
为了确定JEV特异性CD4的HLA限制性+T细胞克隆，我们使用供体A、B和C的PBMC作为抗原呈递细胞（APC）进行T细胞增殖试验。当供体B PBMC和自体PBMC用作APC时，克隆A3增殖（表). 因此，我们得出结论，A3受到HLA-DQ3的限制，因为供体A和B只共享HLA-DQ3。当供体A和C的PBMC用作APC时，克隆A19、A26和C2-16增殖（表). 这一结果表明克隆A19、A26和C2-16受到HLA-DQ4或HLA-DR4的限制。无法确定克隆A23的HLA限制性，因为它只有在用自体APC刺激时才会增殖（表). 这些结果与CTL分析结果一致（表). CTL克隆A19、A26、C2和C2-16裂解vP829感染供体A和供体C BLCL。
表6
CD4增殖+自体或异体APC存在下JEV-Ag刺激后的T细胞克隆一
| APC供体 | HLA II类
| 用JEV Ag刺激以下克隆后的SI：
|
|---|
| DP公司 | DQ公司 | 博士 | A3号 | 答19 | 答23 | 答26 | C2-16型 |
|---|
| A类 | 4-B1*1401 | 3,4 | 4、8 | 6.8 | 7.1 | 9.4 | 4.1 | 6.5 |
| B类 | | 1,3 | 2,5 | 5.2 | 1.1 | 1 | 0.7 | 0.4 |
| C类 | 2-B1*0901 | 4,6 | 4,15 | 1.3 | 3.1 | 0.9 | 4.3 | 15 |
表7
CD4对感染vP829的同种异体BLCL的裂解+CTL克隆一
| 靶细胞供体和感染病毒 | %特定51C发布人：
|
|---|
| 答19 | 答26 | 指挥与控制 | C2-16型 |
|---|
| A类 | |
| vP829版 | 76 | 59 | 76 | 49 |
| vP410版本 | 18 | 0 | 三 | 0 |
| C类 | |
| vP829版 | 88 | 62 | 75 | 59 |
| vP410版本 | 28 | 5 | 2 | 6 |
抗HLA-DR抗体可抑制克隆A19、A23、A26和C2-16对JEV-Ag的增殖反应，但抗HLA-DQ抗体或对照抗体不能抑制克隆的增殖反应（表). 这些结果以及表中所示的结果和，表明克隆A19、A26和C2-16受HLA-DR4限制。
表8
抗HLA DR抗体对JEV特异性T细胞克隆增殖的抑制作用一
| 抗体 | 最终稀释 | [三H] 胸腺嘧啶掺入（cpm）：
|
|---|
| 答19 | 答23 | 答26 | C2-16型 |
|---|
| 抗-HLA-DQ | 1:50 | 8,769 | 3,239 | 3,464 | 3,524 |
| 1:150 | 10,851 | 3,846 | 3,998 | 4,383 |
| 抗-HLA-DR | 1:50 | 607 | 561 | 378 | 277 |
| 1:150 | 907 | 1,056 | 711 | 183 |
| 对照免疫球蛋白G | 1:50 | 20,598 | 7,914 | 8,076 | 4,667 |
| 1:150 | 20,258 | 10,049 | 10178人 | 6,823 |
T细胞克隆和CDR3氨基酸序列对TCR V基因的使用。
我们通过CD4分析了TCR V基因的使用+T细胞克隆。这些T细胞克隆表达不同的单个TCRβ链，但克隆A19、A23和A26表达两条TCRα链（表). 还测定了TCRα链和β链CDR3的氨基酸序列。JEV特异性CD4的TCR上没有一个独特的基序+T细胞克隆。
表9
TCR V基因的使用和TCRα和β链CDR3的氨基酸序列
| 链条 | 克隆 | V段 | CDR3区域的氨基酸序列：
| J段 |
|---|
| V（V） | N个 | J型 |
|---|
| α | C2和C2-16 | AV21S系列 | YFCAA公司 | 美国汽车工程师协会 | NYGQNFVFG公司 | AJ26型 |
| A3号 | AV22S系列 | YFCAL公司 | SDLSS系统 | NTGKLIFG公司 | AJ37型 |
| 答19 | AV9S1系列 | YCALS公司 | 天然气 | FNKFYFG公司 | AJ21型 |
| | AV20S1系列 | YYCL公司 | VGNIR公司 | GGATNKLIFG公司 | AJ32型 |
| 答23 | AV2S3型 | YLCVV公司 | TSAS公司 | DYKLSFG公司 | AJ20型 |
| | AV1S3系列 | YFCAVS公司 | PRGP公司 | YNQGGKLIFG公司 | AJ23型 |
| 答26 | AV6S1型 | Y（Y） | 地理信息系统 | NNLFFG公司 | AJ36型 |
| | AV8S1型 | YFCAAS公司 | TG公司 | GTASKLTFG公司 | AJ44型 |
| β | C2和C2-16 | BV9S1型 | YFCASS公司 | PFLASQGK公司 | GYTFG公司 | BJ1S2型 |
| A3号 | BV13S5型 | YFCASS公司 | YQTGC公司 | NQPQHFG公司 | BJ1S5号机组 |
| 答19 | BV23S1型 | YFCASS公司 | PRWGGRD公司 | YEQYFG公司 | BJ2S7型 |
| 答23 | BV4S1型 | YLCSVE公司 | TGV公司 | 定量定量 | BJ2S5型 |
| 答26 | BV18S1型 | YFCASSP公司 | TPQ公司 | ETQYFG公司 | BJ2S5型 |
讨论
在本研究中，我们分析了JEV特异性CD4+JEV疫苗免疫诱导人T细胞。免疫后，献血者A和C的血浆中JEV特异性、中和性和血凝抑制抗体水平升高（数据未显示）。在接种疫苗之前还从供体A和C获得PBMC，并检查JEV特异性增殖。尽管供体A和C在几十年前接受了第一次JEV疫苗接种（数据未显示），但这些PBMC在用JEV Ag刺激后没有增殖。另一方面，在最近一次JEV疫苗接种后6至12个月，从捐赠者处获得的PBMC在JEV-Ag刺激后表现出显著增殖。
在批量培养试验中，来自这些供体的PBMC对西尼罗河病毒和登革热病毒抗原表现出交叉反应性增殖反应。黄病毒交叉反应性记忆T细胞不太可能是由自然感染西尼罗河病毒或登革热病毒引起的，因为捐赠者从未去过这些病毒流行的地区。因此，我们得出结论，JEV疫苗免疫可诱导记忆性T细胞对WNV和登革热病毒产生交叉反应。
我们以前曾报道过，原发性登革热病毒感染可诱导黄病毒交叉反应性T淋巴细胞以及登革病毒特异性T淋巴细胞(14). 我们还报道了CD4+对登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒四种血清型具有交叉反应的T细胞克隆(14). 已报告黄病毒交叉保护(7,8). 观察到JEV免疫和WNV外周攻击的仓鼠具有高度保护性(8). JEV免疫动物受到WNV的完全保护(7). 交叉反应CD4+JEV疫苗在人体内诱导的T细胞可能对其他一些黄病毒感染具有保护作用。
本研究中建立的所有T细胞克隆均识别E蛋白。因此，JEV E蛋白既包含JEV特异性表位，也包含人类CD4识别的JEV和WNV交叉反应表位+T淋巴细胞。JEV和WNV的E蛋白氨基酸序列的同源性约为80%，而JEV与登革热病毒的同源性大约为50%。尽管大量培养增殖试验表明存在对登革热病毒具有交叉反应的T细胞，但由于氨基酸同源性较低，这些T细胞的水平可能较低。用JEV灭活疫苗免疫供体A和C，灭活疫苗由膜蛋白（M）、E和核心蛋白（C）组成，但不能产生非结构蛋白。这些事实可能是所有T细胞克隆都能识别E蛋白的原因。我们之前报道过，NS3是登革热病毒感染者T淋巴细胞识别的主要蛋白(14). 自然感染JEV的供体T淋巴细胞可以识别非结构蛋白和E蛋白。我们正计划利用自然感染JEV的捐赠者的PBMC进行T细胞分析。
我们建立了JEV特异性和黄病毒交叉反应CD4+T细胞克隆并分析这些克隆对TCR的使用。尽管有些克隆表达两条α链，但所有克隆都表达不同的单个β链。这个结果表明CD4+本研究中的T细胞克隆来源于不同的T淋巴细胞。五种JEV特异性CD4中的三种+T细胞克隆具有细胞毒活性。我们之前报道过登革热病毒特异性细胞毒性CD4+T细胞克隆(4,14). 细胞毒性和非细胞毒性登革热病毒特异性CD4的比率+T细胞克隆似乎因供体而异。令人感兴趣的是，细胞毒性CD4和非细胞毒CD4的作用是否存在差异+JEV和登革热病毒感染中的T细胞。
黄病毒交叉反应CD4的作用+继发性黄病毒感染的T细胞尚不完全清楚。中和抗体在JEV感染的保护和恢复中发挥着非常重要的作用。中和抗体的产生依赖于CD4+T细胞。CD4很可能+T细胞通过裂解受感染的细胞和支持抗体的产生，有助于黄病毒感染的恢复。CD4细胞+T细胞也可能参与黄病毒感染的发病机制。我们报告了登革热病毒血清型交叉反应CD4的证据+T淋巴细胞可能参与登革热出血热的发病(11). 虽然没有数据表明黄病毒交叉反应CD4+T淋巴细胞也可能参与登革热出血热的发病机制，需要进行流行病学研究来回答这个问题。
应根据对JEV感染保护性免疫的认识，开发新的JEV疫苗。疫苗应诱导强烈的保护性免疫，但不应诱导可能导致免疫病理的免疫。因此，对CD4进行特征分析很重要+由JEV疫苗和自然JEV感染诱导的T细胞，并了解这些T细胞在保护和恢复JEV病毒感染中的作用。我们计划从JEV感染者和JEV接种者的PBMC中建立更多JEV特异性T细胞克隆，分析其功能，并确定表位。这些研究将为开发更安全、更有效的JEV疫苗提供重要信息。
致谢
这项工作得到了日本药品不良反应救济、研发促进和产品审查组织健康科学基础研究促进计划的资助；由教育、科学、体育和文化部拨款（科研拨款08457100和拨款09044344）；以及日本卫生和福利部新发和复发传染病研究所的拨款。
参考文献
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