《维罗尔杂志》。1998年10月;72(10): 8032–8036.
乙型脑炎病毒特异性人CD4的建立及鉴定+T细胞克隆:黄病毒的交叉反应性、蛋白质识别和细胞毒性活性
,1 ,1 ,2 ,三和1,*
爱原广国
近畿大学医学院微生物学系,大阪Sayama 589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
高崎富美子
大阪山近畿大学医学院微生物系589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
松谷隆吉
大阪山近畿大学医学院微生物系589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
铃木良治
大阪山近畿大学医学院微生物系589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
黑一郎
大阪山近畿大学医学院微生物系589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
大阪山近畿大学医学院微生物系589,1和Shionogi诊断科学部2和Shionogi研究实验室,三Shionogi&Company Ltd.,日本大阪553
*通讯作者。现住址:日本东京新宿区富山1-23-1号国立传染病研究所病毒学1部,邮编:162-8640。电话:81-3-5285-1169。传真:81-3-5285-1169。电子邮件:pj.og.hin@enaruk公司. 1998年4月3日收到;1998年6月30日接受。
摘要
我们分析了CD4+两名6或12个月前接种日本脑炎病毒(JEV)疫苗的捐献者的T淋巴细胞反应。大量培养增殖试验表明,外周血单个核细胞(PBMC)对JEV抗原(Ag)有反应,但对西尼罗河病毒(WNV)和登革热病毒1型、2型和4型(分别为D1V、D2V和D4V)Ag也有较低水平的反应+从这两个供体的PBMC中建立了人T细胞克隆和一个亚克隆。两个克隆对WNV-Ag和JEV-Ag都有反应,而其他克隆只对JEV-Ag3有反应+T细胞克隆具有JEV特异性细胞毒活性和识别E蛋白。检测JEV特异性T细胞克隆的HLA限制性。三个克隆受HLA-DR4限制,一个受HLA-DQ3限制,还有一个克隆的HLA限制未确定。T细胞受体分析表明,这些克隆表达不同的T细胞受体,表明它们来自不同的T淋巴细胞。这些结果表明,JEV疫苗诱导JEV特异性和黄病毒交叉反应CD4+T淋巴细胞和这些T淋巴细胞识别E蛋白。然而,这些T淋巴细胞的功能和HLA限制模式是异质的。
日本脑炎病毒(JEV)是黄蜂科广泛分布于日本、中国、台湾、韩国、菲律宾、俄罗斯远东和东南亚(10,19,22). 临床表现为热性头痛综合征、无菌性脑膜炎或脑炎(三,5). 临床上公开的JEV感染会导致意识受损和四肢瘫痪。死亡发生在第5天至第9天,或发生在具有心肺影响的更长时间的过程中。死亡率为5至40%(19). 幸存者会出现神经精神后遗症,在儿童中尤为严重(17).
日本目前可用的JEV疫苗是一种从JEV感染小鼠大脑中纯化的福尔马林灭活病毒制剂(21). 这种疫苗被证明对JEV感染是安全有效的(9). 然而,人们对这种JEV疫苗表示担忧。从受感染的小鼠脑中制备疫苗需要采取生物安全预防措施。这种疫苗在发展中国家使用过于昂贵。此外,疫苗可能仍含有少量小鼠大脑成分。因此,开发新型JEV疫苗是一个有待解决的项目。
一种新的JEV疫苗应该含有能诱导对JEV感染产生强烈保护性免疫的表位。人们普遍认为,中和抗体在JEV感染的保护和恢复中发挥着重要作用;然而,T细胞介导免疫的作用尚不清楚。据报道,辅助性T淋巴细胞在血管周围浸润中占主导地位,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所代表的人群较少(15——17,19,20).
在本文中,我们报告了从接种JEV疫苗的供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)对西尼罗河病毒(WNV)和登革热病毒以及散装培养的JEV有反应。我们建立并表征了JEV特异性人CD4+T细胞克隆。我们分析了T细胞克隆,重点是对其他黄病毒的交叉反应、细胞毒活性、病毒蛋白的识别和HLA限制。两个T细胞克隆对WNV具有交叉反应,而其他克隆仅对JEV有反应。一些克隆对表达JEV E蛋白的自体靶细胞具有细胞毒性。这是首次报道JEV特异性人类CD4+T细胞克隆。
材料和方法
病毒。
JEV(Nakayama株)由神户大学医学院的Eiji Konishi提供。如前所述,JEV在C6/36细胞中繁殖(13). 简言之,C6/36单层细胞在5个PFU/细胞的多重感染(MOI)下感染JEV,并在28°C的含有2%胎牛血清(FCS)的最低基本培养基中培养3至4天。收集上清液,并将其储存在−80°C下,直至使用。上清液的病毒滴度约为1.2×108Vero细胞斑块分析中的PFU/ml。重组痘苗病毒vP829、vP658、vP555和vP410由纽约州特洛伊的病毒发生学公司提供,vP828、vP 658和vP 555分别携带JEV中山株的prM和E基因、E和NS1基因以及prM、E和NS 1基因。vP410不含任何JEV基因。
黄病毒抗原的制备。
如前所述,从JEV感染的Vero细胞中制备JEV抗原(Ag)(12). 简言之,Vero细胞在5 PFU/细胞的MOI下感染,并在37°C的含有2%FCS的最小基本培养基中培养,直到50%的细胞显示出细胞病变效应。通过刮取细胞,在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤,用0.025%戊二醛在PBS中在冰上固定15分钟,在PBS内洗涤三次,然后在3×108RPMI 1640中的细胞/ml。用Ultra S均质器VP-15S(日本柴达木省台达县)在冰上对固定细胞进行超声处理,并在1500×克在4°C下保持10分钟。收集上清液,分成等分,并在−80°C下冷冻。对照银也是从未感染的Vero细胞单层制备的。登革热病毒1型、2型、3型和4型(分别为D1V、D2V、D3V和D4V)和WNV-Ag由马萨诸塞大学医学中心的Francis A.Ennis提供。
人PBMC。
从两名健康的日本成年人(捐赠者A和捐赠者C)采集外周血样本,他们在6至18个月前接种了JEV(北京株)疫苗。几十年前,这些捐赠者还接种了JEV疫苗。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心纯化PBMC(1). 细胞在10时重新悬浮7/在RPMI 1640中加入10%FCS和10%二甲基亚砜,冷冻保存至使用。供者A的HLA分型为A2、A24;B38-B59;CW1、CW7;DRB1*0405、DRB1*0803、DQB1*0301、DQB1*0401和DPB1*0402、DPB1*1401,分别被视为DR4、DR8、DQ3、DQ4和DPw4。供者C的HLA分型为A24、A33;B52、B35;CW3;DRB1*0405、DRB1*1502、DQB1*0401、DQB1*0601和DPB1*0201、DPB1*0901,分别被视为DR4、DR15、DQ4、DQ6和DPw2。供者B的HLA分型为A24、A33;B44;DQ1、DQ3;和DR2、DR5。
PBMC在大量培养中的增殖反应。
多溴联苯胺的增殖测定如前所述进行(12). PBMC(1×105至2×105)在含有10%热灭活人类AB血清的0.2 ml AIM-V培养基(GIBCO)中与1:100至1:200稀释Ag在37°C的96周V底微量滴定板(Coster,Cambridge,Mass.)中培养7天。用1μCi的氚化胸腺嘧啶对细胞进行脉冲处理([三H] 胸腺嘧啶)在收获前18小时。它们是用多收获机收获的(弗吉尼亚州斯特林市斯科特龙公司),以及[三H] 在液体闪烁计数器中计算胸腺嘧啶掺入量。
通过限制稀释建立JEV特异性T细胞克隆。
如前所述,通过限制稀释建立JEV特异性T细胞克隆(6,23). 用JEV-Ag刺激PBMC 7天。通过限制稀释法克隆从受刺激PBMC分离的T细胞母细胞。供体A的T细胞以每孔1个细胞的速度克隆,供体C的T细胞则以每孔10个细胞的频率克隆,然后以每孔0.3个细胞的速率在96周的圆形微孔板中以每毫升0.2 ml含有10%FCS和20 U重组白细胞介素2(IL-2)的AIM-V培养基中重新克隆。丝裂霉素C(0.05 mg/ml)治疗或γ射线照射(3500 rads)自体PBMC(105)并将直径为1:200至1:400的JEV Ag添加到每个井中。每隔3至4天,从每个孔中取出0.1 ml培养基,用每ml含有10%FCS和20 U IL-2的AIM-V培养基替换。在第10至14天,对生长细胞进行Ag特异性测试。刺激指数(SI)大于2.0的克隆被认为是JEV特异性克隆,并进行了进一步研究。克隆效率低于1%。在γ射线照射或丝裂霉素C处理的PBMC(106)在每毫升含10%FCS和20 U IL-2的1.0 ml AIM-V培养基中,48个平板(日本东京磐石玻璃)。
免疫荧光染色。
总计6×104至12×104细胞在冰上用异硫氰酸荧光素标记的抗CD3、抗CD4和抗CD8(DAKO A/S,Glostrup,Denmark)染色30分钟,并在含有2%FCS的PBS中洗涤。将细胞重新悬浮在PBS中50%的甘油中,并用荧光显微镜检查。
T细胞克隆增殖试验。
T细胞克隆(1×104至2×104细胞/孔)与γ射线照射或丝裂霉素C处理的PBMC(1×105至2×10596 well V型底部微量滴定板中是否存在Ag。培养48小时后[三H] 加入胸腺嘧啶核苷(1μCi/孔),18小时后收获细胞[三H] 胸腺嘧啶核苷摄取用闪烁计数器定量。SI的计算公式为病毒Ag刺激引起的每分钟计数除以对照Ag刺激诱发的每分钟数。当(i)SI大于2.0和(ii)[三H] 胸腺嘧啶掺入量大于1000cpm。在一些实验中,将HLA-DQ或HLA-DR单克隆抗体(日本东京科斯莫生物有限公司)或小鼠免疫球蛋白G的最佳浓度添加到培养物中,以确定HLA限制性。
成立BLCL。
B淋巴细胞样细胞系(BLCL)如先前报道的那样建立(14). PBMC(1×106至2×106)在含有20%FCS、青霉素和链霉素的RPMI 1640中用1:3稀释的B95-8细胞上清液培养。B95-8细胞由Tottori大学医学院Takeshi Sairenji提供。
靶细胞的制备。
总计1×105至1.5×105将Epstein-Barr病毒转化的BLCL细胞在含有2%FCS的RPMI 1640中清洗一次,并在37°C下以10 PFU/cell的MOI感染JEV重组痘苗病毒。细胞在含有2%FCS的RPMI1640中培养2小时。细胞在含10%FCS的2ml RPMI 164024孔板中培养16至20小时。清洗受感染的BLCL,并用0.25 mCi的51在37°C条件下,将含有10%FCS的0.1 ml RPMI 1640中的Cr浸泡1小时。标记后,将细胞在含有10%FCS RPMI 1640中清洗四次,以去除未合并的细胞51Cr。对细胞进行计数并稀释至104每毫升细胞数用于细胞毒性试验。
细胞毒性试验。
如前所述,使用96-well V型底板进行分析(2,14). 将0.1 ml含有10%FCS的RPMI 1640中的效应细胞添加到10三 51Cr标记靶细胞的效应细胞/靶细胞(E/T)比率为10:1至20:1。将平板在37°C下培养5 h。采集上清液51使用自动伽马计数器(自动井伽马系统ARC-300;日本东京,阿洛卡)测量铬含量。特定百分比51Cr释放量采用公式[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发发布)]×100(释放量以每分钟计数计算)计算。分析分三次进行,并计算三次孔的平均值。
TCR V基因使用分析和互补决定区3(CDR3)的测序。
如前所述,使用基于适配器连接PCR的微孔板杂交分析T细胞克隆对T细胞受体(TCR)V基因的使用(18). 简单地说,43个TCR-αV基因(TCRAV)和38个TCR--βV基因(TCRBV)特异性探针被固定在水溶性碳二亚胺微孔中。5′-生物素化PCR产物杂交后,如前所述进行(18)进行定量酶联免疫吸附分析,然后进行自动比色读数。
在确定T细胞克隆的TCRAV和TCRBV序列后,用规定的TCRAV-或TCRBV特异性引物和引物CA4或CB4进行20个周期的PCR,体积为50μl(18). 用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物溶解在50μl蒸馏水中,并使用序列PRO(日本大阪东洋)对序列进行循环测序分析。
结果
PBMC对JEV-Ag的增殖反应。
我们首先检测了从捐赠者A和C获得的PBMC对JEV-Ag的增殖反应。这些捐赠者在6到12个月前接种了JEV疫苗。供体A和供体C的PBMC在JEV-Ag刺激后表现出显著的增殖反应,并且存在剂量-反应关系(表). 当供体A的PBMC与稀释度为1:100至1:400的JEV Ag培养时,以及供体B的PBMC和稀释度为1:80至1:320的JEV-Ag培养时,检测到高水平的增殖。因此,在接下来的增殖分析中,我们使用稀释度为1-100至1:200的JEV-Ag。
表1
供体A和供体C的PBMC对批量培养中连续稀释的JEV-Ag的增殖反应
PBMC捐助者 | 抗原稀释 | [三H] 由以下银诱导的胸腺嘧啶掺入(cpm):
|
---|
JEV公司 | 控制 |
---|
A类一 | 1:100 | 11622人 | 3,462 |
| 1:200 | 10,943 | 158 |
| 1:400 | 8,973 | 116 |
| 1:800 | 4,387 | 515 |
| 1:1,600 | 1,593 | 182 |
C类b条 | 1:80 | 13,082 | 1,032 |
| 1:160 | 8,595 | 1,650 |
| 1:320 | 7,644 | 2,990 |
| 1:640 | 2,453 | 2,027 |
| 1:1,280 | 3,203 | 1,488 |
在批量培养中PBMC对其他黄病毒抗原的增殖反应。
供体A的PBMC与黄病毒Ag以1:100和1:200的最终稀释液培养7天,并且[三H] 测定胸腺嘧啶掺入量。这些PBMC在JEV-Ag刺激后增殖,在D1V、D2V、D4V和WNV-Ag刺激后增殖到较低水平(表). 供体C的PBMC在D1V、D2V、D3V、D4V和WNV-Ag刺激后增殖(数据未显示)。这些捐赠者从未去过登革热病毒和西尼罗河病毒流行的地区。因此,结果表明,JEV疫苗免疫诱导的记忆性T淋巴细胞主要是JEV特异性的,但也包括与其他黄病毒交叉反应的T细胞。
表2
供体A PBMC对JEV-Ag和其他黄病毒Ag的增殖反应一
银 | [三H] 胸腺嘧啶核苷掺入,单位为cpm(SI),Ag稀释度为:
|
---|
1:100 | 1:200 |
---|
JEV公司 | 61,748 (18.0) | 43,157 (16.0) |
D1V型 | 6,562 (2.0) | 15,214 (5.6) |
D2V型 | 17,966 (5.3) | 14,316 (5.3) |
D3伏 | 4,762 (1.4) | 2,728 (1.0) |
D4V型 | 1,198 (0.4) | 16,615 (6.1) |
WNV公司 | 7,285 (2.2) | 21,601 (8.0) |
控制 | 3,363 | 2,705 |
CD4增殖反应+黄病毒抗原的T细胞克隆。
我们建立了四个CD4+来自供体A PBMC和一个JEV特异性CD4的T细胞克隆A3、A19、A23和A26+通过材料和方法中所述的限制稀释,从供体C PBMC获得T细胞克隆C2及其亚克隆C2-16。这些克隆是根据对JEV-Ag的显著增殖反应水平选择的。所有克隆都具有CD3表型+CD4细胞+CD8(CD8)−,通过免疫荧光染色测定(数据未显示)。
我们检测了这些T细胞克隆对WNV、D1V、D2V、D3V和D4V Ag的交叉反应+根据对黄病毒Ag的反应,将T细胞克隆分为两组(表). (i) A19、A23、C2和C2-16对JEV Ag有反应,但对任何其他检测的黄病毒Ag无反应。(ii)A3和A26对JEV和WNV-Ag有反应,但对登革热病毒Ag无反应。克隆A3对WNV-Ag的反应低于JEV-Ag,而克隆A26对WNV Ag的反应与JEV-A相似或更高。这些结果表明JEV应答的CD4+T细胞克隆具有异质性黄病毒交叉反应性。
表3
JEV特异性CD4的增殖反应+黄病毒抗原的T细胞克隆一
克隆 | [三H] 用以下Ag刺激后,胸腺嘧啶掺入,以cpm(SI)计:
|
---|
JEV公司 | WNV公司 | D1V型 | D2V型 | D3伏 | D4V型 | 控制 | 无 |
---|
A3号 | 6,130 (8.0) | 1,645 (2.2) | 522 (0.7) | 647 (0.9) | 1,112 (1.5) | 707 (0.9) | 759 | 752 |
答19 | 1,275 (8.9) | 308 (2.1) | 105 (0.7) | 46 (0.3) | 349 (2.4) | 386 (2.6) | 144 | 218 |
答23 | 2,345 (10.0) | 62 (0.3) | 164(0.7) | 139 (0.6) | 81 (0.4) | 122 (0.5) | 225 | 65 |
答26 | 3,834 (6.9) | 7,933 (14.0) | 682 (1.2) | 822 (1.4) | 547 (1.0) | 924 (1.6) | 556 | 918 |
指挥与控制 | 14473(4.1) | 3886(1.0) | 3,141 (0.9) | 2,695 (0.8) | 3,360 (1.0) | 3,640 (1.0) | 3,503 | 3,626 |
C2-16型 | 11,842 (6.3) | 1,490 (0.8) | 3,118 (1.6) | 1,879 (1.0) | 2,430 (1.3) | 2,781 (1.5) | 1,869 | 2,500 |
CD4裂解表达JEV蛋白的自体靶细胞+T细胞克隆。
CD4细胞+检测T细胞克隆的JEV特异性细胞毒活性。用vP829(一种含有JEV prM和E基因的重组痘苗病毒)感染自体BLCL,并作为CTL检测的靶细胞。JEV应答性T细胞克隆A19、A26、C2和C2-16裂解了vP829感染的靶细胞,而A3和A23没有(表).
表4
JEV应答性T细胞克隆对vP829感染靶细胞的裂解一
克隆 | %特定51感染以下疾病的自体靶细胞释放铬:
|
---|
vP829版 | vP410版本 |
---|
A3号 | 4 | 1 |
答19 | 76 | 25 |
答23 | 6 | 1 |
答26 | 59 | 0 |
指挥与控制 | 76 | 三 |
C2-16型 | 48 | 0 |
CD4对JEV E蛋白的识别+T细胞克隆。
JEV特异性和JEV与WNV交叉反应性CTL克隆对感染vP829的BLCL的裂解表明,这些CTL克隆能够识别JEV的prM或E蛋白。我们检测了感染vP829、vP555(一种含有JEV prM、E和NS1基因的重组痘苗病毒)或vP658(一种含JEV E和NSI基因的重组疫苗病毒)的目标细胞的裂解,以确定识别了哪种病毒蛋白。CD4+感染vP555、vP658和vP829的T细胞克隆A19、A26和C2裂解靶细胞(表). 这一结果表明,CTL克隆A19、A26和C2识别JEV E蛋白。
表5
JEV特异性CD4对JEV E蛋白的识别+CTL克隆一
目标细胞感染的病毒(携带JEV基因) | %特定51Cr释放方式:
|
---|
答19 | 答26 | 指挥与控制 |
---|
vP555(prM、E和NS1) | 58 | 36 | 75 |
vP658(E和NS1) | 42 | 27 | 52 |
vP829(prM和E) | 47 | 40 | 71 |
vP410(无[控制]) | 13 | 0 | 2 |
JEV特异性CD4的HLAⅡ类限制+T细胞克隆。
为了确定JEV特异性CD4的HLA限制性+T细胞克隆,我们使用供体A、B和C的PBMC作为抗原呈递细胞(APC)进行T细胞增殖试验。当供体B PBMC和自体PBMC用作APC时,克隆A3增殖(表). 因此,我们得出结论,A3受到HLA-DQ3的限制,因为供体A和B只共享HLA-DQ3。当供体A和C的PBMC用作APC时,克隆A19、A26和C2-16增殖(表). 这一结果表明克隆A19、A26和C2-16受到HLA-DQ4或HLA-DR4的限制。无法确定克隆A23的HLA限制性,因为它只有在用自体APC刺激时才会增殖(表). 这些结果与CTL分析结果一致(表). CTL克隆A19、A26、C2和C2-16裂解vP829感染供体A和供体C BLCL。
表6
CD4增殖+自体或异体APC存在下JEV-Ag刺激后的T细胞克隆一
APC供体 | HLA II类
| 用JEV Ag刺激以下克隆后的SI:
|
---|
DP公司 | DQ公司 | 博士 | A3号 | 答19 | 答23 | 答26 | C2-16型 |
---|
A类 | 4-B1*1401 | 3,4 | 4、8 | 6.8 | 7.1 | 9.4 | 4.1 | 6.5 |
B类 | | 1,3 | 2,5 | 5.2 | 1.1 | 1 | 0.7 | 0.4 |
C类 | 2-B1*0901 | 4,6 | 4,15 | 1.3 | 3.1 | 0.9 | 4.3 | 15 |
表7
CD4对感染vP829的同种异体BLCL的裂解+CTL克隆一
靶细胞供体和感染病毒 | %特定51C发布人:
|
---|
答19 | 答26 | 指挥与控制 | C2-16型 |
---|
A类 | |
vP829版 | 76 | 59 | 76 | 49 |
vP410型 | 18 | 0 | 三 | 0 |
C类 | |
vP829版 | 88 | 62 | 75 | 59 |
vP410版本 | 28 | 5 | 2 | 6 |
抗HLA-DR抗体可抑制克隆A19、A23、A26和C2-16对JEV-Ag的增殖反应,但抗HLA-DQ抗体或对照抗体不能抑制克隆的增殖反应(表). 这些结果以及表中所示的结果和,表明克隆A19、A26和C2-16受HLA-DR4限制。
表8
抗HLA DR抗体对JEV特异性T细胞克隆增殖的抑制作用一
抗体 | 最终稀释 | [三H] 胸腺嘧啶掺入(cpm):
|
---|
答19 | 答23 | 答26 | C2-16型 |
---|
抗-HLA-DQ | 1:50 | 8,769 | 3,239 | 3,464 | 3,524 |
| 1:150 | 10,851 | 3,846 | 3,998 | 4,383 |
抗-HLA-DR | 1:50 | 607 | 561 | 378 | 277 |
| 1:150 | 907 | 1,056 | 711 | 183 |
对照免疫球蛋白G | 1:50 | 20,598 | 7,914 | 8,076 | 4,667 |
1:150 | 20,258 | 10,049 | 10178人 | 6,823 |
T细胞克隆和CDR3氨基酸序列对TCR V基因的使用。
我们通过CD4分析了TCR V基因的使用+T细胞克隆。这些T细胞克隆表达不同的单个TCRβ链,但克隆A19、A23和A26表达两条TCRα链(表). 还测定了TCRα链和β链CDR3的氨基酸序列。JEV特异性CD4的TCR上没有一个独特的基序+T细胞克隆。
表9
TCR V基因的使用和TCRα和β链CDR3的氨基酸序列
链条 | 克隆 | V段 | CDR3区域的氨基酸序列:
| J段 |
---|
V(V) | N个 | J型 |
---|
α | C2和C2-16 | AV21S系列 | YFCAA公司 | 美国汽车工程师协会 | NYGQNFVFG公司 | AJ26型 |
| A3号 | AV22S系列 | YFCAL公司 | SDLSS系统 | NTGKLIFG公司 | AJ37型 |
| 答19 | AV9S1系列 | YCALS公司 | 天然气 | FNKFYFG公司 | AJ21型 |
| | AV20S1系列 | YYCL公司 | VGNIR公司 | GGATNKLIFG公司 | AJ32型 |
| 答23 | AV2S3型 | YLCVV公司 | TSAS公司 | DYKLSFG公司 | AJ20型 |
| | AV1S3系列 | YFCAVS公司 | PRGP公司 | YNQGGKLIFG公司 | AJ23型 |
| 答26 | AV6S1型 | Y(Y) | 地理信息系统 | NNLFFG公司 | AJ36型 |
| | AV8S1型 | YFCAAS公司 | TG公司 | GTASKLTFG公司 | AJ44型 |
β | C2和C2-16 | BV9S1型 | YFCASS公司 | PFLASQGK公司 | GYTFG公司 | BJ1S2型 |
| A3号 | BV13S5型 | YFCASS公司 | YQTGC公司 | NQPQHFG公司 | BJ1S5号机组 |
| 答19 | BV23S1型 | YFCASS公司 | PRWGGRD公司 | YEQYFG公司 | BJ2S7型 |
| 答23 | BV4S1型 | YLCSVE公司 | TGV公司 | 定量定量 | BJ2S5型 |
| 答26 | BV18S1型 | YFCASSP公司 | TPQ公司 | ETQYFG公司 | BJ2S5型 |
讨论
在本研究中,我们分析了JEV特异性CD4+JEV疫苗免疫诱导人T细胞。免疫后,献血者A和C的血浆中JEV特异性、中和性和血凝抑制抗体水平升高(数据未显示)。在接种疫苗之前还从供体A和C获得PBMC,并检查JEV特异性增殖。尽管供体A和C在几十年前接受了第一次JEV疫苗接种(数据未显示),但这些PBMC在用JEV Ag刺激后没有增殖。另一方面,在最近一次JEV疫苗接种后6至12个月,从捐赠者处获得的PBMC在JEV-Ag刺激后表现出显著增殖。
在批量培养试验中,来自这些供体的PBMC对西尼罗河病毒和登革热病毒抗原表现出交叉反应性增殖反应。黄病毒交叉反应性记忆T细胞不太可能是由自然感染西尼罗河病毒或登革热病毒引起的,因为捐赠者从未去过这些病毒流行的地区。因此,我们得出结论,JEV疫苗免疫可诱导记忆性T细胞对WNV和登革热病毒产生交叉反应。
我们以前曾报道过,原发性登革热病毒感染可诱导黄病毒交叉反应性T淋巴细胞以及登革病毒特异性T淋巴细胞(14). 我们还报道了CD4+对登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒四种血清型具有交叉反应的T细胞克隆(14). 已报告黄病毒交叉保护(7,8). 观察到JEV免疫和WNV外周攻击的仓鼠具有高度保护性(8). JEV免疫动物受到WNV的完全保护(7). 交叉反应CD4+JEV疫苗在人体内诱导的T细胞可能对其他一些黄病毒感染具有保护作用。
本研究中建立的所有T细胞克隆均识别E蛋白。因此,JEV E蛋白既包含JEV特异性表位,也包含人类CD4识别的JEV和WNV交叉反应表位+T淋巴细胞。JEV和WNV的E蛋白氨基酸序列的同源性约为80%,而JEV与登革热病毒的同源性大约为50%。尽管大量培养增殖试验表明存在对登革热病毒具有交叉反应的T细胞,但由于氨基酸同源性较低,这些T细胞的水平可能较低。用JEV灭活疫苗免疫供体A和C,灭活疫苗由膜蛋白(M)、E和核心蛋白(C)组成,但不能产生非结构蛋白。这些事实可能是所有T细胞克隆都能识别E蛋白的原因。我们之前报道过,NS3是登革热病毒感染者T淋巴细胞识别的主要蛋白(14). 自然感染JEV的供体T淋巴细胞可以识别非结构蛋白和E蛋白。我们正计划利用自然感染JEV的捐赠者的PBMC进行T细胞分析。
我们建立了JEV特异性和黄病毒交叉反应CD4+T细胞克隆并分析这些克隆对TCR的使用。尽管有些克隆表达两条α链,但所有克隆都表达不同的单个β链。这个结果表明CD4+本研究中的T细胞克隆来源于不同的T淋巴细胞。五种JEV特异性CD4中的三种+T细胞克隆具有细胞毒活性。我们之前报道过登革热病毒特异性细胞毒性CD4+T细胞克隆(4,14). 细胞毒性和非细胞毒性登革热病毒特异性CD4的比率+T细胞克隆似乎因供体而异。令人感兴趣的是,细胞毒性CD4和非细胞毒CD4的作用是否存在差异+JEV和登革热病毒感染中的T细胞。
黄病毒交叉反应CD4的作用+继发性黄病毒感染的T细胞尚不完全清楚。中和抗体在JEV感染的保护和恢复中发挥着非常重要的作用。中和抗体的产生依赖于CD4+T细胞。CD4很可能+T细胞通过裂解受感染的细胞和支持抗体的产生,有助于黄病毒感染的恢复。CD4细胞+T细胞也可能参与黄病毒感染的发病机制。我们报告了登革热病毒血清型交叉反应CD4的证据+T淋巴细胞可能参与登革热出血热的发病(11). 虽然没有数据表明黄病毒交叉反应CD4+T淋巴细胞也可能参与登革热出血热的发病机制,需要进行流行病学研究来回答这个问题。
应根据对JEV感染保护性免疫的认识,开发新的JEV疫苗。疫苗应诱导强烈的保护性免疫,但不应诱导可能导致免疫病理的免疫。因此,对CD4进行特征分析很重要+由JEV疫苗和自然JEV感染诱导的T细胞,并了解这些T细胞在保护和恢复JEV病毒感染中的作用。我们计划从JEV感染者和JEV接种者的PBMC中建立更多JEV特异性T细胞克隆,分析其功能,并确定表位。这些研究将为开发更安全、更有效的JEV疫苗提供重要信息。
致谢
这项工作得到了日本药品不良反应救济、研发促进和产品审查组织健康科学基础研究促进计划的资助;由教育、科学、体育和文化部拨款(科研拨款08457100和拨款09044344);以及日本卫生和福利部新发和复发传染病研究所的拨款。
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