小核糖核酸病毒基因组是一个长约7.5 kb的单链RNA，带有一个开放的阅读框，用于阅读分子量约为250 kDa的多聚蛋白。病毒多聚蛋白P1-P2-P3的蛋白质裂解是病毒生命周期的核心，导致衣壳蛋白（VPO、VP3、VP1或VP1-2A）从P1或P1-2A结构域释放，非结构蛋白从P2和P3结构域释放。所有小核糖核酸病毒共同的主要蛋白酶3C赞成的意见从多聚蛋白的P3结构域中切除自身，并催化多聚蛋白内的几乎所有裂解。一种额外的蛋白酶，2A赞成的意见或者一个不寻常的非酶步骤专门催化结构蛋白前体的释放(23). 甲型肝炎病毒（HAV）是一种特殊的病毒，因为2A蛋白具有蛋白水解活性，并附着在VP1及其前体上(13,14). 对于甲型肝炎，有人提出P1-2A是结构蛋白的功能前体，通过蛋白酶3C从初级翻译产物中释放出来赞成的意见(1,16,21,26,29). 此外，与大多数其他小核糖核酸病毒不同，甲型肝炎病毒在感染细胞中复制非常缓慢，虽然病毒结构蛋白积累，因此在细胞培养中可以检测到，但P2和P3结构域的非结构蛋白及其前体均未被发现，可能是由于甲型肝炎的代谢活性低或蛋白质稳定性低(9,32). 为了绕过病毒在感染细胞中复制迟缓所造成的限制，采用了各种重组表达系统来研究甲型肝炎病毒多聚蛋白的加工。通过细菌和真核生物在体内和体外的表达，显示3C赞成的意见能够从初级翻译产物中释放所有结构和非结构蛋白质(12,20,21,29–31).
脊髓灰质炎病毒的主要P3加工中间产物，即小RNA病毒原型，是蛋白质3AB和3CD，它们在蛋白质加工和基因组复制中具有不同的功能。3CD公司赞成的意见蛋白酶3C的前体赞成的意见和聚合酶3D赞成的意见，切割P1比切割3C好得多赞成的意见(35)由于其与病毒RNA结构的特异结合，在RNA合成中起着关键作用(2). 基因组连锁蛋白VPg（3B）的前体3AB的多种功能已被广泛研究(34). 虽然已经检测到几种稳定的甲型肝炎病毒P3处理中间产物（如3ABC和3CD），但它们独特的蛋白水解活性以及在病毒生命周期中的作用尚未得到直接评估(12,14,31).
为了进一步理解P3中间体在病毒生命周期中的作用，通过表达一组嵌套的HAV 3C来详细评估完整P3结构域及其蛋白水解中间体的加工赞成的意见瞬时真核系统中的前体多肽。数据表明，3A作为多肽的一部分，影响P3的切割效率，并允许我们提出一种加工方案，该方案论证了已知3C-3D连接的另一个切割位点C末端。尽管3C的P1-2A内的蛋白水解能力赞成的意见其前体几乎相同，有证据表明，除3C外，还需要其他P3蛋白才能有效组装病毒颗粒，如P1-2A与不同P3衍生结构体共表达或表达3AB或3D中缺失的HAV基因组的实验所示。
材料和方法
质粒的构建。
为了在痘苗病毒T7系统中表达，将HAV P3的不同区域插入pGEM2。为了克隆精确的P3-、3ABC-、3BC-、3C-、3BSD-和3CD编码区，我们依赖于已发表的2C/3A、3A/3B、3B/3C和3C/3D切割位点(8,12,31). 以下引物用于减毒株HAV HM175亚基因片段的PCR扩增：引物1，5′-ATGGAAGCTT公司GCACCATGGGAATTTCAGATGATGATAATGATAG-3′（感测3A）；底漆2，5′-ACCAAGCTT公司GCACCATGGGGTATATATGGTTAACTA-3′（感测3B）；底漆3，5′-GATCAAGCTT公司GCACCATGGCAACTTTGGAAATAGCAGACTGG-3′（感测3C）；底漆4，5′-TTGGATCC公司TTACTGACTTCAATTTCTTATCAA-3′（反义3C）；和底漆5，5′-TAGGATCC公司TCATGAAAGGTCAAATGAAACACT-3′（反义3D）。这个欣dIII和巴姆HI限制站点下划线。以引物1、4和pT7-HAV1为模板(11)用PCR扩增3ABC编码区（核苷酸位置4996～5943）。给出的所有核苷酸位置均指HM175减毒株的核苷酸序列(5). 利用引物1和5、引物2和4、引物5和2、引物3和4以及引物3、5、P3（核苷酸[nt]4996至7410）、3BC（核苷酸[nt 5218至5943）、3BCD（nt 5281至7410。这个Hin公司dIII型-巴姆将HI限制性PCR片段插入pGEM2的相应位点，使甲型肝炎病毒编码序列的转录由T7启动子驱动。DNA测序证实了适当阅读框的保守性，该测序分别鉴定了pT7-HAV1的6211和7027位核苷酸的中性T到C和C到T交换，产生了对dam敏感的Xba公司I限制位点位于核苷酸6211位。构造的示意图如图所示。表达质粒pEXT7-HM/HM-P1-2A（E/S）在VP1-2A氨基酸273/274位含有裂解位点E/S，这是3C所青睐的赞成的意见如前所述(26). pT7-HAV1-Δ3AB，编码P1-P2-3CD，对应于帧内缺失3AB的HAV开放阅读帧，通过重新选择10kb生态RI公司-Bsh公司编码P1-P2-P3的pT7-HAV1的1365I-限制性和钝端（Klenow聚合酶）片段(11). 2C的七个C端氨基酸被一个亮氨酸取代，然后是六个3B的C端氨基酸，从而产生一个源自前3B-3C连接的2C/3C裂解位点。在重刑之后Xho公司获得了I线性化的钝端pT7-HAV1，pT7-HAV1-3DΔ，它编码HAV多蛋白P1-P2-3ACDΔ，与3D的C端截短28%。
用于痘苗病毒T7系统瞬时共表达的甲型肝炎病毒cDNA结构示意图(7). 甲型肝炎病毒编码序列的转录由T7启动子驱动。开放阅读框N末端的氨基酸残基来源于翻译起始密码子下游的载体编码序列。为了确保翻译起始的效率相同，所有P3衍生序列之前都有一个翻译起始密码子，密码子两侧有一个保守序列(15). 翻译的终止由终止密码子保证。
COS7细胞中的表达。
对于哺乳动物的瞬时表达，我们使用痘苗病毒表达系统(6,7). COS7细胞（3×105)按照制造商的指示（Gibco/BRL-Life Technologies），将1μg纯化cDNA和9μl LipofectAmine转染到35-mm直径的微孔中过夜生长至约70%的汇合处。转染后3小时，在37°C下感染vTF7-3（感染多重性，1）30分钟。将培养基替换为2 ml添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基后，继续培养18 h，然后用250μl含有0.05%（vol/vol）吐温20的磷酸盐缓冲盐水将细胞刮离培养板。在含有0.1%十二烷基硫酸钠的不连续12%聚丙烯酰胺凝胶上分离70微升粗细胞提取物，并将其吸附在硝化纤维素膜上。膜的Ponceau-S染色证实了蛋白质转移的效率。用于免疫检测，多克隆抗血清抗3D(31)、抗3B、抗3C(30)，抗VPO(9)，抗VP1(9)使用与碱性磷酸酶结合的免疫球蛋白。
甲型肝炎病毒抗原性和颗粒的特征。
用台式离心机在13000×克用中和单克隆抗体K2-4F2作为捕获抗体和检测抗体，用颗粒特异性酶联免疫吸附试验（ELISA）在适当稀释液中分析上清液(19). 每个转染试验进行两次，并在一个或两个单独的实验中进行两次分析。作为阴性对照，单独表达P3中间产物和P1-2A。特异性抗原性被估计为不同组共表达的平均ELISA信号，由阴性对照组的平均值归一化，将其设置为零。为了表征体内产生的甲型肝炎病毒颗粒，用SW65转子（75 min，48000 rpm，5°C）对粗细胞提取物进行连续蔗糖梯度处理（在10 mM Tris-HCl中，pH 7.3）。用颗粒特异性ELISA分析各个组分，并用折射计测定其蔗糖浓度。
结果和讨论
HAV P3处理的详细分析。
3ABC和3CD都被同时检测为甲型肝炎病毒P3处理的中间产物，但哪些因素调节这些部分重叠的裂解产物的生成尚不清楚(31). 为了揭示甲型肝炎病毒P3中可能的蛋白水解途径，我们表达了3C赞成的意见及其前体作为一套嵌套的蛋白与痘苗病毒T7系统。如图所示。使用针对3D（第一组）、3B（第二组）和3C（第三组）的单特异性多克隆抗血清，通过免疫印迹分析单独或在P1-2A存在下表达3C、3BC、3BCD、3ABC和P3的细胞产物。来自P3（通道2）、3CD（通道3）和3BCD（通道4）的抗3D反应蛋白模式包括未分离的前体蛋白P3、3CD和3BCD以及一些加工产物。少量成熟的3CD被从P3（通道2）和3BCD（通道4）上切割下来，与3CD表达细胞的前体多肽（通道3）结合。最显著的解理产物是3D，从P3和3BCD中几乎等量释放出来。除了各种较大的抗3D反应多肽外，还发现了大量大约40-kDa的蛋白质，这些蛋白质可能是降解或替代翻译起始的产物。3C表达细胞的提取物与抗3D无反应，证明了抗血清的特异性（第1道）。在表达P3、3ABC和3BCD的细胞提取物中，具有3ABC（通道5和6）、3BC（通道5-7）和3AB（通道5与6）流动性的多肽是抗3B检测到的主要加工产物（第二组；其他条带见下文）。利用抗3C（第三组），除了加工中间体和成熟蛋白酶（分别为通道8至12）外，还可以鉴定出所有未分离的前体P3、3ABC、3CD、3BCD和3BC，明确证据表明P3以及P3衍生的中间体（3BCD、3CD，3ABC和3BC）具有蛋白水解活性。尽管几乎所有的中间产物和最终产物都被检测为加工产物，但它们的相对比例在所测试的各种前体中存在显著差异，这表明P3内不同位点的裂解效率差异很大，并且依赖于3C包被结构域。在P3衍生的和抗3C反应性多肽中，3ABC、3BC和3C是主要的切割产物，而3BCD和3CD以微量存在（泳道8）。来自P3的其他抗3C反应蛋白通过与来自其他含3C前体的加工产物结合来鉴定，下文将对此进行讨论。从3ABC衍生出的整体产品模式与P3相似，导致等量3C和3BC的生产（第9车道）。相比之下，前体3BCD（第11车道）和3BC（第12车道）仅生成少量3C，这意味着当前体中没有3A时，3B-3C接合处的解理效率很低。
甲型肝炎病毒P3及其蛋白水解活性衍生物瞬时表达后的免疫印迹分析。用上述cDNA转染的细胞提取物（见图。分析了裂解产物A至M）和vTF7-3的P3处理模式。在一个凝胶上电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上后，对重组蛋白进行免疫学检测，图的底部显示抗血清。放大的面板来自面板III的下半部分。免疫反应产物标记在右侧；分子尺寸标准的位置如左图所示。
基于3A的疏水性，对于脊髓灰质炎病毒和甲型肝炎病毒来说，3A作为蛋白3AB的一部分，可能作为复制引物3B的膜锚，从而作为复制复合物的膜锚(25,34). 为了评估较大的含3A的多肽是否在疏水性方面也与缺乏3A的肽不同，从而在可能的细胞质定位方面也不同，测定了P3及其裂解产物F的溶解度。3C和3BC可溶于磷酸盐缓冲盐水，而P3和3ABC只能在洗涤剂（例如1%Triton X-100）存在下溶解。基于这些观察结果和各种切割模式的比较，人们很容易推测含有3A的蛋白质可能折叠不同或定位在不同的细胞质位点，从而经历不同的加工途径。由于缺乏3A的前体不会产生成熟蛋白酶，因此可以得出结论，成熟3C赞成的意见主要是从3ABC中解放出来的，3ABC来源于P3。
除了在其他重组系统中观察到的裂解产物(12,13,21,29–31)现在，发现了比3ABC、3BC和3C迁移更慢的其他蛋白带，并通过其免疫反应性和电泳迁移率鉴定为蛋白3ABCΔD、3CΔD和3BCΔC（图。，车道7、8、10、11、14）。由于这些多肽仅在含有3D和蛋白水解活性蛋白酶的前体产物中检测到（未显示非活性前体的数据），因此3ABCΔD、3CΔD和3BCΔD可通过3C介导的加工在另一3C/3D切割位点（V/S）形成将15个氨基酸残基C末端定位到前面描述的Q/R-键(31). 注意，该多肽的Δ3D含量无法通过抗3D检测到，而抗3D是针对3D的C末端部分提出的(31). 令人惊讶的是，替代3C/3D位点的裂解效率与前体3CD和3BCD中的Q/R位点一样高，这表明在这些缺乏3A的前体中，两个裂解位点都可以被蛋白酶的活性位点所利用（通道10和11）。甲型肝炎病毒3CΔD可能与3C′类似，3C′是3C的一种C末端延伸形式，已被报道用于肠道病毒、人鼻病毒和口疮病毒(28). 在脊髓灰质炎病毒中，蛋白3CD是一种显著且稳定的中间产物，3CD的选择性切割是由释放3C′和3D′的蛋白酶2A介导的(18). 综上所述，这些结果首次表明，跨越3C/3D位点且缺乏3A的蛋白水解活性前体可以在另一个位点被裂解。未来的实验应通过测试携带突变的选择性切割位点的甲型肝炎病毒突变体的体内和体外生存能力来解决额外甲型肝炎疫苗P3衍生多肽的潜在作用。
作为衍生自P3和3ABC的另一种新产物，检测到3BC有两种形式，它们稍微分开迁移，并通过与抗3C的免疫反应进行鉴定（泳道8和9）。在3BCD和3BC的抗3C反应产物（11和12道）和P3和3ABC的抗3B反应产物（5和6道）中只检测到少量快速迁移的3BC。抗3B抗体的免疫反应性降低（与第5和第8车道或第6和第9车道相比）表明，3BC的快速迁移形式可能在其N末端被截断。此外，抗3B和抗3C血清（通道5、6、8和9）检测到约40kDa的多肽（图中标记为°）。由于在P3和3ABC衍生的产物中发现了这种多肽的蛋白水解活性和非活性形式（后者未显示），3ABC°很可能是3ABC翻译后修饰的产物。我们对真核细胞中重组表达获得的P3处理的详细分析结果表明，除了主要产物3ABC、3BC和3C外，其他多肽是通过修饰或在另一个3C/3D位点裂解形成的。数据清楚地表明，P3内的3C裂解效率取决于3C游离区的存在，尤其是3A。
通过比较P3及其潜在的含3C中间体的加工产物数量，估计了P3位点的相对可切割性。图中描述了在所有测试前体的背景下裂开（编号为1至4）的流行情况。，其中棒的厚度与解理效率成比例。从产物带的强度来看，特别是从图2III所示的产物带强度来看，很明显，P3内位点的3C介导解理受到3C解理区域的影响。在3BC中，3C仅由3B侧翼，3C的N末端（位点2）的裂解相对无效，而3CD中位点3和4的加工产生了大量成熟3C和3CΔD。在多肽3BCD中，3C两端（位置2、3和4）的裂解程度与仅在3C的一个末端发生裂解时观察到的情况相似（参见3CD和3BC）。3C末端的自身蛋白水解赞成的意见讨论了HAV 3C的晶体结构赞成的意见已解决(三). 基于3C末端区域的灵活性，有人认为3B/3C位点的加工可能是分子内的，而不是3C/3D位点的加工。由于这里使用的表达系统不允许分子内和分子间裂解反应之间的直接区分，因此我们的数据既不支持也不否定这一假设。在含有3A部分的3C前体中观察到P3位点的相对裂解性发生了变化。虽然3号位点的解理仍然是P3中最突出的，但随后处理连接1和连接2释放3AB、3C和3BC的可能性同样大。位置3C/3D（编号3）处的裂解，然后是3A/3B（编号1）和3B/3C（编号2），可能代表了允许生产稳定P3中间产物3BC和3ABC的主要加工途径。这些加工中间体的稳定性可能意味着它们除了是成熟蛋白酶的来源外，还在病毒的生命周期中发挥作用。事实上，我们已经证明3ABC与HAV RNA紧密结合，其积累可能是其在RNA复制中发挥作用的先决条件(17). 含有3D N末端序列的多肽（例如，3BCΔD和3CΔD）主要来自缺乏3A的前体（3BCD和3CD）。由于在P3的加工产物中也检测到了这些多肽，因此可以将其视为一种小加工途径的产物，这种小加工途径确实发生在一个低但显著的水平上。不幸的是，由于感染细胞中HAV表达水平低(10)，次要加工中间体在甲肝病毒复制中的作用将很难阐明。在最初尝试直接评估P3在病毒生命周期的一个步骤中的功能时，我们现在描述了表明P3中间产物可能影响甲型肝炎病毒颗粒形成的实验。
P3及其蛋白水解中间产物内裂解的层次结构。基于图中所示的产品条带强度。估计了3A/3B（1号）、3B/3C（2号）、规则（3号）和替代3C/3D（4号）位点中各种含3C前体多肽的裂解程度，并用棒材的厚度表示。粗条代表有效解理，而细条代表低效加工。位点1、2和3的裂解是主要加工途径的一部分。替代3C/3D位置（编号4）的裂解最初是根据3BCD和3CD的产品模式推导出来的，其中包括大量3CΔD。P3衍生产物中还发现3CΔD，因此，位点4的裂解与位点1和2的裂解可能是甲型肝炎P3的次要加工途径。
HAV P3中间多肽对病毒颗粒形成的影响。
正如其他地方报道的那样，P1-2A是高效组装空甲肝病毒颗粒所需的前体多肽，用作P3及其含3C产物的底物顺式和中反式(1,4,27). 在P1-2A与3C的各种前体共表达后，分析了病毒结构蛋白的释放以及颗粒病毒抗原的组装。这里我们表明，无论用于与P1-2A共表达的P3衍生物（在反式)结构蛋白的总体模式与用抗VP0和抗VP1的免疫印迹分析所证明的模式基本相同（图。). 所有提取物中均检测到P1-2A、P1、VP3-VP1-2A、VP3-VP1、VPO-VP3、VP1-2 A、VP1和VPO。当使用3CD和3BCD（裂解物H和I）作为病毒蛋白酶的来源时，发现产物的比例较高，这一观察目前无法解释。如前所述，VP1的两种免疫反应形式是3C的产物赞成的意见-VP1/2A切割位点的介导切割(26). 当使用抗VP4来区分VP0和VP2时，未观察到VP0分裂为VP2和VP4（数据未显示）。
甲型肝炎病毒P1-2A与P3及其蛋白水解活性衍生物短暂共表达后的免疫印迹分析。对转染右侧所列蛋白质编码cDNA的细胞提取物（裂解物F至M）的P1-2A处理模式进行分析（另见图2III）。在同一凝胶上电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上后，用底部显示的抗血清对重组蛋白进行免疫学检测。免疫反应产物标记在侧面；分子尺寸标准的位置如左图所示。
为了确定相同提取物中病毒颗粒的形成，我们使用单克隆抗体K2-4F2进行了一种微粒特异性ELISA，该单克隆抗体专门检测14-S五聚体和高阶结构上的中和表位(19,24). 令人惊讶的是，甲型肝炎病毒颗粒形成的程度与P1-2A的表达率和处理模式显著相反。尽管P3及其中间产物的作用释放了相似比例的成熟结构蛋白，但颗粒形成的效率取决于3C包被多肽的存在。如颗粒特异性ELISA所示，整个P3蛋白在形成空病毒颗粒（约70 S沉淀）方面最有效（图。A） 以及通过5%至30%（wt/wt）蔗糖梯度沉淀后，显示出与之前报告的沉积剖面相似的沉积剖面（图。C）(33,36). P3中3D的缺失导致K2-4F2活性抗原性降低三分之一，而3A或3AB的缺失将抗原性降低到整个P3编码区的约四分之一（100%）。使用3C或3BC，相对于3CD或3BCD，观察到粒子形成进一步显著减少。测试3ABC和3CD的功能是否可以在反式，这两种蛋白均与P1-2A共表达。与单独使用3ABC相比，颗粒形成效率没有提高，这表明P3加工的一些替代中间产物或所有P3蛋白都需要顺式以实现高效组装。表达P3及其蛋白水解活性衍生物的细胞提取物或单独的P1-2A均未与单克隆抗体反应，表明其对加工和组装的病毒颗粒具有特异性。由于3C介导的P1-2A加工程度与颗粒形成无关，因此3C包被蛋白在病毒粒子组装中起着重要作用。
重组表达P1-2A后HAV颗粒的形成反式或顺式P3及其删除的表单。如左图所示，对转染cDNA构建物并感染vTF7-3的细胞提取物进行K2-4F2反应性分析。单克隆抗体K2-4F2专门检测甲型肝炎病毒中和表位，该表位仅暴露于病毒颗粒上。重组体显示出相对免疫反应性反式（A） 和顺式（B） 表达。A组P1-2A和P3共存细胞的反应性为100%；在B组中，P1-P2-P3表达细胞的反应性为100%。面板A中使用的提取物与图中所示的提取物相对应。和作为阴性对照，使用表达P1-2A、P3及其衍生物的细胞提取物；他们的平均值被设置为零。灰色区域表示阴性对照的标准偏差。在C组中，P1-2A和P3共表达后形成的颗粒在蔗糖梯度（5到30%蔗糖[wt/wt]）上分离，并通过其与单克隆抗体K2-4F2的反应性在单个组分中检测到。从平行梯度获得沉淀标准，在该平行梯度上分离来自感染细胞的HAV颗粒。
为了测试3C-flanking区域在完整开放阅读框架中的作用，我们比较了来自完整基因组的多聚蛋白与来自3AB和3D中删除的结构体的多聚蛋白质的甲肝抗原产生和处理。为此，借助vTF7-3表达P1-P2-P3、P1-P2-3CD和P1-P2-3ACDΔ。与单独表达P3相比，表达完整HAV基因组时，P3蛋白的总产量更低。3AB的缺失和3D的部分缺失均不影响多聚蛋白的整体加工。发现2C-3C不是3ABC和3BC，而是P1-P2-3CD的主要加工产物，并且从P1-P2-3ACDΔ生成截断的3D（数据未显示）。与P1-P2-P3相比，P1-P2-3ACDΔ和P1-P2-3CD的K2-4F2反应抗原性相对量分别约为70%和30%（图。B） ●●●●。可能由于启动子活性的差异顺式（图。B） 比在反式表达实验（图。A） ●●●●。这些结果与P1-2A和P3衍生片段在反式并直接证实了我们的结论，即3A和3D似乎是形成由P3和P1-2A蛋白质组成的加工组装复合物所必需的。有趣的是，最近发现各种非结构蛋白（例如2C和3D）附着在口蹄疫病毒和脊髓灰质炎病毒的纯化颗粒上(22). 如上所述，含有3A和3D的多肽存在于P1-2A也被发现的非细胞溶性细胞组分中（数据未显示）。因此，P3上下文中的3A和/或3D可能是必需的，以使蛋白水解活性与其底物共定位。P3的某些部分在进一步加工成由VP0、VP3和VP1-2A各五个分子组成的14-S结构之前，也有可能以类似伴侣的方式促进13-S五聚体的组装(4). 这里的结果清楚地表明，P1-2A和P3的共表达足以且最适合高效生产用于疫苗和诊断应用的甲型肝炎病毒空粒子。
