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《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7992–8001.
数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.7992-8001.1998年
预防性维修识别码：PMC110135型
PMID：9733838

保持病毒表面蛋白构象和功能完整性灭活人免疫缺陷病毒1型感染性

J.L.罗西奥,1 M.T.埃塞尔,1 K.Suryanarayana公司,1 D.K.施耐德,1 J.W.Bess，Jr.小。,2 G.M.瓦斯奎兹,1 T.A.威尔特罗,1 E.切尔托娃,三 M.K.格里姆斯,2 Q.萨坦托,4 L.O.亚瑟,2 L.E.亨德森,三和J.D.利夫森1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

整体灭活病毒颗粒已成功用作某些病毒的疫苗，但历史上用于灭活的程序可能会使病毒蛋白变性。结果并不一致，在接种疫苗后的一些显著例子中，疾病得到了增强，而不是得到了保护。我们使用化合物2，2′-二硫代二吡啶（aldrithiol-2；AT-2）共价修饰人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）或猴免疫缺陷病毒（SIV）病毒核衣壳（NC）蛋白中的必需锌指，从而灭活感染性。灭活病毒在体外没有检测到感染性（灭活达5 log单位）。然而，与传统方法（如加热或福尔马林处理）灭活的病毒相比，病毒和宿主细胞衍生的病毒表面蛋白质保持了构象和功能的完整性。因此，即使使用gp120上构象决定簇的抗体，AT-2处理的病毒的免疫沉淀与匹配的未处理病毒的沉淀也相当。与CD4结合的AT-2灭活病毒+靶细胞和介导的病毒诱导的CD4依赖的“无融合”与天然病毒相似。然而，病毒进入试验表明，AT-2处理的病毒的病毒生命周期在启动逆转录之前被阻止。AT-2处理的病毒表面上的主要组织相容性复合体（MHC）II类分子由MHC II类表达细胞产生，保留了通过静止T淋巴细胞支持II类依赖、超抗原触发的增殖反应的能力。这些发现表明，通过这种方法进行灭活，可以通过保持病毒表面蛋白质的构象和功能完整性来消除感染性，包括病毒编码的决定簇和来自产生病毒的宿主细胞的蛋白质。这种灭活的病毒粒子应该提供一种有前途的候选疫苗抗原和一种有用的试剂，用于实验探索病毒粒子表面蛋白在HIV-1发病机制的间接机制中的假定参与。

所有慢病毒和癌病毒的核衣壳（NC）蛋白都含有锌指基序，这是逆转录病毒序列中最保守的元件之一(6,27). 利用几种不同的逆转录病毒系统进行的定点突变研究的累积结果表明，NC蛋白在病毒生命周期的多个不同但重要的方面都有牵连。破坏NC蛋白锌指协调锌的能力的突变导致一种表型，其特征是病毒基因组RNA在病毒粒子中的包装严重受损(11,26,50). 更微妙的突变，其中NC蛋白的锌配位能力被保留，但序列被改变，以与野生型病毒相当的水平包装病毒基因组RNA，但由此产生的病毒不能产生感染，感染性映射到病毒生命周期关键预整合步骤的缺陷(第26页).

NC蛋白在病毒生命周期中的多个关键步骤中起着关键作用，并且NC蛋白中逆转录病毒锌指基序的高度保守性使其成为抗逆转录病毒药物开发的一个诱人目标(48,50,51). 事实上，已经确定了一些化合物，它们通过各种不同的机制对NC锌指进行共价修饰，导致协同锌的排出和感染性的丧失(38,48,51,63,64). 尽管这些化合物的详细作用机制不同，但其共同的作用机制特征包括对组成NC蛋白锌指的残基中锌配位半胱氨酸硫的优先化学攻击(38). 根据这一机制，应该可以确定能够从锌指中排出锌的化合物，但不应影响半胱氨酸残基已经参与二硫键连接的蛋白质（例如病毒包膜糖蛋白）。

这种失活模式可能具有一定的优势，因为可以保持病毒表面蛋白质的构象完整性。从开发一种潜在改良的灭活全颗粒疫苗免疫原和研究构象完整但非感染性病毒的功能和免疫致病特性的双重角度来看，这将很有意义。

病毒表面蛋白既包括病毒编码蛋白，也包括通过产生病毒的宿主细胞出芽而非随机获得的蛋白(2,43). 病毒表面的病毒蛋白，如包膜糖蛋白，对结合和进入靶细胞至关重要，也可以作为宿主免疫反应的靶点(40,55). 病毒蛋白也与各种免疫致病机制有关，例如在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染中诱导无能或凋亡(1,31,58)以及其他病毒感染(29). HIV-1病毒表面的宿主细胞衍生蛋白包括主要组织相容性复合体（MHC）II类分子，尤其是HLA-DR(2,43). 这些蛋白已被证明能够诱导保护性免疫，以对抗在人体细胞中繁殖的猴免疫缺陷病毒（SIV）的体内挑战(三,12). As细胞表面分子在免疫调节性细胞识别事件中的生理作用(21,22,25)MHC II类蛋白在病毒表面显示时也可能具有介导免疫致病作用的潜力。

在本研究中，我们使用典型的NC锌指靶向化合物2,2′-二硫代二吡啶（醛固酮-2[AT-2]）检测了其传染性被消除的HIV-1病毒。我们的分析侧重于评估病毒表面蛋白的构象和功能完整性的分析，比较AT-2灭活病毒与天然病毒以及通过经典方法（如热处理或甲醛固定）灭活的病毒。我们的研究结果表明，经AT-2处理的病毒表面蛋白构象和功能完整，但病毒粒子没有感染性，感染性阻滞发生在病毒粒子结合和膜融合后，但发生在反转录之前。

材料和方法

病毒。

艾滋病病毒1型明尼苏达州/H9克隆4和HIV-1拉丁美洲国际/如前所述，H9在H9细胞中繁殖(44). SIVmne是从克隆的E11S细胞系的上清液中获得的，该细胞系来自感染SIVmne的HuT-78细胞的培养物(5,24). 如有说明，浓缩病毒制剂是在连续流动离心机中通过蔗糖梯度分带制备的(7). 从HIV-1感染者的外周血单个核细胞（PBMC）与植物血凝素（PHA-M）激活（PHA-M[GIBCO，Grand Island，N.Y.]；1:100持续72小时）、IL-2支持（20 U/ml）的PBMC的短期共培养中获得HIV-1原发分离物92US727和91US054。所有病毒储存在−70°C或汽相液氮中，直到使用。用作对照试剂的微泡是从未感染H9细胞培养物的上清液中分离出来的，分离方法与从感染细胞中制备病毒所用的方法相同(7).

病毒滴度测定。

病毒滴度的测定基本上如前所述(39)，含H9细胞，AA2细胞(10,62)或PHA刺激的人类PBMC爆炸（72小时），如图所示，添加或不添加Polybrene（密苏里州圣路易斯Sigma）。简言之，2×106用每种天然或灭活（见下文）病毒库存的连续10倍稀释液接种1ml体积的指示细胞，并培养过夜（14-16h）。洗涤后，接种的细胞在105细胞置于250μl的96周培养板中，每稀释或处理16次重复。细胞在含有10%热灭活胎牛血清和2 mM的RPMI 1640中培养我-谷氨酰胺（完全培养基）；每周更换两次100μl培养基。PBMC母细胞培养物还补充了每毫升20 IU的白细胞介素-2。接种后第10天，采集上清液并检测p24加利福尼亚州通过捕获酶联免疫吸附试验（美国国家癌症研究所艾滋病疫苗项目-马里兰州弗雷德里克癌症研究与发展中心[NCI-FCRDC]）将含量作为生产性感染的指标。为了测定SIV滴度，将四份连续稀释的病毒接种到AA2克隆5细胞上，并对培养物进行21天的监测，每两周更换一次培养基。监测培养上清液中的p28加利福尼亚州.每毫升含有大于100 pg p24或300 pg p28的微孔加利福尼亚州每毫升被评为阳性，50%的组织培养感染剂量（TCID50)采用Reed和Muench方法计算(47).

病毒灭活程序。

在所有程序中，冷冻病毒储存在37°C的水浴中快速解冻。在56°C的水浴中加热灭活2 h，并频繁混合。然后将病毒置于冰上，直到使用（2小时内）。如前所述进行甲醛灭活(46). 简单地说，用1:80的福尔马林缓冲溶液（1:2000甲醛；西格玛，密苏里州圣路易斯）在37°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中处理病毒制剂24小时。然后在PBS中用2%亚硫酸氢钠中和福尔马林。为了用AT-2灭活，制备AT-2储备液（100 mM二甲基亚砜[威斯康星州密尔沃基奥尔德里奇]），并直接添加到病毒中，以产生所需的AT-2浓度。病毒制剂在37°C下处理1小时，然后放在冰上直到使用（2小时内）。在灭活程序结束时，使用500-kDa截止值的离心过滤装置通过超滤去除处理剂（Centriprep 500；Amicon，Beverly，Mass.）。在4°C下进行过滤，使化学灭活剂的浓度至少降低1:375。对照病毒制剂与灭活样品平行进行假处理和处理。

蛋白质印迹分析。

艾滋病病毒1型明尼苏达州用AT-2或如上所述加热处理。样品在17000×克（4°C）使病毒颗粒化。电泳样品分别在还原和非还原条件下在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（4至20%梯度）凝胶（NOVEX，加州圣地亚哥）上进行。将蛋白质转移到聚二氟乙烯膜上，用0.5%（wt/vol）Ponceau S染色，并用针对纯化病毒NC和增强化学发光试剂（Amersham，Arlington，Ill.）制备的单特异性多价山羊抗血清通过免疫印迹分析检测。

细胞系。

H9、A3.01和Sup-T1细胞系来自美国国家变态反应和传染病研究所艾滋病研究和参考试剂项目（马里兰州罗克维尔）。AA2细胞系(62)由R.Benveniste（NCI-FCRDC）提供。所有细胞系均为支原体阴性（PCR支原体检测试剂盒；美国型培养物收集中心，马里兰州Rockville），并在完全培养基（RPMI 1640，10%热灭活胎牛血清，2 mM）中培养我-谷氨酰胺、100 U青霉素G/ml、100μG硫酸链霉素/ml）。

抗体试剂。

前面已经描述了针对人MHCⅠ类和Ⅱ类的多克隆羊抗体的产生和表征，以及针对H9细胞培养物制备的微泡的多克隆山羊抗体(2,7). 小鼠单克隆抗体48d（也被列为4.8D）(59)中和单克隆抗体IgG1b12(32,60)，均针对gp120上的构象决定簇，从艾滋病研究和参考试剂计划（马里兰州罗克维尔）获得。

原电池。

PBMC通过密度离心（Ficoll-Hypaque；Sigma）从马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（National Institutes of Health，Bethesda，Md.）或NCI-FCRDC的健康HIV-1血清阴性供体的白细胞中分离。

全颗粒免疫沉淀分析。

如前所述进行全身免疫沉淀分析(2). 简而言之，将可比较输入量的天然或灭活病毒制剂与每种抗体制剂（或PBS）的经验优化浓度在37°C下培养1小时，然后在4°C下过夜，摇晃。福尔马林固定金黄色葡萄球菌然后添加Cowan株（GIBCO），在20°C培养30分钟后，通过离心（2000×克30分钟）。为了计算病毒颗粒的清除率，用p24捕获免疫分析法测定免疫沉淀后上清液中的残余病毒含量，并与用PBS代替抗体进行相同沉淀后的相同病毒制剂的p24含量进行比较。本试验中特定抗体的清除表明病毒表面存在与该抗体呈免疫反应的完整抗原(2). 为了进行比较，通过考虑每种抗体对自然病毒沉淀所达到的最大清除量为100%相对清除率，对数据进行了标准化。每种抗体对灭活病毒制剂的相对清除率是通过将清除程度与该100%值进行比较来确定的。天然病毒的最大绝对清除值从90%（抗H9抗体）到35%（48天抗体）不等。

病毒结合试验。

免疫荧光流式细胞术全颗粒病毒结合分析是通过修改先前报告的分析格式进行的(56,65). A3.01细胞系表达CD4和CXCR4，但不表达HLA-DR。在表达HLA-DR的细胞中繁殖的病毒将宿主细胞衍生的HLA-DR结合到病毒包膜中(7). 因此，A3.01细胞与含HLA-DR的病毒粒子孵育后获得HLA-DR反应性可作为病毒粒子结合的标准。

简单地说，A3.01电池（2×105在4°C下用染色缓冲液（不含钙和镁的PBS，含1%[wt/vol]牛血清白蛋白）或未标记的抗Leu 3a（5μg/ml[Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose]）预培养30分钟，然后清洗一次。然后将细胞与100μl染色缓冲液或天然或灭活病毒制剂在37°C下孵育30分钟，并清洗两次。用抗HLA-DR（藻红蛋白结合）和CD4（抗Leu 3a，异硫氰酸荧光素结合）和OKT4（异硫氰酸酸荧光素连接）的荧光结合单克隆抗体进行免疫荧光染色（4°C持续30分钟）通过使用与适当的荧光色素结合的具有不相关特异性的同型匹配单克隆抗体测量非特异性抗体结合（除OKT4外的所有Becton-Dickinson免疫细胞系统抗体[新泽西州Raritan Ortho Diagnostics]）。抗体染色后，将细胞清洗三次，并在4°C的1%多聚甲醛中固定30分钟，然后使用带有Cell Quest软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）的FACScan流式细胞仪进行分析。

从无融合。

为了测试经AT-2处理的病毒介导CD4依赖性、HIV-1包膜糖蛋白介导的“无融合”的能力(15,28)，我们培养Sup T1细胞（105细胞/孔/50μl，置于96个平底板中），对HIV-1诱导的细胞融合高度敏感，在37°C下与HIV-1或at-2灭活HIV-1（HIV-1明尼苏达州/H9克隆4；50μl/孔）。添加病毒后1至3小时，通过倒置相控显微镜评估特征合胞体的存在。此时出现的合胞体是由于来自外部的融合（也就是说，由于输入的病毒接种物），因为感染时间不足以导致包膜糖蛋白的细胞表面表达并产生合胞体（来自内部的融合）。在加入病毒之前，用抗Leu 3a（25μg/ml）的靶细胞预孵育30分钟，以测定融合的CD4依赖性。

病毒进入试验。

为了确定灭活病毒制剂的感染性被抑制的病毒生命周期阶段，我们进行了病毒进入试验，在该试验中，通过实时PCR试验对逆转录病毒DNA物种进行定量。简单地说，来自HIV-1血清阴性供体的PHA活化、白细胞介素2支持的PBMC接种天然或灭活病毒（1600 TCID50，9000 pg HIV-1 p24/2.5×106单元格）。清洗后，接种细胞在完全培养基中培养，并在接种后24和48小时收获等分样品。平行对照培养物用齐多夫定（AZT；20μM）和ddI（20μM）处理，接种前靶细胞预处理2小时；在培养期间存在化合物。收获后，将洗涤的干细胞颗粒在−70°C下冷冻保存，直到用于处理和分析。

裂解颗粒，并按照制造商的建议用商业试剂（PureGene试剂盒；Gentra Systems，Minneapolis，MN）提取总DNA。在ABI Prism 7700序列检测系统上，通过实时PCR检测定量HIV-1强链DNA（指示逆转录启动）和HIV-1 gag DNA（指示第一链DNA合成完成）。本工具的基本原理和操作在其他地方进行了详细审查(26美分,36,57年). 对于当前的分析(57亿)，使用以下试剂组：强终止，正向引物，5′-GGT CTC TCT GGT TAG ACC A-3′（455～473）；反向引物5′-CAC ACT GAC TAA AAG GGT CTG-3′（593～573）；探针，5′-（R）TAG TGT GTG CCC GTC TGT TGT GTG-ACT（Q）-3′（554至580）；Gag，正向引物，5′-GiC ATC AiG CAG CCA TGC AAA T-3′（1366至1387）；反向引物，5′-CAT iCT ATT TGT TCi TGA AGG GTA CTA G-3′（1507至1480，其中i表示插入肌苷残基，以避免基于序列错配位置处的序列错配而产生的扩增偏差，该位置在已测序的HIV-1分离物中记录了错配[45a]）；探针，5′-（R）TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG AT（Q）-3′（1402至1427）（基于HIV-1分离株HXB2的参考序列[GenBank登录号。K03455号])，其中R表示报告荧光染料（6-羧基荧光素），Q表示通过连接臂核苷酸偶联的猝灭染料6-羧基四甲基罗丹明（LAN[36]). （HIV-1 gag和强效DNA的荧光探针来自加利福尼亚州圣地亚哥的DNA科学公司。）此外，还分析了每个样本的卟啉原脱氨酶（PBGD）编码区唯一序列的拷贝数(第14页,26b个)使用从Perkin-Elmer（加利福尼亚州福斯特市）应用生物系统部门购买的荧光探针。由于该序列存在于每个二倍体细胞的两个拷贝中，并且没有假基因序列，因此对给定样本中该序列的定量分析提供了一种内部控制，从而使HIV序列相对于样本中DNA的二倍体基因组当量数目的标准化。HIV-1 gag、strong-stop和PBGD DNA的实时PCR检测的平均分析间变异系数<15%，每个反应的标称阈值灵敏度为3个DNA拷贝当量。

静息T淋巴细胞的MHCⅡ类依赖性超抗原刺激增殖。

超抗原通过依赖于MHC II类分子向T细胞受体复合体提供超抗原的机制触发T淋巴细胞的多克隆增殖(13,35). 我们之前已经证明，纳入由MHCⅡ类表达细胞产生的HIV-1病毒中的MHCⅡ级分子能够提供必要的MHC II类蛋白来支持这种作用(53). 因此，我们对天然病毒和通过不同方法灭活的匹配病毒制剂支持超抗原触发增殖的能力进行了比较评估。通过密度离心法从白斑中分离出PBMC。通过两轮塑料粘附（37°C 1小时和一夜）去除单核细胞，并分别回收。按照制造商的建议，通过T细胞富集柱（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）将非粘附细胞传代制备静止T淋巴细胞。为了确保细胞在功能检测开始时未被激活，在使用前将从T细胞制备柱中回收的T淋巴细胞在不含激活剂的完整培养基中培养48小时。

为了测量超抗原触发的增殖反应，将静止的T细胞接种在96周的培养板中，培养温度为5×104每孔细胞数（每种情况下为三个孔），单独培养或在培养基中加入各种添加剂培养3天，并用[三H] 胸腺嘧啶（1μCi/孔；比活性，6.8Ci/mmol[NEN生命科学，波士顿，马萨诸塞州]）。收集细胞[三H] 通过液体闪烁计数（LKB Microbeta；LKB，马里兰州Rockville）测量胸腺嘧啶掺入量作为增殖指数。培养条件包括T细胞单独培养、T细胞加自体粘附细胞、T细胞加超抗原（葡萄球菌肠毒素A，100 ng/ml[Sigma]）、T细胞+自体粘附细胞加超抗原，T细胞加天然或灭活病毒，以及T细胞加自然或灭活的病毒加超抗原。

结果

评估了AT-2对HIV-1感染性的灭活效果，并评估了灭活后病毒表面结构的形态和功能保存。AT-2治疗消除了HIV-1的传染性，这是通过治疗后的病毒不能在体外高度允许的AA-2细胞、H9细胞或PHA治疗的人类淋巴母细胞中复制来测量的。如表所示​表1，1热处理、甲醛处理和AT-2处理完全灭活了所测试的病毒库存，提供了3到4 log单位的灭活。在其他实验中，AT-2处理证明灭活超过5个对数单位，处理浓度大于100μM时，可完全灭活表中总结的研究中测试的所有病毒库​表1，1，包括多种不同的HIV-1病毒分离株，以及从T细胞系和原代PBMC产生的病毒。由于AT-2靶向的结构在所有慢病毒中都是保守的，我们也能够评估AT-2对SIV传染性的失活。AT-2治疗后，即使在纯化和1000倍浓度的灭活病毒后，仍无法检测到SIV的残余感染性（表​（表1）。1). 在不同感染性的病毒库存的单独剂量效应实验中，当at-2剂量大于300μM时，HIV-1完全灭活，而当at-2约为30μM时减少50%（表​（表2）。2).

表1

通过AT-2、加热或福尔马林处理灭活HIV-1和SIV

病毒库存Concon公司p24/p28的数量GAG公司（微微克/毫升）目标单元格一感染性滴度（TCID50)b条灭活后：
无失活AT-2型
福尔马林热量
1000微米250微米100微米
艾滋病病毒1型3B公司1倍1.7 × 105AA2型2.1 × 1040-c（c）1500
艾滋病病毒1型3B公司1倍1.7 × 105H9型6.6 × 10三0-
艾滋病病毒1型明尼苏达州1倍8.9 × 105H9型4.3 × 10三0-000
艾滋病病毒1型明尼苏达州1倍8.9 × 105H9型4.3 × 10三0-6300
艾滋病病毒1型明尼苏达州1倍8.9 × 105AA2型5.1 × 1040-0--
艾滋病病毒1型明尼苏达州1倍8.9 × 105AA2型2.1 × 1050-0--
艾滋病病毒1型91美元0541倍3.3 × 104PHAB公司5.6 × 10三-0271--
艾滋病病毒1型92美元6571倍2.2 × 104PHAB公司4.2 × 10三-00--
小分子病毒MNE公司，第3612页1倍--3.2 × 105-----
小分子病毒MNE公司，第3612页1000倍9.9 × 107AA2型3.2 × 108-----
SIV公司MNE公司，第3611页1000倍3.1 × 107AA2型-0----
一根据材料和方法中的说明，使用H9细胞、AA2细胞或PHA母细胞（PHAB）获得滴定度。 
b条TCID公司50表示可检测p24的病毒存量的计算倒数稀释加利福尼亚州10天后，在16个重复培养物中，50%的培养物中产生（>100pg/ml）。显示了各种HIV-1库存的代表性结果，包括长期实验室维护的分离株HIV3B公司和HIV明尼苏达州在H9细胞和原分离株91US054（302054）和92US657（301657）中繁殖，在PBMC和SIV中繁殖MNE公司，来自SIVMNE公司/HuT-78克隆E11S细胞。使用这些病毒库存，用浓度超过100μM的AT-2处理可完全灭活。在10多项独立实验中，1000μM AT-2治疗消除了所有可检测到的传染性。还显示了连续两次大规模SIV制剂（30升）的滴度MNE公司，克隆E11S，用于生化研究(第7页). SIV在浓缩前用AT-2处理。 
c（c）-，未测试。 

表2

AT-2处理浓度对HIV-1的影响明尼苏达州一

AT-2浓度（μM）TCID公司50b条
04,500
103,200
302,200
100770
3000
1,0000
一天然HIV-1病毒粒子制剂（HIV-1明尼苏达州（每毫升892987 pg的p24）和用不同浓度的AT-2处理的制剂按照材料和方法中的描述在AA2细胞上进行滴度测定。 
b条显示了治疗后的残余感染性，表明治疗浓度>300μM时完全灭活，约30μM时减少50%。 

AT-2灭活HIV-1的机制可能是通过共价修饰HIV-1 NC（p7）蛋白中的锌指，并将配位锌排出体外2+导致病毒复制的多方面中断(38). 图中的蛋白质印迹分析。​图11显示p7数控AT-2处理的HIV-1中的蛋白质被修饰，使其不会迁移到凝胶电泳上的预期位置，其他研究表明AT-2介导的p7交联成高分子量聚集体（数据未显示）。在样品缓冲液中用3%的2-巯基乙醇完全化学还原病毒提取物，导致p7再次出现数控正确分子量的带（图。​（图1）。1). 在56°C下加热HIV-1 2 h不会影响p7的迁移数控尽管治疗后的病毒没有检测到传染性。

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AT-2治疗的HIV-1的Western blot分析。在非还原（左）或强还原（右）条件下，用AT-2（通道AT）或加热（56°C，持续2 h）（通道56）处理的HIV-1制剂和未处理的对照（通道C）在4~20%聚丙烯酰胺梯度凝胶中进行裂解和电泳。蛋白质被印迹，并用p7抗血清培养数控。左侧面板显示p7数控在AT-2处理的病毒中不迁移到其正常位置。在AT-2处理的病毒完全化学还原后（右侧面板），p7NC带重新出现。

为了评估经AT-2或其他方法灭活的非感染性病毒表面病毒和细胞蛋白的完整性，进行了全身免疫沉淀。所用抗体针对病毒表面的各种决定簇，包括线性和构象决定簇，以及病毒和宿主细胞衍生蛋白。如图所示。​图2A，2A、 AT-2失活病毒的免疫沉淀与所有检测抗体的天然病毒沉淀相当，包括与单克隆抗体48d的免疫沉淀相当，单克隆抗体可以识别gp120的构象决定因子(59). 图​图2B2B表明，通过使用IgG1b12（一种与构象决定簇反应的有效中和单克隆抗体），天然病毒和AT-2失活病毒的沉淀具有可比性(32,60). 与之形成鲜明对比的是，与天然病毒相比，甲醛活化病毒和热失活病毒的免疫沉淀都大大减少，包括48d单克隆抗体的最小免疫沉淀，证明在这些失活模式下，病毒上的构象抗原决定簇几乎完全变性或丢失（图。​（图2A）。2A） ●●●●。

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（A） HIV-1的全粒子免疫沉淀。艾滋病病毒1型明尼苏达州用细胞蛋白抗血清（HLA I类或II类）或病毒蛋白质抗血清（gp120、48d，识别构象敏感表位[59])或H9，一种针对H9细胞产生的微泡制剂的抗血清(7). 用于这些实验的所有灭活病毒制剂均未检测到传染性。结果显示，在两个单独的实验中，每种条件下的三次测定的平均值的平均值±1标准误差。（B） 未经治疗或AT-2灭活HIV-1的全粒子免疫沉淀明尼苏达州通过抗H9抗血清或单克隆抗体IgG1b12，一种有效中和gp120上构象决定簇的抗体(32,60). 结果显示，在四个单独的实验中，三次测定的平均值的平均值±1标准误差。

上述免疫沉淀研究的结果表明，AT-2灭活病毒的构象决定簇被保留，包括包膜糖蛋白gp120的决定簇。为了进一步研究包膜糖蛋白在AT-2灭活病毒上的功能是否完整，我们进行了基于流式细胞术的病毒离子结合分析。图​图3A三A显示，A3.01细胞系表达CD4，与抗Leu 3a和OKT4单克隆抗体反应，但不表达HLA-DR。将靶细胞与HLA-DR阳性H9细胞产生的天然病毒孵育后，细胞HLA-DR染色呈阳性，伴随着抗Leu 3a染色的减少，但OKT4染色没有改变，这与病毒与靶细胞的结合一致（图。​（图3B）。三B） ●●●●。HLA-DR染色反映了与靶细胞结合的病毒表面的MHC II类决定簇。Leu 3a决定簇的染色减少，因为该表位与HIV-1 gp120相互作用(4)而且由于病毒粒子的结合阻碍了抗体的获取。OKT4染色没有减少，因为CD4上的这个表位从gp120相互作用位点被充分去除。获得的HLA-DR染色不能归因于病毒制剂中含有HLA-DR微泡的靶细胞结合(7)，因为用高浓度纯化的微泡培养目标细胞，这些微泡来源于用于产生病毒的相同细胞的未感染培养物，因此培养目标细胞不会导致获得HLA-DR反应性（数据未显示）。在添加病毒粒子之前，用未标记的抗Leu 3a预孵育靶细胞抑制了HLA-DR染色的获得（图。​（图3C）。三C） ●●●●。并不是所有的结合都能被抗Leu 3a预处理所阻断，这可能反映了CD4依赖性结合(65). 然而，抗Leu 3a可阻断所有感染性（数据未显示）。对AT-2灭活病毒的类似研究表明，CD4依赖性结合与天然病毒相似（图。​（图3D三D和E）。相比之下，经热处理或甲醛处理灭活的病毒粒子的结合比天然病毒粒子明显减少（图。​（图3F）。三F） 。

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流式细胞术显示病毒结合。对于面板A至E，实线表示Leu 3a染色，虚线表示OKT4染色，虚行表示等型匹配的不相关特异性控制染色，阴影区域表示HLA-DR染色。每次分析中评估一万个细胞。（A） 在没有添加HIV-1病毒的情况下，A3.01细胞为CD4+（抗Leu 3a和OKT4染色）和HLA-DR−（B）将A3.01细胞与HLA-DR表达细胞产生的天然HIV-1孵育后，可获得HLA-DR染色，抗Leu 3a染色减少，但OKT4染色不减少，反映了病毒粒子的结合。（C） 在与HIV-1病毒粒子孵育之前，用未标记的抗Leu 3a预孵育A3.01细胞，随后的染色阻断了抗Leu 3a染色，并显著减少了病毒粒子的结合，反映为HLA-DR染色的获得减少。（D） 与经AT-2处理的HIV-1病毒孵育后获得的HLA-DR反应性和抗Leu 3a染色的丢失与天然病毒中的相似（与B组相比）。（E） 靶细胞与未标记的抗Leu 3a预培养抑制HLA-DR染色获得的能力反映了AT-2失活HIV-1病毒的结合是真实的（与C组相比）。（F） HLA-DR染色显示，AT-2失活的HIV-1病毒与天然病毒的结合类似，而福尔马林或热处理失活的病毒几乎没有抗Leu3a抑制结合。该图显示了在培养具有可比数量（p24）的靶细胞后HLA-DR染色的平均通道荧光加利福尼亚州内容）。结果代表了四种独立的分析。

为了评估结合的AT-2灭活病毒是否能够经历CD4结合后诱导的构象变化以及由此产生的膜融合事件，我们测试了这些病毒离子从非CD4结合中介导融合的能力(15). 如图所示。​图4，4然而，经AT-2治疗后呈非感染性的灭活病毒能够介导CD4依赖性融合，而无需与匹配的天然病毒制剂进行比较。

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HIV-1诱导无Sup T1细胞的融合。（A） 超T1细胞对CD4依赖性HIV-1包膜糖蛋白介导的细胞融合高度敏感。（B） 在与浓缩天然HIV-1孵育3小时后，可以看到特征性合胞体，这反映了病毒介导的融合。（C） 预先用抗Leu 3a的细胞培养可抑制由天然病毒介导的融合。（D） AT-2失活病毒介导来自没有可比性的天然病毒的融合。（E） 抗Leu 3a抑制AT-2失活病毒介导的融合。放大倍数，×200。

在证实了AT-2灭活病毒能够与靶细胞结合并经历与天然病毒相似的结合后构象变化和膜融合事件后，我们接下来使用病毒进入试验来测试病毒是否进入(57)脱膜、反转录正常。所使用的病毒进入试验基于HIV逆转录中间产物的定量实时PCR分析，并基于单拷贝基因组序列对结果进行标准化。每100000个二倍体基因组当量中HIV-1 gag DNA拷贝当量的定量显示，接种未经处理的病毒的培养物中定义的逆转录中间产物的时间依赖性积累（图。​（图5）。5). 用逆转录酶抑制剂AZT和ddI处理靶细胞，完全阻断gag DNA的积累。AT-2对消除传染性的病毒粒子的处理也阻止了gag DNA的合成。定量AZT-和ddI-抑制HIV-1强顶DNA序列合成的结果表明，与天然病毒相比，AT-2处理的病毒粒子的反转录起始也被阻断，这是因为考虑了可能反映体内内源性反转录的非抑制强顶DNA(61,66). 与接种天然病毒的AZT和ddI处理过的细胞一样，接种AT-2处理过的病毒的未处理细胞中未产生新的强效DNA（图。​（图5），5)这表明，尽管这种处理过的病毒与靶细胞的结合类似于天然病毒，并且可以介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，但在逆转录开始之前，病毒生命周期的进一步进展被阻断。

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暴露于天然和AT-2灭活HIV-1的细胞中的病毒DNA。将人3天PHA诱导的淋巴母细胞暴露于HIV-1，并在24和48小时收集细胞颗粒。从细胞颗粒中制备总DNA，并通过实时PCR检测反转录HIV-1 gag和强顶DNA。如文中所述，根据PBGD的DNA编码副本对结果进行了标准化。注意未经处理的对照组中gag和强链DNA的时间依赖性积累，以及AZT和ddI处理的培养物中gag DNA的缺失。AT-2治疗HIV-1可防止产生gag和strong-stop DNA。结果显示，在三个实验中的一个实验中，每个条件下的DNA拷贝数重复测定的平均值具有一致的结果。在一个单独的实验中，用亚最佳浓度的AT-2处理的病毒产生低水平的gag DNA，没有观察到生产性感染（数据未显示），这表明AT-2处理过的病毒可能也缺乏完成其他反转录后的能力，病毒生命周期的预整合步骤，其中p7数控已被牵连(第26页).

MHC II类依赖性、超抗原触发的静息T淋巴细胞增殖被测量为灭活病毒粒子上MHC II类决定簇功能完整性的反映。单独培养静止T细胞、静止T细胞加巨噬细胞或静止T细胞+超抗原均未显示有意义的增殖反应（图。​（图6）。6). 在这些条件下，HIV本身并没有诱导T细胞增殖，无论是以天然形式(53)或AT-2治疗后（数据未显示）。正如预期的那样，当在自体单核细胞/巨噬细胞存在下用超抗原培养静止T细胞以提供MHC II类来源时，观察到了强烈的增殖反应。在没有其他II类来源的情况下，天然病毒上存在的MHC II类足以支持静止T细胞的超抗原触发增殖。AT-2灭活的病毒与天然病毒相比，支持超抗原触发的增殖，而通过热处理或甲醛处理灭活的疫苗不能支持超抗原引发的增殖反应（图。​（图6）。6).

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超抗原诱导的T细胞增殖。根据以下测量结果，单独存在自体巨噬细胞或单独存在SEA的静止人外周血淋巴细胞不会增殖[三H] -在3天孵育的最后8小时内，胸腺嘧啶掺入（底部三个栏）。巨噬细胞上存在MHC II类的SEA暴露可诱导强烈增殖（顶栏）。由MHCⅡ类表达细胞产生的HIV-1在作为培养物中Ⅱ类唯一来源时能够支持超抗原触发的增殖反应，并且AT-2灭活病毒与未经处理的HIV-1一样活跃。福尔马林或热处理HIV-1使病毒不能支持超抗原诱导的增殖反应。显示了三个实验之一的代表性结果；每个条形代表三份培养物的平均值±1个平均值的标准误差。

讨论

全灭活病毒已成功用作多种病毒的疫苗(16,17,41,42,46)但传统的病毒灭活方法会使病毒表面蛋白变性。结果并不一致，例如灭活病毒疫苗既有有效的保护作用，又有疾病恶化(9,14,33). 福尔马林治疗在保存SIV抗原性方面表现不佳(18)与我们在本研究中的观察结果一致。以NC蛋白锌指为靶点的化合物介导的逆转录病毒失活的独特机制表明，这种方法可能是一种在保持病毒表面蛋白构象完整性的同时灭活感染性的手段。我们通过用原型锌指修饰化合物AT-2灭活HIV-1库存，并对天然病毒和AT-2灭活病毒以及用热或甲醛处理灭活的匹配病毒制剂进行比较测试，来验证这一假设。这些失活病毒的特征是使用一系列分析来探测病毒编码和宿主细胞衍生病毒表面蛋白的构象和功能完整性。

用100μM以上的AT-2处理完全灭活了所有检测的HIV-1病毒株的可检测传染性（超过5 log单位），包括在原代PBMC中繁殖的多个不同的原代分离物和适于T细胞系生长的分离物（表​（表1）。1). 还观察到SIV传染性的灭活（表​（表1）1) (第7页). 然而，与通过加热或甲醛处理灭活的病毒形成鲜明对比(18,54)AT-2处理保持了灭活HIV-1病毒表面蛋白的构象和功能完整性。因此，即使使用针对gp120上构象决定簇的单克隆抗体，AT-2失活病毒也能与天然病毒进行类似的免疫沉淀（图。​（图11和​和2）。2). AT-2失活病毒表面宿主细胞衍生蛋白的构象和功能完整性也得到了保留，这反映在静止T淋巴细胞支持MHCⅡ类依赖性超抗原触发的增殖的能力（图。​（图6）。6). AT-2失活病毒显示CD4依赖性结合靶细胞，与天然病毒相似（图。​（图3）。三). 处理后的病毒粒子能够介导膜融合（图。​（图4），4)尽管在逆转录开始之前感染性被阻断（图。​（图5）。5). 结合生化数据表明p7交联数控在经过治疗的病毒中(37)，这些结果与基于处理过的病毒粒子中NC蛋白交联的阻断一致，该阻断阻止了病毒粒子包膜与靶细胞质膜融合后的完全解开和逆转录的启动(57).

AT-2灭活病毒保持构象和功能完整性表明，这种病毒可能是一种有用的疫苗抗原。与包膜糖蛋白的单体形式相比，HIV-1包膜糖蛋白质的寡聚形式已被证明更有效地诱导抗体产生对广泛中和活性重要的构象决定簇(8,19,20,52). 非传染性但构象完整的完整病毒可能代表着这方面的进一步改进。这种病毒可能特别有用，因为它是涉及活载体（如减毒痘病毒）的“原始-原始”疫苗接种方案的增强成分(45)或在涉及DNA免疫的疫苗接种计划中(34). 使用由突变病毒株产生的灭活病毒粒子来提高免疫原性，特别是用于诱导中和抗体，可能会提供更大的效用(49).

这些观察的另一个潜在应用是在医院或研究实验室使用的患者血液样本中灭活HIV-1，从而减少与此类样本操作相关的感染危险。AT-2对血清化学分析和细胞代谢的影响正在研究中。由于这种灭活模式可以有效对抗核衣壳蛋白中含有锌指基序的所有逆转录病毒，因此也可能与增强生物制品的安全性有关，例如可能携带内源性逆转录病毒的细胞系产生的单克隆抗体。

AT-2失活产生的病毒粒子，由于其表面蛋白的构象和功能完整性，也可能为评估病毒粒子和病毒蛋白在HIV-1感染免疫发病机制中的潜在作用的研究提供有用的试剂，与生产性病毒感染的细胞病变或其他后果无关，包括CD4细胞耗竭的拟议“旁观者”机制(23,30). 假设HIV-1包膜糖蛋白参与诱导无能细胞或引发细胞继发凋亡细胞死亡，可能最好通过使用构象可靠但非感染性的病毒来探索。同样，也可以研究宿主细胞衍生分子对病毒表面的可能贡献。

通过定点突变对逆转录病毒NC蛋白进行分析，可以深入了解该蛋白在病毒生命周期的几个不同阶段中的关键作用(26). NC蛋白介导的基本功能使其成为抗逆转录病毒药物开发的一个有吸引力的靶点，通过p7鉴定能够灭活病毒的化合物数控相互作用为药物开发提供良好线索(51,63). 这些化合物的灭活作用机制也产生了病毒粒子，这些病毒粒子可能可用作候选疫苗，也可能有助于逆转录病毒发病机制的基础研究，这是这一迷人但仍不完全了解的病毒蛋白研究的另一个应用方面。

鸣谢

我们感谢P.Grove协助编写手稿，感谢B.Kane协助电泳。

根据合同NO1-CO-56000，该项目由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金资助。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）