从杆状病毒感染细胞中纯化的病毒编码RNA聚合酶

RNA聚合酶复合物的纯化。

所有程序均在4°C下进行。从两到五个1升的培养物中制备核提取物，并冷冻直到收集到总共25升的感染细胞。用0.1%聚胺P处理汇集的核提取物以沉淀核酸。然后用50%硫酸铵沉淀可溶性蛋白质。通过离心收集硫酸铵沉淀物，将其重新悬浮在含有0.5 M（NH）的25 ml缓冲液A（50 mM Tris[pH7.9]，0.1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇）中₄)₂SO公司₄，并以2 ml/min的速率加载到12-ml苯-脑葡萄糖柱（Pharmacia）上。用50 ml缓冲液a–0.5 M（NH）清洗柱₄)₂SO公司₄用缓冲液A–300 mM KCl–0.5%3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨]-1-丙基磺酸（CHAPS；Pierce）洗脱结合蛋白。收集部分（1.8 ml）并分析转录活性。将活性组分汇集在一起，用缓冲液A–300 mM KCl–0.1%CHAPS透析，并以1 ml/min的速度将其应用于连接到Pharmacia FPLC系统的5 ml肝素（Bio-Rad）柱中，该系统之前使用缓冲液A-300 mM氯化钾–0.1%CHAPS进行平衡。用加载缓冲液清洗柱，并用20-ml线性梯度从300到500 mM KCl洗脱。将峰分数合并，KCl浓度调整为250 mM，将蛋白质应用于之前用缓冲液a–200 mM KCl–0.1%CHAPS平衡的Mono Q HR 5/5柱（Pharmacia）。用10 ml加载缓冲液清洗柱，然后用20 ml线性KCl梯度洗脱200至500 mM。将含有转录活性的部分浓缩至200μl，并通过缓冲液a–2 M KCl–0.1%CHAPS中的Superose 6柱过滤。利用缓冲液A–250 mM KCl–0.1%CHAPS分别透析馏分（0.5 ml），检测转录活性，冷冻在液氮中，并储存在−80°C下。用Bradford法测定粗提物和部分纯化组分的蛋白质浓度(6). 纯化复合物的浓度通过紫外吸收测定，摩尔消光系数为259350，由四个亚基的氨基酸序列预测(1).

体外转录分析。

AcNPV晚期和非常晚期启动子的体外转录检测是通过对先前描述的条件进行轻微修改来进行的(30). 转录反应混合物包含50μg核提取物或10μl柱馏分和以下组分，体积为50μl：25 mM Tris（pH 7.9）、100 mM KCl、2 mM MgCl₂，1 mM二硫苏糖醇，1.0 mM ATP和UTP，20μM GTP，5μCi[α-³²P] GTP（800 Ci/mmol）、5 U RNasin、0.2 U无机焦磷酸酶和1.0μg Polh/CFS和39kL/CFS（在结果中描述）。不需要添加α-amanitin，也没有常规使用。如Xu等人所示(30)，宿主RNA聚合酶不能转录这些测定中使用的杆状病毒模板。同时将组分添加到酶中，反应混合物在30°C下培养12分钟，然后通过添加150μl停止缓冲液（50 mM Tris[pH7.5]，1%十二烷基硫酸钠[SDS]，5 mM EDTA，25μg/ml tRNA）停止反应。用苯酚-氯仿（1:1）提取RNA一次，用乙醇沉淀，重悬于90%甲酰胺中，并在6%聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶上分离。为了定量RNA聚合酶活性，在玻璃纤维过滤器上发现转录反应混合物，并用三氯乙酸沉淀。根据定义，1 U转录活性在30°C下30分钟内将1 pmol GMP并入RNA。先前已经描述了早期病毒启动子体外转录的条件(32).

肽序列测定。

浓缩纯化的RNA聚合酶，装入SDS–8%聚丙烯酰胺凝胶的两个孔中，然后电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用Ponceau S染色，并提交给蛋白质/肽微分析实验室（加利福尼亚理工学院）。样品通过Applied Biosystems 476A测序仪进行自动Edman降解。获得了两个最小蛋白质的N端氨基酸序列。没有获得两个较大蛋白质的有用序列信息。

胰蛋白酶消化后进行质量分析，以鉴定第二大蛋白。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上电泳后，蛋白质在0.1%考马斯蓝水中染色。蛋白质被切除，随后在蛋白质/肽微分析实验室（加利福尼亚理工学院）用胰蛋白酶进行消化和质量分析。在Perseptive Biosystems Elite矩阵辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI TOF）仪器上进行质谱分析。MOWSE程序使用色氨酸肽质量来搜索OWL数据库中所有蛋白质的理论胰蛋白酶消化构建的肽质量数据库(21). 使用的搜索参数是25%的分子量过滤器、0.1%的质量公差和0.2的部分切割分数因子。

LEF-8抗血清的制备。

AcNPV公司左侧-8使用上游引物（5′-AATCGCTC）通过PCR扩增基因CATATG公司ACGGACGTGTCAAG-3′），产生Nde公司I位点（下划线）位于左侧-8编码序列和第二个引物（5′-GTTGCAATCGTGCAAGC-3′），该引物在左侧-8停止密码子。首先将扩增片段克隆到pCRII载体（Invitrogen）中，然后亚克隆到T7表达载体pET15b（Novagen）。所得质粒pET-lef8用于表达LEF-8大肠杆菌BL21（DE3）LysE细胞。通过SDS-PAGE纯化过表达的LEF-8蛋白，并使用标准免疫方案在小鼠中制备多克隆抗血清(17).

将用于免疫印迹分析的样品煮沸3分钟，然后在8%丙烯酰胺凝胶上电泳。使用半干式设备将蛋白质电泳转移到硝化纤维板上。这些薄片与LEF-8抗血清反应，并使用碱性磷酸酶结合的抗小鼠免疫球蛋白G检测免疫复合物。

的引物扩展映射左图-9。

用异硫氰酸胍-氯化铯法从AcNPV感染的细胞中分离总RNA(10). A类左侧-9特异性引物（GTGAGGGTCTAATATGAGG）在5′端进行放射性标记，并与20μg RNA杂交。用禽成髓细胞病病毒逆转录酶扩增退火引物(27). 在6%聚丙烯酰胺-8 M尿素凝胶上分析反应产物。使用pPstI-H DNA生成序列阶梯(14)和相同的寡核苷酸引物。

杆状病毒RNA聚合酶的模板特异性。

用30 ng纯化蛋白和指示的DNA模板进行体外转录反应（图。​（图2）。2). 在缺乏模板（通道2）或存在pCFS的情况下未检测到转录本(30)，亲代无胞苷盒式磁带（通道3）。当AcNPV晚期启动子结构（39kL/CFS）和非常晚期启动子构造（Polh/CFS）分别添加到转录反应中时，两个模板都被准确转录（通道4和5）。RNA聚合酶复合物以基本相同的效率转录超螺旋模板和线性模板（泳道6和7）。

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图2

晚期转录复合体的模板特异性。为了分析晚期和非常晚期模板的转录，使用30 ng纯化RNA聚合酶（RNApol）和指示的模板进行体外转录检测。质粒Polh/CFS和39kL/CFS含有多角体如前所述，与短的无胞苷模板相连的启动子(30). 质粒39kE/CFS包含与早期3.9万发起人。右侧显示了Polh、39kL和39kE对应的转录本。39kE/CFS模板通过使用纯化的RNA聚合酶（通道8和10）或病毒感染早期（通道9和11）制备的提取物进行转录，并在最适合晚期模板（通道8或9）或早期模板（通道10和11）转录的条件下进行分析。φX174 DNA消化Hin公司fI被添加到车道1上，相关碎片的大小（以千为单位）显示在左侧。

纯化后的复合物在39kE/CFS上也没有活性，39kE/CFS是一种包含无胞苷盒的构建物，连接到早期启动子3.9万基因(16). 这个早期启动子是一个典型的RNA聚合酶II启动子，包含一个TATA盒和一个CAGT启动子元件。39kE/CFS由感染AcNPV的昆虫细胞的核提取物转录而成，这些细胞在感染后8小时采集（9号和11号通道）。在RNA聚合酶II模板（6 mM Mg）的最佳条件下，该模板的转录效率更高²⁺和15分钟的预培养），而不是在最适合病毒晚期模板的条件下（2 mM Mg²⁺并且没有预培养）。粗核提取物中通常会出现比预期更长的转录物，可能是由于存在污染的CTP。在标准条件下，对于晚期（第8通道）或早期启动子（第10通道），病毒RNA聚合酶没有转录39kE/CFS。这些数据表明，四亚单位RNA聚合酶包含启动子识别和酶活性所必需的元素。

蛋白质亚基的鉴定。

通过N-末端氨基酸序列鉴定了两个最小的RNA聚合酶亚基。通过SDS–8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的RNA聚合酶亚基，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并提交进行自动Edman降解。最小亚单位的序列为Met-Phe-Val-Thr-Arg-Leu。在SwissProt/GenBank组合蛋白质数据库中，唯一与该序列完美匹配的是AcNPV蛋白，即p47。编码p47的基因最初被鉴定为温度敏感突变的位点ts秒317 (8). 尽管病毒DNA合成正常，但在非许可温度下，该突变株在感染病毒的释放和多面体蛋白的表达方面存在缺陷。这种表型表明，突变破坏了晚期和非常晚期基因转录所需的功能。Todd等人也鉴定了p47(29)作为杆状病毒晚期和非常晚期启动子控制下报告基因瞬时表达所需的18个基因之一。这个第47页该基因预计编码47.5kDa的蛋白质，这与根据SDS-gels计算出的46kDa表观分子量非常一致（图。​（图1）。1). 因此，将p47鉴定为RNA聚合酶亚单位之一与已知的蛋白质生物学一致。

下一小亚基的N末端序列被确定为Met-Phe-Ser-Phe-Leu-Asp。在蛋白质数据库中唯一与该序列完美匹配的是AcNPV LEF-9蛋白。这个lef-9型该基因最初由Lu和Miller绘制(19)作为杆状病毒晚期和非常晚期基因瞬时表达所需的病毒基因筛选的一部分。我们测定的氨基酸序列对应于最初发表的LEF-9 ORF的残基27至32(19). 然而，在该报告中左侧-9该基因未被执行，ORF被假定从最上游的蛋氨酸密码子开始。这种差异表明，要么我们测序的蛋白质受到翻译后处理，要么Lu和Miller发现了错误的起始位点(19).

为了解决哪个蛋氨酸密码子用于启动翻译左侧-9ORF，我们进行了引物延伸分析。将从AcNPV感染细胞纯化的RNA与ORF-9 N末端序列互补的寡核苷酸杂交。我们发现左侧-9转录物映射到上游蛋氨酸密码子和序列分析中确定的残基之间的异质位点（图。​（图3）。三). 转录起始于靠近左侧-9ORF主要在6小时的时间点被检测到，尽管在更早和更晚的时间可以检测到低水平的转录物。近端转录起始于CACT基序，该基序发生在TATA序列下游的26个核苷酸。启动子基序的这种排列与许多杆状病毒早期启动子中发现的类似，其中起始于CAGT基序(4). 单个远端转录起始位点被映射到更上游的12个核苷酸点。围绕该起始位点的序列与一致早期启动子不对应。在感染后6小时检测到该点的转录，并且转录持续到感染后36小时。

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图3

的引物扩展映射左侧-9mRNA。在感染后的指定时间，从AcNPV感染的Sf9细胞中分离出总细胞RNA。通过引物延伸分析，利用AcNPV基因组序列nt49300至49319的互补寡核苷酸绘制转录物的5′端(1). 使用相同的引物生成序列阶梯。序列阶梯相对于左侧-9启动程序如下所示。引物延伸产物用右边的箭头表示，与序列上方的箭头相对应，箭头指示转录起始位点。通过N-末端测序确定的氨基酸残基以大写形式显示；预计位于LEF-9 N末端的26个残基以小写显示。

我们的引物延伸数据有力地证明，LEF-9 ORF以Met-Phe-Ser-Phe-Leu-Asp序列启动，而不是在先前确定的上游位点启动(19). 根据我们的蛋白质序列数据重新计算LEF-9的分子量，预测多肽为56 kDa，比之前公布的59 kDa的值更接近该亚单位的表观分子量。

55-kDa多肽的N末端序列分析未能产生有用的序列信息。因此，蛋白质指纹被用来识别这个亚单位。将含有55-kDa亚基的SDS-聚丙烯酰胺凝胶切片用胰蛋白酶消化，然后用质谱分析洗脱的肽以确定其分子量。将所有胰蛋白酶肽的质量输入MOWSE数据库搜索程序(21)将未知蛋白质的肽指纹与OWL数据库中所有ORF的预测指纹相匹配。数据库搜索返回的最显著匹配是AcNPV LEF-4蛋白。在输入的19种胰蛋白酶肽中，有11种与LEF-4的预测相符，这证实了该蛋白的特性（表​（表2）。2). LEF-4最初由帕萨雷利和米勒绘制(22)作为病毒晚期基因表达所需的一个因子，它随后被鉴定为温度敏感突变的位点，产生与上述p47突变相似的表型(7). LEF-4的预测分子大小为54 kDa，与根据图计算的55 kDa的表观分子大小一致。​图1B。1B。

对最大亚单位进行测序的尝试没有成功。然而，我们能够通过免疫化学分析预测并确认该蛋白的身份。AcNPV在最大亚基的分子量范围内编码相对较少的蛋白质。其中之一，LEF-8包含一个保守的序列基序，这是原核和真核RNA聚合酶所共有的(23). 此外，在瞬时检测中，病毒晚期和非常晚期基因表达需要LEF-8，这与其作为病毒特异性RNA聚合酶组分的拟议作用一致。因此，我们通过Superose 6峰提高了细菌和免疫印迹组分中表达的LEF-8抗血清。如图所示。​图4，4，纯化的RNA聚合酶的大亚基被LEF-8抗血清识别。免疫反应带的强度与转录活性峰值密切相关。因此，我们得出结论，大亚单位由左侧-8.

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图4

用LEF-8抗血清识别大亚单位。（A） 如图图例所示，通过Superose 6过滤Mono Q峰值分数（车道2）。​图1。1.对与560000处蛋白质峰值相对应的蛋白质进行转录活性分析（通道3至8）。的位置多角体和3.9万L成绩单显示在右侧。φX174分子标记如车道1所示。（B） 在SDS–8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳含有转录活性的6个组分，转移到硝化纤维素膜上，并用LEF-8抗血清进行检测。车道1，预处理分子量标记，尺寸（千道尔顿）显示在左侧。免疫反应蛋白的位置如右图所示。

这项研究得到了国家科学基金会MCB 95-06233的资助。利用NIH拨款RR11292购买的设备，在加利福尼亚理工学院进行质谱分析和自动序列分析。