《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 7972–7977.
反式-不同小核糖核酸病毒衣壳蛋白包封脊髓灰质炎病毒应答子
,1 ,1 ,1 ,2和1中，*
西于佳
微生物学和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
马克·范·伊登
微生物学和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
马克·布什
微生物系和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
埃利·埃伦菲尔德
微生物系和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
唐纳德·萨默斯
微生物学和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
微生物学和分子遗传学系1分子生物学和生物化学，2加利福尼亚大学欧文分校，加利福尼亚92697
*通讯作者。现住址：美国马里兰州弗雷德里克市弗雷德里克10室427号楼B号邮政信箱弗雷德里克癌症研究中心NIH NCI，邮编：21702-1124。电话：（301）846-5096。传真：（301）846-1494。电子邮件：vog.frcficn@remmusfd. 1997年12月15日收到；1998年7月1日接受。
摘要
A类反式-建立了小RNA包被实验，研究小RNA包埋的特异性。将荧光素酶基因取代衣壳蛋白编码区的脊髓灰质炎病毒复制子与同源或异源病毒衣壳蛋白在转染HeLa细胞中共表达。成功反式-包被导致病毒的组装和产生，在随后感染HeLa细胞时，病毒的复制伴随着荧光素酶活性的表达。荧光素酶活性的量与反式-共转染产生的包被病毒。当脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白在反式, >2 × 106感染颗粒/ml。当柯萨奇病毒B3、人鼻病毒14、孟病毒或甲型肝炎病毒（HAV）衣壳蛋白在反式，除甲型肝炎病毒外，所有病毒都有复制子的包被。异源衣壳蛋白对复制子RNA的总包被效率显著低于脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白。反式-包被的颗粒可以用针对每个供体病毒衣壳的特异性抗血清完全中和。结果表明，包衣受特定病毒核酸和蛋白质序列的调控。
小核糖核酸病毒科是一个二十面体、阳性、单链RNA病毒家族，包括重要的人类和动物病原体，如脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒（HRV）、甲型肝炎病毒（HAV）和口蹄疫病毒。尽管不同属的小核糖核酸病毒的总体遗传组织相当保守，但不同属的病毒在氨基酸和核酸水平上的序列保守性在很大程度上不同(25). 肠道病毒与鼻病毒的关系比与心脏病毒和口疮病毒的关系更密切。甲型肝炎病毒是迄今为止与小核糖核酸病毒关系最为密切的病毒。在过去几十年中，病毒附着、进入、翻译和复制生物化学的许多方面都已被阐明，但令人惊讶的是，对于病毒RNA包埋到病毒体内的机制知之甚少。
一般认为，RNA序列或结构中存在的特定信号决定了与病毒衣壳蛋白的相互作用，从而导致包衣。最近对逆转录病毒和冠状病毒的研究表明，基因组RNA中的特定病毒RNA片段负责外壳化的特异性。对于冠状病毒小鼠肝炎病毒，基因组RNA中的69-核苷酸（nt）序列对于RNA包被到病毒颗粒中是必要的和足够的(12,35). 虽然每种逆转录病毒的包被信号有些不同，但主要信号通常位于5′端附近，并且是多部分元件(18,21). 对于小核糖核酸病毒，使用缺陷干扰粒子的研究(17,20)和嵌合病毒(16,19,26,28)已经表明，5′非翻译区内启动翻译所需的区域以及整个P1或衣壳区不包含脊髓灰质炎病毒RNA包衣的特定信号。RNA封装对P1编码序列没有任何要求，这使得可以用外源基因替换该区域，并导致复制子的开发，该复制子可以作为基因传递的表达载体(三,27,36).
在共同感染期间，由非缺陷同源病毒提供的病毒衣壳蛋白对缺陷干扰颗粒进行有效包装，证明在反式早期研究表明，脊髓灰质炎病毒和其他肠道病毒衣壳蛋白可以反式-当细胞被两种不同的病毒共同感染时，相互封装RNA(15,33). 研究还表明，从重组痘苗病毒中表达的脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白可以在反式(4).
在本研究中，我们利用重组复制子来测量反式-其他小RNA病毒衣壳蛋白对脊髓灰质炎病毒RNA的包被。结果表明，虽然衣壳蛋白确实能识别RNA，但识别效率不同。这些数据支持存在特定的封装信号，这些信号决定了高效病毒粒子组装所需的RNA-蛋白相互作用。
材料和方法
质粒构建物。
所使用的所有质粒构建体都在T7启动子控制下。质粒pT7-PV1是之前描述过的1型脊髓灰质炎病毒的感染性cDNA克隆(13). 质粒pRLuc31(2)和pMonoLuc5由旧金山加利福尼亚大学的R.Andino慷慨提供。pRLuc31质粒有一个荧光素酶报告基因，几乎取代了脊髓灰质炎病毒1型cDNA的整个P1衣壳区。该结构的RNA转录物具有复制能力，转染后产生荧光素酶信号。质粒pMonoLuc5包含一个完整的脊髓灰质炎病毒cDNA，其荧光素酶基因插入脊髓灰炎病毒多蛋白编码序列的上游框架中。该结构设计为在荧光素酶和VP0之间创建一个工程化的3C蛋白酶切割位点，在3C切割后生成一个天然的VP0 N末端。这种结构产生所有脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白并具有复制能力，但由于RNA的长度增加，RNA没有被包装成感染性病毒颗粒。质粒pMonoLuc5是通过删除Hin公司脊髓灰质炎病毒基因组nt6054和6516之间的dIII片段。这种缺失产生了一个只有23个氨基酸的截短病毒3D蛋白，然后发生移码，产生了4个额外的氨基酸和一个TGA终止密码子。所有脊髓灰质炎病毒cDNA结构如图所示。质粒pT7-HRV14包含完整的HRV14 cDNA，转染后该结构的T7转录物具有感染性(31). 构建pCBV3-0是感染性柯萨奇病毒B3 cDNA克隆(9). 质粒pMC16含有孟病毒cDNA，其转录物在转染后也具有感染性(11). 质粒pT7/HAV1是一个感染性甲型肝炎病毒的cDNA克隆，如前所述(14).
本研究中使用的脊髓灰质炎病毒cDNA结构的示意图。pT7-PV1编码完整的脊髓灰质炎病毒基因组，pRLuc31编码一个脊髓灰质病毒复制子，其中荧光素酶基因取代病毒衣壳编码序列，pMonoLuc5d包含完整的脊柱炎病毒cDNA，荧光素酶基因插入衣壳编码顺序的上游，pMonoLuc5d在P3编码区包含从nt 6054到6516的大量帧外删除。
痘苗病毒和转染。
表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒v-TF7-3由美国国立卫生研究院的B.Moss提供。一步感染/质粒转染程序之前已经描述过(29). 简单地说，将含有10μl脂蛋白（Bethesda Research Laboratories）、v-TF7-3（5 PFU/cell）和上述各种质粒（2μg）的0.5 ml Dulbecco最小必需培养基（DMEM）添加到HeLa细胞单层中，在六孔板中以50%至75%的汇合度进行。除非特别指明，否则细胞在CO中培养2在37°C培养箱中培养6 h。转染结束时，用DMEM清洗细胞两次，并向每个孔中添加1 ml含有10%小牛血清的DMEM。细胞在37°C下进一步培养36小时。
反式-包埋和荧光素酶测定。
反式-通过使用上述和图中概述的转染程序，将HeLa细胞与pRLuc31和第二个提供衣壳蛋白的质粒共转染，来检测包裹作用。转染后，收集上清液并用等量的氯仿提取，然后在37°C下进行RNase（15μg/ml）和DNase（20 U/ml）处理20分钟。处理过的上清液用于感染12孔板中新鲜培养的HeLa细胞反式-在37°C下8小时后，通过荧光素酶活性测定对包被病毒进行评分（图。). 对于荧光素酶分析，去除培养基，并通过添加150μl裂解缓冲液（Promega）直接在平板上裂解细胞。使用荧光素酶检测试剂盒（Promega），使用10微升细胞裂解液在Monolight 2010光度计（分析实验室）中检测荧光素瘤酶活性。荧光素酶活性表示为相对荧光素单位（RLU）。所有实验均进行了两次。
反式-包埋试验。在表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒v-TF7-3存在下，用pRLuc31和衣壳供体质粒共同转染HeLa细胞单层。从转染中回收的子代病毒为标记的第1代（Pass 1）病毒；用第1代病毒感染HeLa细胞后回收的子代病毒被标记为第2代（Pass 2）病毒。
抗血清。
高级人类抗脊髓灰质炎病毒血清来自作者之一（E.E.）。因为很难获得阴性的人类抗脊髓灰质炎病毒血清，所以使用正常的黑猩猩血清作为阴性对照。豚鼠抗HRV14抗体购自弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收藏中心。正常豚鼠血清由加利福尼亚大学欧文分校A.Tenner提供；马抗萨克斯病毒B3由内布拉斯加州大学S.Tracy提供；小鼠抗脑膜病毒是一种来自受脑膜病毒感染的BALB/c小鼠的恢复期血清，由S.Nguyen，Zymo Research，Inc.善意提供。
病毒滴度。
如前所述进行菌斑分析(30). 对于含荧光素酶的颗粒，通过用转染细胞上清液稀释液感染六孔板盖玻片上的融合细胞来测定滴度。6小时后，在−20°C下用丙酮-甲醇（1:1）固定细胞10分钟。制备盖玻片，用兔抗2C血清进行免疫荧光分析(30). 用显微镜在10个随机场中测量荧光细胞的百分比。
结果
反式-脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白包裹脊髓灰质炎病毒复制子。
设计了一种检测反式-脊髓灰质炎病毒复制子RNA的包被（pRLuc31的转录物[图。])包含荧光素酶编码序列代替衣壳蛋白基因。HeLa细胞单层与复制子构建物和第二个质粒共同转染，以提供衣壳蛋白的来源。重组痘苗病毒v-TF7-3提供了转录两种质粒的T7 RNA聚合酶的来源。如果第二个质粒表达衣壳蛋白导致复制子RNA包被（图。)然后产生含有荧光素酶基因的病毒颗粒。这些颗粒（第1代病毒）可以在HeLa细胞的后续感染中检测到，因为复制将伴随荧光素酶活性和第2代病毒的产生。这个反式-封装分析概述如图所示。.
图A显示pRLuc 31 RNA是反式-由脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白包被反式通过pT7-PV1，即含有感染性脊髓灰质炎病毒cDNA的质粒，或通过pMonoLuc5，即含有完整脊髓灰质病毒cDNA且荧光素酶基因插入脊髓灰炎病毒编码序列上游的质粒（图。). 后者产生的RNA具有复制能力，但不能封装，因为插入的荧光素酶基因使RNA延长了23%以上，这使得该RNA太长，无法封装(1). 用核酸酶处理的转染细胞上清液接种HeLa细胞8小时后，观察到强烈的荧光素酶信号，这表明高效生产反式-在最初的双转染过程中包裹病毒颗粒。尽管仅用pMonoLuc5或pRLuc31转染在转染细胞裂解物中产生大量荧光素酶活性（数据未显示），但它们不会产生感染性子代病毒，正如第1代病毒感染期间没有荧光素蛋白酶活性所示。菌斑试验表明，单独或与pRLuc31一起转染pT7-PV1的细胞产生高滴度的脊髓灰质炎病毒（108到109PFU/ml[见下文]），而用pMonoLuc5转染后未检测到病毒。
反式-用不同来源的脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白包埋脊髓灰质病毒复制子pRLuc31 RNA。（A） 荧光素酶活性来自反式-用不同衣壳供体包埋脊髓灰质炎病毒复制子。质粒pRLuc31与三个指定的脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白供体或对照质粒pUC19共转染。使用子代病毒（第1代【第1代】）感染HeLa细胞，并在感染后8 h测量荧光素酶的产生。（B） 第二代（Pass 2）病毒的荧光素酶活性。从A组所示实验中回收的病毒用于感染新鲜HeLa细胞培养物，8小时后监测荧光素酶活性。
与pT7-PV1和pRLuc31共转染产生天然和反式-包被病毒。这种第1代病毒的混合物能够感染HeLa细胞并产生第二代子代颗粒，该子代颗粒仍然含有天然病毒和包被的pRLuc31复制子，在随后的传代中通过产生荧光素酶活性再次检测到该复制子（图。B） ●●●●。这种病毒混合物的持续传代导致荧光素酶活性在每次传代中逐渐降低（未显示）。然而，与pRLuc31和pMonoLuc5的初始共转染只产生含有pRLuc31RNA的病毒颗粒；因此，这些颗粒只能感染细胞一代（图。B） ●●●●。
pT7-PV1和pMonoLuc5都捐献了RNA表达的衣壳蛋白，这些RNA在共转染事件后复制。为了确定在未经病毒RNA复制的质粒构建物的T7 RNA聚合酶转录物直接转染细胞中表达的脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白是否可以介导反式-将脊髓灰质炎病毒复制子包被后，将缺失引入pMonoLuc5中，这样只产生了一个截断的3D序列，供体RNA不再能够复制（pMonoLuc5d[图。]). 该构建体被用作衣壳蛋白供体反式-包埋试验。图结果表明，用pMonoLuc5d非复制转录物表达的衣壳蛋白包裹脊髓灰质炎病毒复制子RNA，其效率与复制衣壳供体RNA的效率相似。
反式-来自非复制构建体pMonoLuc5d的衣壳蛋白对脊髓灰质炎病毒复制子的包被。反式-如文中所述进行包壳，并在用第1代病毒感染8小时后监测荧光素酶活性（RLU）。
相反，构建的pRLuc31包含2C基因中的位点特异性致命突变，其中131位的Pro残基被Asn密码子取代(30)，使我们能够证明复制子的复制是其反式-扎营。在以pT7-PV1或pMonoLuc5作为衣壳蛋白来源的情况下，T7 RNA聚合酶在转染细胞中产生的pRLuc31/2Cpro转录物未产生感染性颗粒（数据未显示）。因此，封装过程似乎与RNA复制相耦合，而不是病毒RNA与同一细胞中的衣壳蛋白组装的结果。
为了评估这种基于转染的封装系统的相对效率，反式-根据第1代病毒系列稀释液诱导的荧光素酶活性测定的组织培养感染剂量，估算病毒包被滴度。复制动力学反式-包被病毒首先通过使用荧光素酶活性作为病毒复制的标记物来确定（图。). 荧光素酶活性的积累速率与已发表的脊髓灰质炎病毒复制动力学相似。荧光素酶活性在感染后5小时左右达到峰值，10小时后随着时间的推移逐渐下降。测试了它们生产衣壳蛋白的能力反式-脊髓灰质炎病毒核糖核酸酶复制子的包被。每一种都用于共转染试验，并用HeLa细胞单层培养第1代子代病毒的系列稀释液。根据图所示的动力学分析。，8小时后收获培养物进行萤光素酶测定。图表明在反式-在感染后8h观察到包埋病毒和诱导的荧光素酶活性。质粒pT7-PV1在产生反式-包裹的病毒颗粒。这种差异的原因尚不清楚。这个反式-此外，还使用来自上述实验的包被病毒通过抗脊髓灰质炎病毒2C蛋白抗体的免疫荧光检测其感染性。由于包被病毒只能引发一个感染周期，因此受感染的细胞数应反映病毒的感染滴度。图中pMonoLuc5包被的病毒的传染性。为2.1×106/ml基于免疫荧光。
感染后荧光素酶表达动力学反式-包被病毒。反式-如文中所述，对脊髓灰质炎病毒复制子pRLuc31和第1代病毒进行包衣反式-由pMonoLuc5表达的衣壳蛋白包壳的方法用于感染HeLa细胞。在指定的时间采集样本进行荧光素酶分析，结果以RLU表示。
估计的传染性反式-包被病毒。使用来自含有第1代病毒的转染细胞的上清液在DMEM中制备10倍系列稀释液，并使用0.1ml感染24孔板中的HeLa细胞单层。感染后8 h测定荧光素酶活性。
反式-其他小RNA病毒衣壳蛋白对脊髓灰质炎病毒复制子的包被。
定量评估的能力反式-驻扎效率使我们能够调查反式-其他小RNA病毒外壳蛋白对脊髓灰质炎病毒复制子的包被。使用的小RNA病毒cDNA为：柯萨奇病毒B3 cDNA（pCVB3-0）、HRV14 cDNA（pT7-HRV14）、孟病毒cDNA（p MC16）和细胞培养适应的人类HAV HM175 cDNA。将病毒cDNA构建物与上述脊髓灰质炎病毒复制子pRLuc31共转染，并检测假定的第1代子代病毒在随后感染时诱导荧光素酶活性的能力。图表明除甲型肝炎病毒衣壳蛋白外，所有小RNA病毒衣壳蛋白质都能反式-封装脊髓灰质炎病毒复制子RNA。
反式-不同供体小RNA病毒外壳蛋白对脊髓灰质炎病毒复制子的包被。用编码不同小RNA病毒衣壳蛋白的质粒cDNA构建物共同转染HeLa细胞反式-用荧光素酶活性监测HeLa细胞感染子代病毒后的包被情况。
反式-同源脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白对脊髓灰质病毒RNA的包被效率最高。其他小核糖核酸病毒衣壳蛋白在封装脊髓灰质炎病毒复制子RNA方面的效率显著较低；另一种肠道病毒（柯萨奇病毒B3）和HRV14衣壳蛋白包装的病毒大约少1到2个对数单位，而一种心脏病毒（孟氏病毒）衣壳的效率甚至更低。不反式-用HAV蛋白检测包衣。表显示了对反式-在三个不同的实验中，由不同的病毒衣壳供体产生的包被病毒。此外，该表显示了首次共感染事件后恢复的每种感染性小RNA病毒的数量。所有的病毒cDNA都在大约一个对数单位的范围内产生相对高滴度的病毒，这表明转染细胞中有足够的衣壳蛋白用于反式-将要发生的露营。与其他小RNA病毒cDNA相比，甲型肝炎病毒cDNA没有检测到反式-扎营。此外，即使长时间孵育超过72小时，也没有从转染中恢复到感染性甲型肝炎病毒，将痘苗病毒浓度从0.1到10 PFU/细胞变化对感染性甲肝病毒的产生没有影响。
表1
的相对效率反式-不同病毒衣壳对脊髓灰质炎病毒复制子的包被作用
| 用于反式-安营扎寨一 | 转染后恢复的病毒（PFU/ml[expt 1b条]) | 的相对效率反式-扎营（%）c（c）
|
|---|
| 实验1 | 出口2 | 出口3 |
|---|
| 脊髓灰质炎病毒 | 4 × 108 | 100 | 100 | 100 |
| 柯萨奇病毒B3 | 2 × 108 | 6.1 | 3.7 | 未注明日期。 |
| 人力资源V14d日 | 1 × 107 | 0.23 | 未注明日期。 | 1.2 |
| Mengovirus病毒 | 7 × 107 | 0.06 | 未注明日期。 | 0.6 |
| 暖通空调 | 阴性 | 阴性 | 未注明日期。 | 未注明日期。 |
没有检测到的原因反式-甲型肝炎病毒衣壳蛋白对脊髓灰质炎病毒复制子RNA的包被尚不完全清楚。转染HeLa细胞的Western blot分析表明，尽管产生了病毒衣壳蛋白，并且VP1相关衣壳蛋白PX（VP1-2A）的量与高效感染HAV的FRhK4细胞裂解物中发现的量相当(16)，几乎没有检测到正确大小的VP1（图。). 其他实验表明，HAV感染的FRhK4细胞中成熟VP1的形成是一个相对缓慢的过程（未显示）。VP1前体的加工可能需要一个未定义的多步骤蛋白水解过程来形成成熟的VP1。转染HeLa细胞中含有HAV VP1序列的主要产物是PX和一种次要的中间大小蛋白质（表示为前VP1[图。])它可能是从PX到成熟VP1的中间加工产品。
HAV cDNA转染后的HAV VP1免疫印迹分析。通道1，表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒存在下pT7-HAV1转染HeLa细胞；通道2，FRhK4细胞感染甲型肝炎病毒3周；通道3，HeLa细胞转染pUC19质粒作为阴性对照。在每个凝胶通道中装载80微克的总蛋白质。左边的数字是标记蛋白质的分子量（单位为千道尔顿）。
属间特异性的确认反式-用特异性抗血清中和第1代病毒的荧光素酶诱导能力，获得包被病毒。在感染HeLa细胞之前，将来自转染细胞的上清液与相应的特异性抗血清或对照血清一起孵育。8小时后采集培养物进行荧光素酶分析。图结果表明，与只针对特定衣壳蛋白供体的血清孵育后，荧光素酶活性消失；在随后的感染过程中，无论是抗脊髓灰质炎病毒血清还是正常宿主血清都没有导致荧光素酶活性（病毒复制的标志物）的诱导显著降低。
血清中和反式-包被病毒。转染产生的病毒和反式-在接种HeLa细胞单层之前，用相应的特异抗血清或对照血清在37°C的DMEM中稀释1:200培养20分钟，与不同的小核糖核酸病毒衣壳供体进行包被。每个反式-包被病毒还针对脊髓灰质炎病毒特异性抗血清进行了测试。因为每个人都使用不同的抗血清反式-封装病毒，值仅在单个病毒集内可比较，而在不同病毒集之间不可比较。PV、脊髓灰质炎病毒；CBV3，柯萨奇病毒B3；G.猪、豚鼠；MV、mengovirus；NC，阴性对照，使用未感染的HeLa细胞裂解物。
讨论
我们已经建立了一个简单的转染基础反式-封装系统分析小核糖核酸病毒的封装。通过分析细胞感染转染细胞上清液后的荧光素酶信号，可以很容易地确定不同小RNA病毒衣壳蛋白包埋含有荧光素酶基因的脊髓灰质炎病毒复制子的能力。该测定被证明是定量的，荧光素酶活性和反式-广泛产生的包被病毒。来自不同属小核糖核酸病毒的衣壳蛋白显示出不同的效率反式-扎营。另一种肠道病毒柯萨奇病毒B3在反式-脊髓灰质炎病毒复制子的封装。鼻病毒和心脏病毒衣壳蛋白也能包埋脊髓灰质炎病毒复制子，尽管其效率远低于同源脊髓灰质病毒衣壳。人类甲型肝炎病毒衣壳蛋白反式未发现脊髓灰质炎病毒复制子的包被。
尽管HAV在这些测试中使用的HeLa细胞培养物中没有复制，但全长RNA被翻译成衣壳蛋白（图。). 然而，在HeLa细胞培养中，含有VP1的前体处理可能不完整或不正确。目前尚不清楚这是否是HeLa细胞不能产生感染性病毒的原因。病毒RNA在这些细胞中的复制尚未被检测。
Holland和Cords的早期研究表明，HeLa细胞与脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒B1共同感染可产生“杂交”病毒(15). 最近，研究表明脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白在反式通过重组痘苗病毒可以将表达异源蛋白的脊髓灰质炎病毒复制子包裹起来(27). 我们的数据表明，直接转染后扩增的RNA翻译提供的脊髓灰质炎病毒衣壳也可以有效地反式-包裹脊髓灰质炎病毒复制子。这些结果表明，脊髓灰质炎病毒复制复合物的分区并没有限制不同细胞分区表达的衣壳蛋白用于病毒颗粒组装。不同的小核糖核酸病毒衣壳蛋白反式对脊髓灰质炎病毒复制子进行封装的能力差异很大。在转染步骤中，不同感染结构（除甲型肝炎病毒外）产生的高滴度天然病毒表明，细胞内产生了足够的衣壳蛋白。因此，其他小核糖核酸病毒衣壳包裹脊髓灰质炎病毒复制子的能力降低是由于脊髓灰质炎病毒包裹信号和其他小核糖核酸病毒的外壳蛋白之间的不相容性。这表明，包被是由脊髓灰质炎病毒RNA或核衣壳复合体与外壳蛋白之间的某些特定识别决定的。这种识别可以通过RNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用介导。除Vpg外，一些蛋白质已被证明与病毒RNA形成复合物(2,8,23)，一些病毒非结构蛋白被提议包被在病毒颗粒中(24). 这些蛋白质可能在RNA包被过程中发挥作用。
用一个非复制病毒RNA作为复制子RNA的衣壳供体，这里描述的共转染过程产生了超过10个6 反式-包埋感染单位/ml。用于监测颗粒产生的荧光素酶分析的高灵敏度将使我们能够分析受到特定突变的RNA和/或衣壳蛋白的包埋。通过这种方式，可以定义RNA蛋白识别中涉及的特定信号。
所有病毒都需要将其核酸与衣壳蛋白组装成子代病毒。来自其他病毒的研究表明，包埋过程是一个高度特异和受调控的事件。包装病毒遗传物质的策略有很多种。在某些噬菌体的情况下(7,22)和细小病毒(10)，含有特定序列的病毒DNA被穿入空粒子。对于烟草花叶病毒，包被是通过衣壳蛋白的聚集体与特定的RNA来源结合而开始的(32). 类似的途径可能被芜菁皱纹病毒使用(34). 对于小核糖核酸病毒，还没有确定病毒包被所必需的特定序列元件。观察到RNA复制和包被之间的耦合(5,6)强烈提示小RNA病毒包装可能与RNA复制过程有机械联系。
在这份手稿提交后，Porter等人报告了一项类似的研究，从中得出结论，其他肠道病毒衣壳蛋白无法反式-封装脊髓灰质炎病毒复制子(第27页). 在他们的实验中，衣壳是通过与异源病毒（牛肠道病毒、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3和肠道病毒70）共同感染而非与我们研究中使用的病毒cDNA转染来捐赠的。显然，这两种复制周期中衣壳蛋白生成的动力学和可能的分区差异是导致结果不一致的原因。
致谢
我们感谢S.Tracy、B.Semler和A.Palmenberg提供质粒和抗血清。
这项工作得到了美国国立卫生研究院AI 26350和AI 17386拨款的支持。
参考文献
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